Cistanche Deserticola glükosiidide östrogeenne aktiivsus östrogeeniretseptorite adjuvandina in vitro

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Hui Song, Wen-Lan Li, Xiang-Ming Sun, Yang Hu, Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang

SISSEJUHATUS

Cistanche deserticola(hiina keeles "Rou Cong Rong"), traditsiooniline Hiina ravimtaim, mis esmakordselt registreeriti ShenNongBenCaoJingis, on kasutatud neerupuudulikkuse, impotentsuse, seniilse kõhukinnisuse ja verepuuduse raviks tuhandeid aastaid.[1] See on levinud peamiselt Loode-Hiina kõrbepiirkondades, nagu Gansu ja Xinjiang.[2] Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud näitasid, et C. deserticola võib edendada laiaulatuslikke meditsiinilisi funktsioone, nagu hormoonide reguleerimine, immunomoduleeriv, antioksüdatiivne, neuroprotektiivne, põletikuvastane ja östrogeenne toime.[3,4] Tsistanchide glükosiide (GC) peeti üheks peamised aktiivsed komponendid erinevate bioloogiliste mõjudega.[5,6]

Östrogeeniretseptorid (ERs-) ja ER on ER-de alatüübid, mis võivad reguleerida füsioloogilisi funktsioone.[7] Need valgud võivad reguleerida sihtgeenide transkriptsiooni, seondudes seotud DNA regulatoorsete järjestustega raku tuumas. Mõlemad alatüübid väljenduvad märkimisväärselt kardiovaskulaarses ja kesknärvisüsteemis.[8,9] ER esineb peamiselt piimanäärmes, emakas, munasarjas, luus, meeste suguelundis ja eesnäärmes. ER esineb peamiselt eesnäärmes, munasarjas ja põies.[10,11] Lisaks on neil kahel alatüübil mõned ühised füsioloogilised rollid, näiteks munasarjade arengus ja funktsioonis ning kardiovaskulaarsüsteemi kaitsmises. [12,13] Varasemad uuringud meie rühmas näitasid metaboolse analüüsi meetodi abil GC-de östrogeenset mehhanismi.[14] Pidevas uuringus analüüsisime GC-de östrogeense aktiivsuse mehhanismi ER-idega seotud MCF-7 rakuliinidel.

MATERJALID JA MEETODID

Instrumendid

ECO-170P-230 inkubaator pärines firmalt New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., Bio-Rad 680 mikroplaadilugeja ja elektroforeesiaparaat firmalt Bio-Rad Laboratories, Inc., mikroskoop CX21 pärines firmalt Olympus Co., Ltd. , GIS-2019 geelkujutise süsteem pärines ettevõttelt Tanon Science and Technology Co., Ltd., lame põhiplaat pärineb ettevõttelt Corning Inc., EPICS-XL voolutsütomeetria pärines firmalt Beckman-Coulter Inc. ja StepOnePlus Real-Time polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) süsteem pärines firmast Thermo Fisher Scientific.

Kemikaalid ja reaktiivid

GC-d valmistati meie laboris eelnevalt kirjeldatud meetodil [14] ja ultraviolettspektrofotomeetria abil määrati GC-de puhtus 52 protsenti (GC-de määramiseks kasutati markerina akteosiidi). Östradiool (E2) osteti ettevõttelt Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Hiina). Veise looteseerum (FBS) ja RPMI-1640 pärinesid firmalt Gibco Co., Ltd., 96 süvendiga lamedapõhjaline plaat firmalt Corning Inc. ning dimetüülsulfoksiid (DMSO) ja 3-[4,5-dimetüül-2-tiasolüül ]-2,5-difenüültetrasooliumbromiid (MTT) osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich Corporation. TRIzol reaktiiv, pöördtranskriptsiooni (RT) komplekt ja TB Green™ RT-PCR komplekt osteti ettevõttelt TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Hiina. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb ja -aktiini antikehad osteti ettevõttelt Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Kõik muud levinud kemikaalid osteti tavalistelt kaubanduslikelt tarnijatelt.

Proovi ettevalmistamine

Cistanchesi põhilahuse glükosiidide valmistamine

GCs ekstrakt lahustati DMSO-s, et saada põhilahus kontsentratsiooniga 0,1051 g/ml ja seda säilitati 4 kraadi juures. Fenoolpunasevaba RPMI-1640 kasutati põhilahuse lahjendamiseks erinevate kontsentratsioonideni enne kasutamist.

Östradiooli põhilahuse valmistamine

E2 ekstrakt lahustati DMSO-s, et saada põhilahus kontsentratsiooniga 0,27 mg/ml ja seda säilitati 4 kraadi juures. Fenoolpunasevaba RPMI-1640 kasutati põhilahuse lahjendamiseks erinevate kontsentratsioonideni enne kasutamist.

Söedekstraaniga töödeldud veise loote seerumi valmistamine

Sajad milliliitrid FBS-i segati 250 mg aktiivsöepulbri ja 25 mg dekstraaniga. Pärast 45-minutilist inkubeerimist 55 kraadi juures tsentrifuugiti segu 4 kraadi juures 1000 p/min 15 minutit. Supernatant filtreeriti, kasutades Millipore Express PES membraani, et saada puusöe dekstraaniga töödeldud (CDT)-FBS ja seda hoiti temperatuuril -20 kraadi.

Rakukultuur

Inimese rinnavähi MCF-7 rakuliinid saadi Ameerika tüüpi kultuuride kollektsioonist (ATCC). Lisaks kultiveeriti rakke RPMI-1640 söötmega, mis sisaldas 10 protsenti FBS-i ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini, 37 kraadi juures niisutatud 5 protsenti CO2 atmosfääris. Rakke kultiveeriti 4 päeva enne MTT testi fenoolpunasevabas RPMI-1640 söötmes, mis sisaldas 5% CDT-FBS, nii et östrogeen rakkudes peaks olema puhastatud.

Östradiooli rakkude proliferatsiooni analüüs MCF{0}} rakuliinidel

Rakkude proliferatsiooni mõõdeti MTT-testiga MCF-7 rakkude jaoks.[15,16] E2 lahustati RPMI-1640 söötmes, mis sisaldas 0,1 protsenti DMSO-d lõppkontsentratsioonil {{27 }}.1, 1, 10, 100 ja 1000 nM. MCF-7 rakuliine kultiveeriti 4 päeva fenoolpunasevabas RPMI-1640 söötmes. Pärast kolmekordset pesemist fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) lisati 96 süvendiga plaatidele 100 µL FBS-vaba RPMI-1640 söödet 1,5 × 104 süvendi kohta ja inkubeeriti 37 kraadi juures 24 tundi. Seejärel töödeldi rakke 72 tundi erinevate kontsentratsioonidega E2 lahusega. Seejärel lisati igasse süvendisse 100 µl MTT lahust (0,5 mg/ml). Rakke inkubeeriti 4 tundi. Lõpuks lisati formasaani kristallide lahustamiseks 150 ui DMSO-d. Neeldumist mõõdeti 570 nm juures mikroplaadilugejaga ja arvutati proliferatsioonikiirus (PR).

Cistanchesi glükosiidide rakuproliferatsiooni analüüs MCF{0}} rakuliinidel

Rakkude proliferatsiooni mõõdeti MCF-7 rakkude MTT testiga. GC-d lahustati RPMI-1640 söötmes, mis sisaldas 0,1 protsenti DMSO-d lõppkontsentratsioonidel 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 ja 175 µg /ml. MCF-7 rakuliine kultiveeriti 4 päeva fenoolpunasevabas RPMI-1640 söötmes, mis sisaldas 5 protsenti CDT-FBS-i. Pärast kolm korda PBS-ga pesemist lisati 100 µL FBS-vaba RPMI-1640 söödet 96-süvendilistele plaatidele 1,5 × 104 süvendi kohta ja inkubeeriti 37 kraadi juures 24 tundi. Seejärel töödeldi rakke erineva kontsentratsiooniga GC lahusega vastavalt 24, 48 ja 72 tundi. Seejärel lisati igasse süvendisse 100 µl MTT lahust (0,5 mg/ml). Rakke inkubeeriti 4 tundi. Lõpuks lisati formasaani kristallide lahustamiseks 150 ui DMSO-d. Neeldumist mõõdeti mikroplaadilugejaga lainepikkusel 570 nm ja PR arvutati. Fenoolpunasevaba RPMI-1640 ja E2 sisaldav sööde (2,725 × 10–3 µg/ml) olid vastavalt negatiivne ja positiivne rühm.

Cistanches'i glükosiidide rakuproliferatsiooni analüüs fulvestrandiga MCF{0}} rakuliinidel

Rakkude proliferatsiooni mõõdeti MCF-7 rakkude MTT testiga. GC-d lahustati RPMI-1640 söötmes, mis sisaldas 0,1 protsenti DMSO-d lõppkontsentratsioonides 1,75, 17,5 ja 175 µg/ml. MCF-7 rakuliine kultiveeriti 4 päeva fenoolpunasevabas RPMI-1640 söötmes, mis sisaldas 5 protsenti CDT-FBS-i. Pärast kolm korda PBS-ga pesemist lisati 100 µL FBS-vaba RPMI-1640 söödet 96-süvendilistele plaatidele 1,5 × 104 süvendi kohta ja inkubeeriti 37 kraadi juures 24 tundi. Seejärel töödeldi rakke erineva kontsentratsiooniga GC lahusega ja inkubeeriti fulvestrandiga (6, 06 × 10–5 µg / ml) 48 tundi. Seejärel lisati igasse süvendisse 100 µl MTT lahust (0,5 mg/ml). Rakke inkubeeriti 4 tundi. Lõpuks lisati formasaani kristallide lahustamiseks 150 ui DMSO-d. Neeldumist mõõdeti mikroplaadilugejaga lainepikkusel 570 nm ja PR arvutati. Fenoolpunasevaba RPMI-1640 ja E2 sisaldav sööde (2,725 × 10–3 µg/ml) olid vastavalt negatiivne ja positiivne rühm.

Rakutsükli analüüs

GC-d lahustati RPMI-1640 söötmes, mis sisaldas 0,1 protsenti DMSO-d lõppkontsentratsioonides 1,75, 17,5 ja 175 µg/ml. MCF-7-rakuliine kultiveeriti 4 päeva fenoolpunasevabas RPMI-1640 söötmes, mis sisaldas 5% CDT-FBS-i. Pärast kolm korda PBS-ga pesemist lisati 6 süvendiga plaatidele 1 ml FBS-vaba RPMI-1640 söödet 2,5 × 105 süvendi kohta ja inkubeeriti 37 kraadi juures 24 tundi. Seejärel töödeldi rakke erineva kontsentratsiooniga GC lahusega ja inkubeeriti fulvestrandiga (6, 06 × 10–5 µg / ml) 48 tundi. Seejärel rakud koguti ja pesti kolm korda PBS-ga, tsentrifuugiti 4 kraadi juures 1000 p/min 10 minutit ja fikseeriti 70% etanooliga temperatuuril -20 °C üleöö. Pärast kahekordset PBS-iga pesemist värviti rakud PI lahusega (50 mg/ml), mis sisaldas 1 mg/ml RNaasi A ja 0,1 protsenti Triton X-100, 30 minutit pimedas 4 kraadi juures. Rakutsükkel tuvastati voolutsütomeetria abil ja proliferatsiooniindeks (PI) arvutati järgmiselt. Fenoolpunasevaba RPMI-1640 ja E2 sisaldav sööde (2,725 × 10–3 µg/ml) olid vastavalt negatiivne ja positiivne rühm. PI=(S pluss G2 M)/(G0 /G1 pluss S pluss G2 M) × 100 protsenti

RNA eraldamine ja reaalajas kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsiooni analüüs

MRNA taseme mõõtmiseks kasutati RT-kvantitatiivset PCR-i (qPCR) analüüsi. Kogu raku RNA ekstraheeriti TRIzol reagendiga. qPCR jaoks pöördtranskribeeriti RNA cDNA-ks 4 µg kogu RNA-st, kasutades RT komplekti. RT-PCR analüüsid viidi läbi, kasutades TB Green™ RT-PCR komplekti. Kõik protokollid viidi läbi vastavalt tootja juhistele. ER-i amplifitseerimiseks kasutatud praimeripaar oli 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (edasi) ja 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (tagurpidi); ER-i amplifitseerimiseks kasutatud praimeripaar oli 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (edasi) ja 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (tagurpidi). ER ja ER PCR tingimused olid 94 kraadi 3 minuti jooksul, millele järgnesid vastavalt 37 ja 40 tsüklit 94 kraadi 30 sekundi jooksul, 58 kraadi 2 minuti jooksul ja 72 kraadi 2 minuti jooksul. GAPDH amplifitseerimiseks kasutatud praimeripaar oli 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (edasi) ja 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (tagurpidi). GAPDH PCR tingimused olid 94 kraadi 3 minutit, millele järgnes 30 tsüklit 94 kraadi 30 sekundit, 58 kraadi 2 minutit ja 72 kraadi 2 minutit. Iga kord korrati RT-qPCR katset rohkem kui kaks korda. Selleks kasutati sisekontrollina GAPDH-d. Arvutati transfektantide ER/ER suhteline geeniekspressioon kontrollrakkude suhtes: 2−(∆∆Ct).

Western blotting

ER- ja ER-valkude ekspressioon tuvastati Western blot analüüsiga kui teatatud meetodit väikeste muudatustega. Lühidalt, MCF-7 rakke kasvatati 6-süvendilistel plaatidel tihedusega 2,5 × 105 rakku süvendi kohta ja neid töödeldi GC-dega lõppkontsentratsiooniga 1,75, 17,5 ja 175 µg/ml vastavalt 48 tundi. Pärast inkubeerimist valmistati täisrakuekstraktid, kasutades RIPA puhvrit, mis sisaldas 1 mM PMSF-i. Tervete rakuekstraktides olevad valgud eraldati 12-protsendilise naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga ja kanti seejärel polüvinülideendifluoriidmembraanidele. Membraan blokeeriti TBST puhvris lahustatud 5% (mass/maht) kooritud piimaga ja inkubeeriti kordamööda primaarsete ja sekundaarsete antikehadega. Täheldati seotud antikehi.

Statistiline analüüs

Tulemused väljendati keskmiste ja standardhälvetena ning statistiline olulisus määrati Studenti t-testi abil SPSS 21.{1}} tarkvaraga (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was="" considered="" statistically="">

TULEMUSED

Pärast 24-tunnist E2-ravi paranes MCF-7 rakkude proliferatsioon ilmselgelt [joonis 1a]. 10 nM E2 lahust võib ilmselt stimuleerida rakkude kasvu (123,89 protsenti). Kuid E2 kontsentratsiooni suurenemisega rakkude proliferatsioonivõime nõrgenes. Seega oli selles katses E2 optimaalne kontsentratsioon 10 nM.

GC-de rühm kontsentratsioonidel 1,75, 17,5 ja 175 µg/mg võis kiirendada MCF-7 rakuliinide proliferatsiooni ajast ja annusest sõltuval viisil ning avaldas olulist erinevust negatiivse rühmaga [joonis 1b]. Võrreldes negatiivse rühmaga, ilmnes E2 rühmal ilmne proliferatsioon (120,06 protsenti).

Kombineeritud ravimite rühma (CMG) (fulvestrant koos E2 või GC-dega) CDT-FBS söötmes inkubeeriti MCF-4 rakkudega. Pärast 72-tunnist inkubeerimist võib CMG põhjustada PR tõusu võrreldes individuaalse ravimirühmaga (IMG) (P < 0,01)="" [joonis="">

Voolutsütomeetria analüüs näitas, et GC-d võivad PI väärtust veidi suurendada, mis viitab sellele, et GC-d võivad viia G{{0}}/G1 faasi rakud S- ja G2/M-faasidesse [joonis 2 ja tabel 1] ning soodustada raku DNA-d. süntees. Tulemus, mis näitab, et MCF-7 GC-de mehhanism oli sarnane E2-ga. CMG-s (fulvestrant koos GC-dega) langes raku PI PI väärtus veidi IMG omale (P <>

RT-PCR analüüs näitas, et ER-i ja ER-i mRNA ekspressioonid suurenesid võrreldes kontrollrühmaga (P < 0,01) annusest sõltuval viisil pärast 48-tunnist erineva kontsentratsiooniga GC-dega töötlemist [joonis 3a ja b].

Western blot'i tulemus, mis näitab, et pärast 48-tunnist töötlemist erinevate kontsentratsioonidega GC-dega suureneb ER- ja ER-valkude sisaldus MCF-7-s koos GC-de suurenemisega annusest sõltuval viisil [joonis 3c-e]

KOKKUVÕTE

Selles uuringus analüüsiti GC-de mõju MCF-7 proliferatsioonile ja rakutsüklile vastavalt MTT ja voolutsütomeetria meetodil. GC-d võivad pärast 72-tunnist inkubeerimist suurendada MCF-7 rakkude proliferatsiooni kontsentratsioonidel 1,75, 17,5 ja 175 µg/ml. Kasv kipub aga aeglustuma, kui CC-sid ja fulvestranti kasutati koos. GC-d võivad suurendada MCF-7 rakkude PI väärtust, vähendada G1 faasi rakku ja suurendada S- ja G2 faasi rakku.

Fulvestrant on ER-spetsiifiline antagonist, mis blokeerib ER-i tuuma lokaliseerumist, kahjustades retseptori dimerisatsiooni ja energiast sõltuvat tuumatransporti.[17] Selles uuringus kinnitati järeldus, et fulvestrant võib nõrgendada GC-de proliferatsiooni MCF-7 rakkudel ja see võib mõjutada rakutsükli transformatsiooni. Seega näitas see uuring GC-de östrogeenset aktiivsust ja ka ER on GC-de sihtmärk. RT-PCR ja Western blot katses suurenesid ER ja ER mRNA ja valgu ekspressioonid MCF-7 rakkudes koos GC kontsentratsiooni suurenemisega. Seega võivad GC-d mängida rolli östrogeenses aktiivsuses vastavalt ülesreguleeritud mRNA-le ja ER-i ja ER-i valkudele.