Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ool päästab AD puudujääkidest, moduleerides mikrogliia aktiveerimist, kuid mitte oksüdatiivset stressi

Abstraktne: Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) eraldati Taiwani spetsiifilisest ravimseenest Antrodia camphorate, mis on tuntud oma tervist edendava ja anti- vananemismõju rahvameditsiinis. Alzheimeri tõbi (AD) on peamine vananemisega seotud haigus. Uurisime ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ooli efektiivsust ja võimalikku mehhanismi AD sümptomite suhtes. AD mudelina kasutati inimese amüloidi (A) üle-neuronaalse üleekspressiooniga drosophilat. Võrdlesime eluiga, motoorset funktsiooni, õppimist, mälu, oksüdatiivset stressi ning mikrogliia aktivatsiooni ja ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol-põletiku biomarkereid. ravitud rühmast töötlemata kontrollrühma omadele. Ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -oolravi parandas tõhusalt AD mudeli eluiga, motoorset funktsiooni, õppimist ja mälu võrreldes ravimata kontrolliga. Mikrogliia aktivatsiooni ja põletiku biomarkerid vähenesid, samas kui üldlevinud lipiidide peroksüdatsioon, katalaasi aktiivsus ja superoksiidi dismutaasi aktiivsus jäid muutumatuks. Kokkuvõtteks võib öelda, et ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ool päästab AD puudujäägi, moduleerides mikrogliia aktivatsiooni, kuid mitte oksüdatiivset stressi.

Tistanche glükosiid võib samuti suurendada SOD aktiivsust südame- ja maksakudedes ning oluliselt vähendada lipofustsiini ja MDA sisaldust igas koes, eemaldades tõhusalt erinevaid reaktiivseid hapnikuradikaale (OH-, H2O₂ jne) ja kaitstes tekitatud DNA kahjustuste eest. OH-radikaalide poolt. Tsistanche fenüületanoidglükosiididel on tugev vabade radikaalide eemaldamisvõime, suurem redutseerimisvõime kui C-vitamiinil, nad parandavad SOD aktiivsust sperma suspensioonis, vähendavad MDA sisaldust ja omavad teatud kaitset sperma membraani funktsioonile. Tsistanche polüsahhariidid võivad suurendada SOD ja GSH-Px aktiivsust D-galaktoosi poolt põhjustatud eksperimentaalselt vananevate hiirte erütrotsüütides ja kopsukudedes, samuti vähendada MDA ja kollageeni sisaldust kopsudes ja plasmas ning suurendada elastiini sisaldust. hea puhastav toime DPPH-le, pikendab hüpoksia aega vananevatel hiirtel, parandab SOD aktiivsust seerumis ja aeglustab eksperimentaalselt vananevatel hiirtel kopsude füsioloogilist degeneratsiooni Raku morfoloogilise degeneratsiooniga on katsed näidanud, et Cistanche'il on hea antioksüdantne võime ja sellel on potentsiaal olla ravim naha vananemishaiguste ennetamiseks ja raviks. Samal ajal on Cistanche ehhinakosiidil märkimisväärne võime eemaldada DPPH vabu radikaale ja see suudab eemaldada reaktiivseid hapniku liike ja takistada vabade radikaalide poolt indutseeritud kollageeni lagunemist, samuti on sellel hea parandav toime tümiini vabade radikaalide anioonide kahjustustele.

Klõpsake valikul Cistanche tablettide eelised

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Märksõnad: Alzheimeri tõbi; Drosophila; EK100; ergosta-7,9(11),22-proovis-3 -ol

1. Sissejuhatus

Antrodia camphorata on Taiwanile ainulaadne ravimseen, mis oli 19. sajandil Taiwani väliskaubanduses oluline majanduslik kultuur [1]. Taiwani esimene ajalooraamat Tâi-uân Thong-sú (sõna otseses mõttes Taiwani üldajalugu) salvestas Antrodia kamporaadi põlisrahvaste meditsiinilise kasutuse, sealhulgas patogeenide kõrvaldamise, "tervise parandamise", "vere turgutamise", "alkoholi võõrutus", " maksa kaitsmine" ja "vananemisvastane toime" [2–4]. Kuna me seisame silmitsi vananemisest tingitud ülemaailmse rahvastiku terviseprobleemiga [5], on põlisrahvaste meditsiini teaduslik uurimine vananemisvastaste teadmiste ärakasutamiseks ülioluline.

Peamiste vananemisega seotud haiguste, nagu kollatähni degeneratsioon, ateroskleroos, vähk ja insult, hulgas on Alzheimeri tõbi (AD) raske pähkel oma tabamatu patoloogilise mehhanismi tõttu. Tõhus haigust modifitseeriv ravi AD jaoks pole endiselt saadaval [6]. Praegused AD patoloogilised hüpoteesid hõlmavad, kuid ei ole nendega piiratud, koliini atsetüültransferaasi vähenemist, glutamaadi eksitotoksilisust, amüloid-beeta (A) agregatsiooni, tau fosforüülimist, aju insuliiniresistentsust [7] ja soolestiku mikrobioomi muutusi [8]. Sellegipoolest on oksüdatiivne stress ja põletikulise mikrogliia aktiveerimine, olenemata sellest, millistest AD-d käivitavatest põhjustest on kaasatud, tavalised märgid, mis kaasnevad AD neurodegeneratsiooniga [9, 10]. Huvitav on see, et neuroinflammatsioon ja oksüdatiivne stress on omavahel seotud sündmused, mida täheldatakse nii AD-s kui ka hüpoteesid AD patoloogias. Ühest küljest vallandavad A ladestumise seniilsed naastud põletikulisi reaktsioone, mikrogliia aktivatsiooni, tsütokiinide vabanemist ja astrotsütoosi, mis põhjustab soovimatuid tagajärgi, nagu progresseeruv neuronaalne vigastus ja lõpuks kognitiivsed düsfunktsioonid. Immuunvastuste aktiveerimine võib alguses võidelda A-ga sissetungivate patogeenide vastu või kõrvaldada liigsed A-ladestused; protsess tekitab aga paratamatult reaktiivseid hapniku liike (ROS), mis võivad mikrokeskkonnas põhjustada neuronite kahjustusi. Teisest küljest võib A põhjustada ROS-i põletikust sõltumatul viisil. Näiteks A leiti surmajärgse AD mitokondriaalsetes membraanides ja see võib siseneda mitokondritesse, põhjustades elektronide transpordiahela (ETC) katkemise ja põhjustades ROS-i teket. Kõrgenenud ROS võib omakorda vallandada tsütokiinide vabanemise ja algatada põletiku [7, 9, 10]. Seetõttu võivad antioksüdatiivsed ja põletikuvastased molekulid olla AD potentsiaalsed ravimid.

Antrodia kamporaadil, eriti ühel selle veealusel täispuljongist eraldatud ühendil ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -ol (tuntud ka kui EK100), oli tugev antioksüdatiivne ja antioksüdant. -põletikulised tegevused [11–13]. Lisaks Chang et al. [14] on näidanud, et antrokinonool, teine ​​ühend, mis on eraldatud Antrodia kamporaadi kääritatud seeneniidistikust, parandab õppimist ja mälu AD hiiremudelis, kus astroglioos ja oksüdatiivne stress on langenud. Siiski ei suudetud kinnitada põhjuslikke seoseid astroglioosi ja oksüdatiivse stressi vahel antrokinonooliga ravimisel ning vahendavaks teguriks on oletatud oksüdatiivse stressi alanemist [14]. EK100 ohutust on varem testitud, järgides Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsiooni (OECD) suunist 407 hiirte mudelil 10 ja 20 mg/kg päevas [15]. Seetõttu kasutasime selles uuringus puuviljakärbeste vaba söötmise ligikaudu samaväärset kontsentratsiooni.

A 42 üleekspressiooni äädikakärbse (Drosophila melanogaster) mudel on väljakujunenud AD loomamudel [16], millel on iseloomulikud AD sümptomid, sealhulgas vähenenud eluiga, õppimis- ja motoorne puudujääk [17], oksüdatiivne stress [18] ja mikrogliia aktiveerimine. [19]. AD modelleerimine Drosophila melanogasteris hõlmab BACE aktiivsuse puudumist Drosophilas ja soolisi erinevusi, mis näitavad meeste failides tõsisemaid sümptomeid. Inimese AD puhul neid ei täheldata [20]. Seetõttu võtsime AD mudelisse kasutusele inimese A 42 peptiidi ekspresseerivad kärbsed, kus A 42 tootmine ei nõua BACE aktiivsust. Selles uuringus testisime, kas EK100 parandab AD sümptomeid ja mis veelgi olulisem, kas nii oksüdatiivse stressi kui ka astroglioosi modulatsioonid on AD leevendamiseks hädavajalikud.

2. Tulemused

2.1. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol päästetud AD Drosophila ellujäämine ja ronimine

AD diagnoosimist seostatakse keskmise eluea lühenemisega [21] ja peaaegu pooled AD patsientidest kannatavad aktiivsushäirete all [22]. Seetõttu testisime, kas Antrodia camphorata ekstrakt ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) parandab loomade ellujäämist ja ronimisvõimet. AD Drosophila mudel. Leidsime, et ravi ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ooliga 125 või 250 µg/ml parandas oluliselt AD Drosophila ellujäämist (p < 0,01) (joonis 1A ja täiendav tabel S1), kuid ainult suur annus (250 µg / ml) parandas AD Drosophila ronimist (joonis 1B). Kuna ellujäämise ja liikuvuse puudujäägid on AD kliinilised sümptomid, kasutati järgmistes uuringutes kontsentratsiooni 250 µg/ml, mis parandas mõlemat sümptomit.

2.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol päästetud õppimine ja AD Drosophila ühetunnine mälu

Järgmisena testisime, kas ravi ergosta{{0},9(11),22-trien-3 -ooliga parandab õppimis- ja mäludefekte, mis on AD iseloomulik sümptom. AD-kärbseid raviti ergosta- 7,9(11),22-trien-3 -ooliga 250 ug/ml 14 päeva jooksul ning neile tehti õppimis- ja mälutestid. T-labürint. Nagu on näidatud joonisel 2A, langes metsiktüüpi kontrolliga (AD(-)/EK(-)) võrreldes AD(-)/EK(-)) õppimisvõime oluliselt (p < 0,01), samas kui ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol ravi parandas oluliselt AD õppimisvõimet (p < 0,05). Lisaks parandas ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -oolravi ka AD ühetunnise mälu vähenemist (joonis 2B).

2.3. Ergosta-7,9(11),22-proovis-3 -ol moduleeritud mikrogliia aktiveerimist AD Drosophilas

Järgmisena testisime, kas ravi ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ooliga vähendab mikrogliia aktivatsiooni AD korral. AD korral kaasneb aktiveeritud mikrogliiaga fagotsütoos ja neurodegeneratsioon [23]. Drosophilas on mikrogliia rakkude neeldumismarker ja seega ka mikrogliia aktiveerimise marker drapeeringu (Drpr) ja allavoolu CED ekspressioon [24]. Pärast ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ooliga töötlemist tapeti AD-kärbsed ja kärbeste peast eraldati RNA RT-qPCR jaoks. Nagu on näidatud joonisel 3A, olid mõlemad Drpr ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol-iga töödeldud AD Drosophilas võrreldes ravimata AD-ga oluliselt alla reguleeritud. See tähendab, et ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ool vähendas AD Drosophila mikrogliia aktivatsiooni. Veelgi enam, ergosta-7,9(11), 22-trien-3 -oolravi, alandas ka kesknärvisüsteemi põletikku, nagu ilmnes põletikuga seotud geenide alareguleerimisest (joonis 3B). .

2.4. Ergosta-7,9(11),22-proovis-3 -ol ei moduleerinud AD Drosophila kõikjal esinevat oksüdatiivset stressi

Järgmisena testisime, kas ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol on AD päästmiseks vajalik kõikjal esineva (st kogu keha) oksüdatiivse stressi moduleerimine. Ergosta-7,9(11),22-proovitud- 3 -ooliga töötlemine ei muutnud lipiidide peroksüdatsiooni (joonis 4A), katalaasi aktiivsust (joonis 4B), superoksiiddismutaasi aktiivsust (joonis 4C) või oksüdatiivse stressiga seotud geenide ekspressioon (joonis

3. Arutelu

Selles uuringus kirjeldatakse ergosta-7,9(11),22- proovi-3 -ol, Antrodia kamporaadi ekstrakti, tõhusust ja võimalikku alusmehhanismi AD sümptomite muutmiseks Drosophila abil. inim-A üleekspressiooniga mudel. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol parandas tõhusalt õppimist ja mälu ning pikendas AD-ga patsientide eluiga. Lisaks vähenesid mikrogliia aktiveerimise ja põletiku biomarkerid, samas kui üldlevinud oksüdatiivne stress ei muutunud.

AD-s on palju oksüdatiivse stressi allikaid, sealhulgas, kuid mitte ainult, kaasasündinud immuunsuse aktiveerimine – näiteks A akumuleerumine, mitokondrite lagunemine A poolt, hüperfosforüülitud tau ja metallide ainevahetushäired [25]. Kuigi põletik ja oksüdatiivne stress võivad üksteist vastastikku esile kutsuda, võime eeldada, et nende sünkroonsed muutused toimuvad ainult olukorras, kus muud oksüdatiivse stressi allikad jäävad konstantseks. Selles uuringus see aga nii ei ole. Kaasasündinud immuunsuse vähenemine, eriti mikrogliia aktiveerimine, nõrgendab samal ajal selle panust A kliirensi, mis võib põhjustada A akumuleerumist. Huvitaval kombel käivitab A akumulatsioon ise oksüdatiivse stressi tekke mitmel viisil. Seega võivad EK1000 mikrogliia aktiveerimise ja põletikuliste reaktsioonide vähenemine osaliselt kaitsta neuroneid sihtmärgist mittevastavate immuunrünnakute eest, kuid maksab A-kliirensi nõrgenemise eest. Seega võib selle uuringu tulemus kajastada mikrogliia sihtimise strateegia piiranguid, vähemalt AD Drosophila mudelis.

Mikrogliia poolt vahendatud kaasasündinud immuunsüsteemi kirjeldatakse kui kahe teraga mõõka neurodegeneratiivsete haiguste, eriti AD korral [26, 27]. Aktiveeritud mikroglia üritab eemaldada toksilisi patogeene nagu A, kuid põhjustab paratamatult mikrokeskkonnas neuronite kahjustusi. 250 µg/mL EK100 paremus 35 päeva jooksul võib viidata sellele, et mikrogliia aktiveerimise alandamise strateegia on patoloogilise staadiumiga piiratud, vähemalt äädikakärbse AD mudeli puhul. Veelgi enam, mikrogliia aktiveerimise ja põletikulise vastuse biomarkerite märkimisväärne vähenemine ei ole toonud kaasa samaväärset ellujäämise paranemist ning kesknärvisüsteemi funktsiooni võib osaliselt seletada mikrogliia kahe teraga mõõga omadusega. See tähendab, et mikrogliia aktiveerimine ei ole AD edenemise ainus ega domineeriv tegur. Madalam mikrogliia aktiveerimine tähendab ka seda, et üleekspresseeritud A lagunemine oli puuviljakärbse mudelis osaliselt välja lülitatud, mis võib samuti seletada suuremat suremust kõrgema EK100 kontsentratsiooni korral vanuses 35 kuni 52 päeva.

Antrokinonooli, teise Antrodia kamporaadi ekstrakti kohta on teatatud selle efektiivsusest AD hiirte ravis, mille vahendavaks faktoriks on peetud oksüdatiivse stressi alandamist [14]. Seetõttu võib see tähendada, et antrokinonool ja ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ool parandavad AD sümptomeid sõltumatute radade kaudu, vahendades vastavalt oksüdatiivset stressi või mitte. Seetõttu oleks huvitav testida, kas koosmanustamine antrokinonooli ja ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ooliga avaldaks sünergilist mõju AD paranemisele.

AD varases staadiumis on ravimite väljatöötamisel põhirõhk A ladestumise kõrvaldamisel (nagu hiljuti heaks kiidetud monoklonaalses antikehas aducanumab [28], vaatamata sellele, et ühes kahest III faasi kliinilisest uuringust ilmnes selle minimaalse kliinilise kasu ja ebaefektiivsuse vaidlusi. [29]) või üritab suurendada A mikrogliia omastamist [30–32]. Kuid AD mõõduka või kaugelearenenud staadiumi korral süvendab mikrogliia üleaktiveerimine neurodegeneratsiooni [33] ja seetõttu on vaja alternatiivseid ravistrateegiaid.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Kärbsevarude hooldus ja eluea mõõtmine

Transgeenne Drosophila tüvi H29.3/CyO saadi [16]-st ja seda ristati w(CS10)-ga kuus põlvkonda. Pan-neuraalse draiveri elav-GAL4c155 rida ületati w(CS10)-ga kuue põlvkonna jooksul. Standardvaruna kasutati joont white eye w1118 (Bloomington Drosophila Stock Center #3605), mis ületas Canton S liini (Bloomington Drosophila Stock Center # 64349) 10 korda (w (CS10)). Pan-neuraalne draiver elav-GAL4c155 liin saadi Bloomington Drosophila Stock Centerist (#458). Katsekärbeste – st AD mudeli – genotüüp oli [elav; H29.3/ plus ], mis valiti F1 järglaste hulgast ilma CyO markerita. Kärbseid hoiti maisijahu standardsöötmes temperatuuril 25 ◦C 12-tunnise valguse-pimeduse tsükli all. T-labürindi jaoks tekkiv [elav; H29.3/ plus ] kärbsed koguti (mõlemad sugupooled segatud ja mitte neitsilikud) ja kultiveeriti EK100-ga töötlemisega või ilma kuni päevani 14 pärast tärkamist. Ellujäämiseks, ronimiseks ja RT-qPCR-ks kasutati ainult isaskärbseid. RNA proovid koguti d30 pärast tärkamist, kui nii eluiga kui ka ronimiskõverad näitasid olulist eraldumist võrreldes töötlemata AD mudeliga.

Eluea analüüsis kasvatati kakskümmend kuni kolmkümmend kärbest toiduviaalis CS-ga või ilma; iga ravi jaoks valmistati ette vähemalt neli viaali. Toiduviaale vahetati iga 2–3 päeva tagant ja sel ajal loendati surnud kärbsed. Ühe uuringu kohta viidi läbi vähemalt kolm kordust. Ellujäämisprotsent on määratletud kui elusate kärbeste arv jagatud kärbeste koguarvuga testi alguses.

4.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (Ek100)

Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol eraldati Antrodia camphorata lahkest kingitusest, nagu eelnevalt kirjeldatud [34]. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ool moodustab toatemperatuuril helekollase värvusega pulbri. Põhilahus valmistati vahetult enne kasutamist EtOH-s kontsentratsiooniga 6,25 mg/ml. Eluea ja geotaksisevastaste testide puhul olid lõppkontsentratsioonid 125 ja 250 µg/ml. Õppimismälu ja geeniekspressiooni testide puhul oli lõppkontsentratsioon 250 µg/ml. EK100 molekulmass on 396,65. Seega on vastavad molaarsed kontsentratsioonid vastavalt 315 või 630 uM. Kärbseid töödeldi kahe annusega EK100 lõppkontsentratsioonidega 125 ja 250 µg/ml, mis segati toiduga Ad libitum söötmise teel. Kontrolltoit sisaldas sama palju lahusti EtOH-d kui katserühmad, mille EtOH lõppkontsentratsioon oli 3 mahuprotsenti. Ravi algas tekkimisest kuni iga analüüsi andmete kogumise ajapunktini. Ellujäämise ja ronimistesti jaoks tehti ravi kogu eluea jooksul. Iga replikatsiooni kärbeste arvu kirjeldati iga testi meetodi osas. Testisime ka eluea teste töödeldud/töötlemata metsiktüüpi kärbestega, et tagada kärbsemudelites ergosta-7,9(11),22-trien-3 -oli ohutus (täiendav joonis S1 ).

4.3. Antigeotaksise testid

Käesolev protokoll põhineb varem avaldatud meetodil [35], mõningate muudatustega. Lühidalt, geotaksise aparaadina kasutati läbipaistvat silindrilist plastviaali läbimõõduga 2,5 cm ja kõrgusega 9,5 cm (pikem on hea, kuid seda on raskem käsitseda). Viaali põhi kaeti pehmenduseks ühe kihi kärbsetoiduga. Viaali välispinnale kinnitati padja kohal 5 cm märk. Viaali teine ​​ots oli lahti ja sealt laaditi kärbseid. Kuna test viidi läbi samaaegselt ellujäämistestiga, oli koormatud kärbeste arv identne sel hetkel ellujäänute arvuga. Kärbsed laaditi viaali; ülaosa suleti korgiga ja viaali põhja löödi korduvalt (kaks sekundit) vastu kõva pinda, millel see seisis (antud juhul laboripink). Koputus oli piisavalt tugev, et kärbseid ehmatada ja mööda viaali seinu ronida, kuid mitte nii tugev, et neid füüsiliselt vigastada. Kogu protsess salvestati 18 sekundi jooksul videole, märgiti üles 5 cm märgist kõrgemale roninud kärbeste arv ja väljendati protsentides iga rühma kohta. Loendati üle 5 cm märgi roninud kärbeste arv. Iga rühma jaoks viidi läbi neli kordust. Ronimisvõime protsent on defineeritud kui ronivate kärbeste arv jagatud kärbeste koguarvuga testi alguses. Ronimisvõimet testiti ka töödeldud/töötlemata metsiktüüpi kärbestega, et tagada ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol ohutus kärbsemudelites (täiendav joonis S2) .

4.4. Drosophila õppimis- ja mäluplatvorm (T-Maze)

Drosophila õppimise ja mälu jälgimiseks pandi esmalt ülemisse kupukambrisse umbes 100 kärbest, mida saab varustada elektripingega ja anda kärbestele elektrilöögi. Kärbsed tarniti esmakordselt lõhnaga 1 (MCH) koos elektrilöögilainetega. Seejärel toodi kärbsed kohale lõhnaga 2 (OCT) ilma elektrilöögi laineteta. Pärast treenimist viidi kärbsed all olevasse ruumi, kus kaks lahtist külge varustati vastavalt kas lõhnaga 1 või lõhnaga 2. Kärbeste liikumissuunda jälgides saab lõhna 2 kõrvalekallet lõhna 1 suhtes hinnata jõudlusindeksiga (PI), mis on defineeritud kui kahe lõhna vahel esinevate kärbeste arvu erinevus jagatuna kärbeste koguarvuga. Jõudlusindeks tähistab Drosophila õppimis- ja mäluvõimet [36]. Veel üks kärbeste rühm oli konditsioneeritud vastupidise lõhna paaridega, nii et iga lõhn toimis ühe korra elektrilöögina ja ühel korral elektrilöögina. Nende kahe testi PI-d keskmistati ühe korduse lõpliku PI-na. "1 h-mälu" testiti pärast 1-tunnist treeningut, samas kui "õppimist" testiti seevastu pärast 1,5-minutilist vahet treeningule. Testisime ka AD-kärbeste MCH ja OCT vältimist EK100-ga või ilma, et tagada, et ravi põhjustab aversiivsete lõhnade suhtes kallutatust (täiendav joonis S3).

4.5. Kvantitatiivne PCR

Pead ja kehad eraldati enne RNA ekstraheerimist. Ühe korduse korral tuimastati kärbsed CO2-ga; kogutud, 100 korraga, Eppendorfi torudesse; ja seejärel kasteti 1 minutiks vedelasse lämmastikku, et kehad hapraks muutuksid. Saadud külmutatud surnukehad laaditi seejärel sõela loksutite virnadesse (Bunsekifurui, nr 40 ja nr 25) ja loksutatud. Kehad lagunesid ja sorteeriti sõela silmade suuruse järgi kaheks eraldi fraktsiooniks: "pead" ja "kehad". Kogu RNA ekstraheeriti RNeasy Mini komplektiga (Qiagen, Düsseldorf, Saksamaa) ja seejärel kasutati cDNA sünteesimiseks VersoTM cDNA sünteesikomplektiga (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Uuritud geenide RNA ekspressioonitasemed kvantifitseeriti reaalajas PCR-iga (Applied Biosystems 7700, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) Maxima SYBR Green qPCR Master Mixiga (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Tulemused normaliseeriti Gapdh või Rpl32 suhtelise kogusega. Kasutatud praimerid on loetletud allpool. Gapdh: 50 -GAAAAAGCGGCAGTCGTAAT-30 ja 50 -AATTCCGATCTTCGACATGG-30 ; Drpr: 50 -TGTGATCATGGTTACGGAGGAC-30 ja 50 -CAGCCGGGTGGGCAA-30 ; CED: 50 - CGTTTACAAGGAGCGACT-30 ja 50 -TTCCCAGATTGAAGAGCAGG-30 ; Kass: 50 -TGACT ACAAAAACTCCCAAACG-30 ja 50 -TTGATTCCAATGGGTGCTC-30 ; PHGPx: 50 -TGACA TCGGCGAGGTGT-30 ja 50 -CGGTCTGCTTGGCCTTTA-30 ; Cnc: 50 -GCCAACTATGGTGG TGGAGT-30 ja 50 -ACGCTGCGATTCAGACG-30 ; SOD1: 50 -GTCGACGAGAATCGTCAC CT-30 ja 50 -GGAGTCGGTGATGTTGACCT-30 ; SOD2: 50 -AAATTTCGCAAACTGCAAGG- 3 0 ja 50 -GGTCGCCATTTGTTGCTATT-30 ; SOD3: 50 -TCAGCATGGGTGCTCACTAT-30 ja 50 -TAATGCCCGTGGAGTTGG-30 ; mkk3: 50 -CCGCTACCCATACGACAAT-30 ja 5 0 -GAATTCCGGCGAAAATGT-30 ; mekk1: 50 -TTTAACGGCAGTGGAACTGT-30 ja 50 - TGCATCTGCAACTGCTCAC-30 ; imd: 50 -AGATCGACCAGGCCATAATC-30 ja 50 -AATCC ACTGGAGCAACAGC-30 ; rac1: 50 -CCGTGTTCGACAACTACTCG-30 ja 50 -AGTCGGTCG TAGTCCTCCTG-30 ; maitse: 50 -GCCATACTCCCTTGGAATTG-30 ja 50 -TCTCCCTTCTCCG GATACAC-30 ; Rpl32: 50 -CGGATCGATATGCTAAGCTGT-30 ja 50 -CGACGCACTCTGTTG TCG-3.

4.6. Oksüdatiivse stressi analüüsid

Lipiidide peroksüdatsiooni, katalaasi aktiivsuse ja superoksiidi dismutaasi aktiivsuse kolm kordust mõõdeti BIOXYTECH LPO-586 (OxisResearch, OXIS International, Beverly Hills, CA, USA), Catalase Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) abil. , USA) ja Superoxide Dismutase Assay Kit (Cayman), järgides tootja juhiseid. Lühidalt, SOD aktiivsust hinnati komplektiga tarnitud ksantiini oksüdaasi tekitatud superoksiidi radikaalide dismutatsiooni mõõtmisega ja tuvastati tetrasooliumisoola muutmisega formazaani värviks, seejärel kvantifitseeriti neeldumise järgi 440–460 nm juures. CAT-i aktiivsust hinnati formaldehüüdi moodustumise mõõtmisega metanoolist H2O2 juuresolekul, mida katalüüsis CAT ja mis tuvastati komplektis sisalduva kromogeense 4-amino-3- hüdrasino-5-merkapto-1 abil. ,2,4-triasool, seejärel kvantifitseeriti neeldumise järgi 540 nm juures. Lipiidide peroksüdatsiooni aktiivsust hinnati, mõõtes polüküllastumata rasvhapete peroksiidide lagunemist malonaldehüüdiks (MDA) ja 4-hüdroksüalkenaalideks, mis tuvastati komplekti kuuluva kromogeense N-metüül-2-fenüülindooliga, seejärel kvantifitseeriti neeldumise järgi 586. nm. SOD-, Cat- ja LPO-testide puhul oli iga korduse tervete homogeniseeritud kärbeste arv vastavalt 50, 50 ja 100.

4.7. Statistiline analüüs

Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ooliga ravitud ja kontrollrühmade ellujäämiskõverate ja tõusukõverate erinevuse olulisust hinnati logaritmi järgi (Mantel- Coxi) ja Gehan-Breslow-Wilcoxoni testid. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ooliga ravitud ja kontrollrühmade õpimälu jõudlusindeksi erinevuse olulisust hinnati Studenti t-testiga.

5. Kokkuvõtted

Kontrollisime, et Antrodia kamphoraadist saadud ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) parandab ellujäämist, õppimist ja mälu AD Drosophila mudelis, vähendades biomarkereid. mikrogliia aktiveerimist ja põletikku. Pealegi ei toimunud sümptomite muutumist üldlevinud oksüdatiivse stressi vähenemise kaudu, mis tähendab, et ergosta-7,9(11) ja 22-trien-3 -ool parandavad AD sümptomeid erinevatel viisidel teiseni. Antrodia kamporaadi ekstrakt, antrokinonool. EK100 vähendas tõhusalt mikrogliia aktivatsiooni ja põletikku, mis võib aidata muuta tüüpilisi AD-ga seotud kognitiivseid puudujääke, nagu õppimis- ja mälupuudulikkus.

Täiendavad materjalid:Järgmised on Internetis saadaval. Joonis S1: EK100-ga töödeldud metsiktüüpi kärbeste ellujäämine; Joonis S2: EK100-ga töödeldud metsiktüüpi kärbeste ronimine; Joonis S3: EK100-ga töödeldud AD-kärbeste ebameeldiva lõhna vältimine; Tabel S1: ellujäämiskõverate statistika.

Autori kaastööd:H.-PL, Y.-HK ja W.-YL kavandasid katsed. Y.-HK aitas kaasa EK100 ettevalmistamisele. JC, L.-ZC, M.-SC, L.-WS ja T.-NC viisid läbi katsed. Käsikirja koostamisel osalesid kõik autorid. Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine: seda tööd toetasid Taiwani teadus- ja tehnoloogiaministeeriumi stipendiumid (MOST 108-2320-B-039-031-MY3, MOST 109-2314-B-039-030, MOST 110-2314- B-039-009), Hiina meditsiiniülikool ja haigla (CMU109-MF-85, CMU108-MF-68, CMU108-MF{{12 }}, CMU109- AWARD-02 ja DMR-109-150) ning esiletõstetud piirkondade uurimiskeskuse programmist Haridusministeeriumi (MOE) Higher Education Sprout Projecti raames Taiwanis (CMRC-CHM-2-1).

Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus:Ei kohaldata.

Teadliku nõusoleku avaldus:Ei kohaldata.

Andmete kättesaadavuse avaldus:Selle uuringu tulemuste toetuseks kasutatud andmed on lisatud artiklisse.

Huvide konfliktid:Y.-HK on üks leiutajatest, kuid mitte patendi US-9757393-B2 "Ergostatrien-3- -ooli derivaadid aniriidiakamporaadist ja selle antiglükeemiline, antihüperlipideemiline ja vähendav maksarasvade kasutamine" loojatest, kuid mitte omanik. Teised autorid kinnitavad, et neil puuduvad konkureerivad huvid. Rahastajatel ei olnud uuringu kavandamisel mingit rolli; andmete kogumisel, analüüsimisel või tõlgendamisel; käsikirja kirjutamisel või tulemuste avaldamise otsuses.

Näidiste saadavus:Ühendite näidised on saadaval autoritelt.

Viited

1. Davidson, JW Formosa saar, minevik ja olevik: ajalugu, inimesed, ressursid ja ärilised väljavaated. Tee, kamper, suhkur, kuld, kivisüsi, väävel, ökonoomsed taimed ja muud tooted; Macmillan & Company: New York, NY, USA, 1903.

2. Tsai, Z.; Liaw, S. Ganoderma kasutamine ja mõju; Sheng-Yun Publishers, Inc.: Taichung, Taiwan, 1985; lk 116–117.

3. Chen, C.-J. Antrodia camphorata tahke kasvatamise ja bioaktiivsuse uuring. Seene. Sci. 2001, 16, 65–72.

4. Geethangili, M.; Tzeng, Y.-M. Antrodia kamporaadi ja selle bioaktiivsete ühendite farmakoloogiliste mõjude ülevaade. Tõenditepõhine täiendus. Altern. Med. 2011, 2011, 212641. [CrossRef] [PubMed]

5. Ogura, S.; Jakovljevic, MM Globaalne rahvastiku vananemine – tervishoid, sotsiaalsed ja majanduslikud tagajärjed. Ees. Rahvatervis 2018, 6, 335. [CrossRef] [PubMed]

6. Cummings, J.; Lee, G.; Ritter, A.; Zhong, K. Alzheimeri tõve ravimite väljatöötamise torujuhe: 2018. Alzheimeri dementsus. Tõlk. Res. Clin. Interv. 2018, 4, 195–214. [CrossRef] [PubMed]

7. Sharma, P.; Srivastava, P.; Seth, A.; Tripathi, PN; Banerjee, AG; Shrivastava, SK Põhjalik ülevaade Alzheimeri tõvega seotud patogeneesi mehhanismidest ja võimalikest ravistrateegiatest. Prog. Neurobiol. 2019, 174, 53–89. [CrossRef] [PubMed]

8. Sochocka, M.; Donskow-Łysoniewska, K.; Diniz, BS; Kurpas, D.; Brzozowska, E.; Leszek, J. Alzheimeri tõve soolestiku mikrobiomi muutused ja põletikust tingitud patogenees – kriitiline ülevaade. Mol. Neurobiol. 2019, 56, 1841–1851. [CrossRef]

9. Agostinho, P.; A Cunha, R.; Oliveira, C. Neuroinflammation, oksüdatiivne stress ja Alzheimeri tõve patogenees. Curr. Pharm. Des. 2010, 16, 2766–2778. [CrossRef]

10. Galasko, D.; Montine, TJ Alzheimeri tõve oksüdatiivse kahjustuse ja põletiku biomarkerid. Biomark. Med. 2010, 4, 27–36. [CrossRef]

11. Kuo, Y.-H.; Lin, T.-Y.; Sina, Y.-J.; Wen, K.-C.; Sung, P.-J.; Chiang, H.-M. Antrodia camphorata'st eraldatud ergostatrien-3 -ooli põletikuvastane ja fotokahjustav toime karvutu hiire nahale. Molecules 2016, 21, 1213. [CrossRef]

12. Chao, T.-Y.; Hsieh, C.-C.; Hsu, S.-M.; Wan, C.-H.; Lian, G.-T.; Tseng, Y.-H.; Kuo, Y.-H.; Hsieh, S.-C. Ergostatrien-3 -ool (EK100) Antrodia camphorata'st leevendab oksüdatiivset stressi, põletikku ja maksakahjustusi in vitro ja in vivo. Eelmine Nutr. Food Sci. 2021, 26, 58. [CrossRef]

13. Tsai, T.-C.; Tung, Y.-T.; Kuo, Y.-H.; Liao, J.-W.; Tsai, H.-C.; Chong, K.-Y.; Chen, H.-L.; Chen, C.-M. Antrodia camphorata ja selle aktiivse ühendi Ergostatrien{10}ol põletikuvastane toime hiire nahaisheemia mudelis. FASEB J. 2015, 29, LB444.

14. Chang, W.-H.; Chen, MC; Cheng, IH Antrokinonool alandab aju amüloidi taset ning parandab ruumilist õppimist ja mälu Alzheimeri tõve transgeense hiiremudeli puhul. Sci. Vabariik 2015, 5, 1–12. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, Y.-M.; Sung, H.-C.; Kuo, Y.-H.; Hsu, Y.-J.; Huang, C.-C.; Liang, H.-L. The Effects of Ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol from Antrodia camphorate on biochemical Profile and Exercise Performance hiirtel. Molecules 2019, 24, 1225. [CrossRef]

16. Finelli, A.; Kelkar, A.; Song, H.-J.; Yang, H.; Konsolaki, M. Mudel Alzheimeri A 42-indutseeritud toksilisuse uurimiseks Drosophila melanogasteris. Mol. Kamber. Neurosci. 2004, 26, 365–375. [CrossRef] [PubMed]

17. Ping, Y.; Hahm, E.-T.; Waro, G.; Song, Q.; Vo-Ba, D.-A.; Licursi, A.; Bao, H.; Ganoe, L.; Finch, K.; Tsunoda, S. 42-indutseeritud ülierutuvuse seostamine neurodegeneratsiooni, õppimis- ja motoorsete häiretega ning lühema elueaga Alzheimeri tõve mudelis. PLoS Genet. 2015, 11, e1005025. [CrossRef] [PubMed]

18. Rivaal, T.; Page, RM; Chandraratna, DS; Sendall, TJ; Ryder, E.; Liu, B.; Lewis, H.; Rosahl, T.; Hider, R.; Camargo, L. Fenton keemia ja oksüdatiivne stress vahendavad amüloidpeptiidi toksilisust Alzheimeri tõve Drosophila mudelis. Eur. J. Neurosci. 2009, 29, 1335–1347. [CrossRef]

19. Ray, A.; Speese, SD; Logan, MA Glial draper päästab toksilisuse Alzheimeri tõve Drosophila mudelis. J. Neurosci. 2017, 37, 11881–11893. [CrossRef]

20. Jeibmann, A.; Paulus, W. Drosophila melanogaster kui ajuhaiguste mudelorganism. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 407–440. [CrossRef] [PubMed]

21. Brookmeyer, R.; Corrada, MM; Curriero, FC; Kawas, C. Elulemus pärast Alzheimeri tõve diagnoosimist. Arch. Neurol. 2002, 59, 1764–1767. [CrossRef]

22. Lam, LC; Tang, W.; Leung, V.; Chiu, HF Alzheimeri tõve käitumisprofiil Hiina eakatel – Alzheimeri tõve käitumispatoloogia hindamisskaala Hiina versiooni kinnitusuuring. Int. J. Geriatr. Psühh. 2001, 16, 368–373. [CrossRef] [PubMed]

23. Schwab, C.; McGeer, PL Alzheimeri tõve ja teiste neurodegeneratiivsete häirete põletikulised aspektid. J. Alzheimeri dis. 2008, 13, 359–369. [CrossRef] [PubMed]

24. MacDonald, JM; Rand, MG; Porpiglia, E.; Sheehan, AE; Watts, RJ; Freeman, MR Drosophila raku surnukeha neelamisretseptor Draper vahendab katkenud aksonite gliaalset kliirensit. Neuron 2006, 50, 869–881. [CrossRef]

25. Chen, Z.; Zhong, C. Oksüdatiivne stress Alzheimeri tõve korral. Neurosci. Bull. 2014, 30, 271–281. [CrossRef]

26. Stankovic, ND; Teodorczyk, M.; Ploen, R.; Zipp, F.; Schmidt, MH Microglia ja veresoonte koostoimed: kahe teraga mõõk ajupatoloogiates. Acta Neuropathol. 2016, 131, 347–363. [CrossRef]

27. Konishi, H.; Kiyama, H. Microglial TREM2/DAP12 signalisatsioon: kahe teraga mõõk närvihaiguste korral. Ees. Kamber. Neurosci. 2018, 12, 206. [CrossRef] [PubMed]

28. Sevigny, J.; Chiao, P.; Bussière, T.; Weinreb, PH; Williams, L.; Maier, M.; Dunstan, R.; Salloway, S.; Chen, T.; Ling, Y. Antikeha aducanumab vähendab Alzheimeri tõve korral A-naastu. Loodus 2016, 537, 50–56. [CrossRef]

29. Lalli, G.; Schott, JM; Hardy, J.; De Strooper, B. Aducanumab: uus etapp Alzheimeri tõve ravis? EMBO Mol. Med. 2021, 13, e14781.

30. Takata, K.; Kitamura, Y.; Saeki, M.; Terada, M.; Kagitani, S.; Kitamura, R.; Fujikawa, Y.; Maelicke, A.; Tomimoto, H.; Taniguchi, T. Galantamiinist põhjustatud amüloidi kliirens, mis on vahendatud mikrogliia nikotiini atsetüülkoliini retseptorite stimuleerimise kaudu. J. Biol. Chem. 2010, 285, 40180–40191. [CrossRef] [PubMed]

31. Mandrekar-Colucci, S.; Karlo, JC; Landreth, GE Peroksisoomi proliferaatori poolt aktiveeritud retseptori - -vahendatud amüloidi kliirensi ja kognitiivsete häirete kõrvaldamise aluseks olevad mehhanismid Alzheimeri tõve hiiremudelis. J. Neurosci. 2012, 32, 10117–10128. [CrossRef]

32. McGeer, PL; McGeer, EG Mikrogliia sihtimine Alzheimeri tõve raviks. Eksperdi arvamus. Seal. Sihid 2015, 19, 497–506. [CrossRef] [PubMed]

33. Laul, WM; Colonna, M. Mikrogliia identiteet ja funktsioon neurodegeneratsioonis. Nat. Immunol. 2018, 19, 1048–1058. [CrossRef] [PubMed]

34. Kuo, Y.-H.; Lin, C.-H.; Shih, C.-C. Antrodia camphorata ergostatrien{4}ool inhibeerib diabeeti ja hüperlipideemiat kõrge rasvasisaldusega dieediga ravitud hiirtel, reguleerides maksaga seotud geene, glükoosi transporterit 4 ja AMP-aktiveeritud proteiinkinaasi fosforüülimist. J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 2479–2489. [CrossRef] [PubMed]

35. Le Bourg, E.; Lints, FA Hüpergravitatsioon ja vananemine Drosophila melanogasteris. 4. Ronimistegevus. Gerontology 1992, 38, 59–64. [CrossRef]

36. Waddell, S.; Quinn, WG Kärbsed, geenid ja õppimine. Ann. Rev Neurosci. 2001, 24, 1283–1309. [CrossRef] [PubMed]

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】