Epigallokatehhiin{0}}gallaat soodustab sigade munarakkude in vitro küpsemist ja embrüo arengut pärast IVF-i

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Eesmärk:Epigallokatehhiin-3-gallaat (EGCG) on katehhiinpolüfenoolide peamine koostisosa ja sellel on tugevate antioksüdantsete omaduste tõttu kaitsev toime. Meile teadaolevalt on EGCG mõju sigade munarakkude in vitro küpsemisele (IVM) ja in vitro viljastamisele (IVF) süstemaatilised uuringud endiselt puudulikud. Käesoleva uuringu eesmärk oli määrata EGCG mõju sea munarakkude IVM-ile ja IVF-ile.

Meetodid: sigade ootsüüte töödeldi erineva kontsentratsiooniga EGCG-ga (5, 10 ja 20 uM) ning kummulirakkude laienemist, munarakkude küpsemiskiirust, reaktiivseid hapniku liike (ROS). glutatiooni (GSH) ja malondialdehüüdi (MDA) tasemed, määrati kogu antioksüdantide võime. Oksüdatiivse stressi ja apoptoosiga seotud geenide mRNA ekspressioonitasemed määrati kvantitatiivse reaalajas PCR abil. Samuti hinnati munarakkude lõhustamiskiirust ja blastotsüstide kiirust pärast 10 μM EGCG-ravi IVM-i ja IVF-i ajal. Tulemused: EGCG kontsentratsioonis 5, 10 ja 20 uM soodustas märkimisväärselt kummulirakkude laienemist ja EGCG 10 uM juures suurendas munarakkude küpsemise kiirust. EGCG (10 uM) töötlemine vähendas ROS ja MDA taset, suurendades samal ajal antioksüdantide võimet ja GSH kontsentratsiooni küpsetes munarakkudes. QRT-PCR tulemused näitasid, et EGCG-ravi reguleeris katalaasi, glutatioonperoksidaasi ja superoksiidi dismutaasi mRNA ekspressiooni küpsetes munarakkudes. Lisaks vähendas EGCG-ravi ka Baxi ja kaspaasi-3 mRNA ekspressioonitaset ning suurendas Bcl-2 mRNA ekspressioonitaset küpsetes munarakkudes. Lisaks oli IVM-i ja IVF-i ajal 10 μM EGCG-ga töödeldud munarakkude lõhustamis- ja blastotsüstide kiirus oluliselt kõrgem kui kontrollrühmal.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Järeldus:Meie tulemused näitavad, et EGCG soodustab sigade munarakkude IVF-i järel in vitro küpsemist ja embrüo arengut. EGCG kaitsev toime munarakkudele võib olla seotud selle antioksüdantsete ja apoptoosivastaste omadustega. Märksõnad: EGCG, sea munarakud, IVM, antioksüdant, anti-apoptoos, IVF

Sissejuhatus

Munarakkude in vitro küpsemine (IVM) on võtmeetapp kariloomade embrüote in vitro tootmisel.2 IVM-i munarakud on võimelised viljastuma ja arenema embrüoteks, samas kui IVM-i munarakkudest embrüo arenemise edukus on madalam. kui in vivo küpsenud munarakkudest.3 Munarakkude küpsemine nõuab nii tsütoplasmaatilist kui ka tuuma küpsemist ning ebaõige tsütoplasmaatiline küpsemine on arvatavasti kaasa aidanud IVM ootsüütide kehvale arengupotentsiaalile. Varasemate uuringute põhjal on õige söötme koostis ja kultiveerimistingimused olulised munarakkude edukaks IVM-ks.4 Epigallokatehhiin-3-gallaat (EGCG) on rohelise tee üks peamisi bioaktiivseid ühendeid ja kuulub katehhiinpolüfenoolide hulka.5 EGCG-l on on tuntud oma rolli poolest siirdemetallide kelaatimisel ja seega oksüdatiivse stressi taseme vähendamisel.5 In vitro ja in vivo eksperimentaalsed uuringud on näidanud, et EGCG-l on erinevad bioloogilised funktsioonid, sealhulgas kromosoomikahjustuste vältimine reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) poolt, antibakteriaalne. aktiivsus, kasvajavastane toime ja lipogeneesi pärssimine. IVM-i munarakkudes näitasid Huang jt, et EGCG IVM-söötmes võib vähendada ROS-i taset ja apoptoosi veise munarakkudes ning suurendada kummulirakkude laienemist. Roth jt näitasid, et antioksüdandi EGCG intraperitoneaalne süstimine parandab hiirtel hüpertermiaga ravitud munarakkudest arenevate embrüote arengupädevust ja kvaliteeti. Gadani jt näitasid, et EGCG lisamine sulatatud kuldi spermale parandas in vitro viljastamist (IVF).8. Hiljutine Bucci jt uuring näitas aga, et EGCG lisamine sulatuskeskkonnale ei parandanud koera sperma kvaliteeti ega tsoonide sidumisvõimet.10 Meile teadaolevalt ei ole veel süstemaatilisi uuringuid EGCG mõju kohta sigade munarakkude IVM ja IVF. Kas EGCGcani kasutatakse in vitro kultiveeritud sigade munarakkude tõhusa antioksüdandina, tuleb veel uurida. Süstemaatiliselt uuriti EGCGoni mõju sea munarakkude IVM-ile ja IVF-ile. Lisaks määrati in vitro testidega ROS-i tase, antioksüdantide võime, antioksüdantide ja apoptoosiga seotud geeni mRNA ekspressioonitasemed munarakkudes.

Cistanche võib parandada immuunsust

Materjalide ja meetodite eetikaavaldus

Selle töö kiitis heaks Lõuna-Hiina põllumajandusülikooli loomkatsete eetikakomitee.

EGCG ravi

EGCG ühend osteti firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) ja valmistati I mM lähtekontsentratsioonina, kasutades M-199 söödet (Sigma-Aldrich). Et määrata EGCG mõju kummuli laienemisindeksile ja munarakkude in vitro küpsemiskiirusele ning munarakkude ROS-i tootmisele, EGCG erinevad kontsentratsioonid(0,5, 1{{10} } ja 20 uM) lisati IVM söötmele (M-199 sööde, millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit, 10 protsenti sea folliikulite vedelikku, 0,57 mM tsüsteiini, 10 ng/mL epidermise kasvufaktorit, 10 RÜ/ml tiine mära seerumi gonadotropiini ja 10 RÜ/mL inimese kooriongonadotropiini). Et määrata EGCG mõju kogu antioksüdandivõimele, glutatiooni (GSH) sisaldusele, malondialdehüüdi (MDA) tasemele ja mRNA ekspressioonitasemele, lisati IVM söötmele EGCG (0 ja 10 uM). Et teha kindlaks EGCG mõju munarakkude arengupotentsiaalile, lisati IVM ja/või IVF või IVM ja/või IVC ajal EGCG (0 ja 10 μM).

Munarakkude kogumine ja in vitro küpsemine

Munasarjad saadi noorsigadelt, kes tapeti kohalikus tapamajas (Guangzhou Kongwangji Slaughterhouse, Guangzhou, Hiina) ja viidi 2 tunni jooksul laborisse 0,9% soolalahuses temperatuuril 37 kraadi. Folliikulite vedelik 3-8 mm antraalsetest folliikulitest aspireeriti süstlaga, millele oli kinnitatud 18-mõõturnõel. Nagu eelnevalt kirjeldatud, kultiveeriti ligikaudu 50 kummuli munarakkude kompleksi (COC) 500 uL (IVM) söötmes, kaeti mineraalõliga ja kultiveeriti 44 tundi 38,5 kraadi juures 5% CO2 inkubaatoris niisutatud õhuga.

Cumuluse laienemise ja munarakkude IVM hindamine

Cumuluse laienemine registreeriti 44 tunni pärast IVM-i. Eelarvamuste kõrvaldamiseks tehti hindamine pimedaks. Iga COC kumulatsiooni laienemise astet hinnati vastavalt subjektiivsele punktisüsteemile skaalal O-4, kus 0 näitab, et laienemine puudub, 1 näitab minimaalset täheldatavat laienemist, 2 näitab, et välimised kummuli rakukihid, 3 näitab kõigi kummulirakkude kihtide, välja arvatud koroona radiata, laienemist ja 4 kõigi kummulirakkude kihtide täielikku laienemist.12 Keskmine punktisumma (0.0-4).{10 }}) arvutati seejärel iga rühma jaoks igas korduses (4-6 kordust), et saada väärtus, millele viidatakse kui kumulatsiooni laienemisindeksile. Esimese polaarse keha ekstrusioon ootsüütides määrati valgusmikroskoobi all. Ootsüüdid liigitati järgmiselt: ebaküpsed (ei jõudnud metafaasi), küpsed (esitati metafaasi I plaati ja polaarkeha) ja ebanormaalsed (mis tahes kromosomaalsed aberratsioonid, nagu diploidne, ebanormaalne metafaas I, mitmesuunaline spindel ja kromosoomide dispersioon). Munarakkude küpsemise määr arvutati järgmiselt: uuritud küpsenud munarakkude arv / munarakkude koguarv x 100 protsenti.

ROS tasemete määramine

Intratsellulaarse ROS-i sisalduse määramiseks inkubeeriti 30 küpset munarakku 20 minutit temperatuuril 38,5 °C fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), mis sisaldas 10 uM 2',7'-diklorofluorestseiindiatsetaadi fluorestsentssondi (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Hiina). . Seejärel pesti ootsüüte PBS-ga, millele oli lisatud 1 protsenti veise seerumi albumiini. Pildid jäädvustati konfokaalse mikroskoopiasüsteemiga (X71, Olympus, Jaapan) samade skaneerimisseadetega rühmade vahel. Fluorestsentsi intensiivsus arvutati Image.J tarkvaraga.

Antioksüdantide kogumahu test

Kogu antioksüdantide mahtu ootsüütides analüüsiti, kasutades Total Antioxidant Capacity Assay Kit'i ABTS-meetodil (Beyotime, Peking, Hiina) vastavalt tootja protokollile. ABTS-test mõõdab proovi kogu antioksüdantide võimet ja põhineb ABTS· pluss radikaalsel värvimuutusel. Katioonne radikaal ABTS· plus on kromofoor, mis neelab lainepikkusel 734 nm ja mis tekib ABTS(2,2'-ja-bis-(3-etüülbenstiasoliin-6-) ​​oksüdatsioonireaktsioonil. ammooniumsulfonaat) kaaliumpersulfaadiga.13

GSH sisalduse kvantifitseerimine

GSH sisaldust mõõdeti Total Glutathione Assay Kit (S0053, Beyotime, Peking, Hiina) abil vastavalt tootja juhistele. Selles komplektis kasutatakse bioloogiliste proovide glutatiooni (tGSH) üldsisalduse mõõtmiseks kineetilist ensümaatilist taaskasutusanalüüsi, mis põhineb GSH oksüdatsioonil 5,5'-ditiobis-(2-nitrobensoehappe) [DTNB] abil. Mikrotiiterplaadi süvenditesse lisatakse glutatiooni standardid või töödeldud proovid, seejärel DTNB ja glutatioonreduktaas. NADPH2 lisamine süvenditesse käivitab DTNB järkjärgulise redutseerimise GSH abil, põhjustades värvi suurenemist, mida jälgitakse 405 nm juures. Lühidalt öeldes külvati proovid 96-süvendiga plaatidele ja seejärel lisati igasse süvendisse 150 uL tuvastamislahust. Pärast proovide tasakaalustamist toatemperatuuril 5 minutit lisati 50 μL a-0,16 mg/ml NADPH lahust. GSH sisaldus määrati 5-tio-2-nitrobensoehappe mõõdetud väärtuse jagamisel igas proovis olevate munarakkude arvuga.

Malondialdehüüdi (MDA) taseme kvantifitseerimine

MDA taset munarakkudes analüüsiti MDA analüüsikomplekti (Beyotime) abil vastavalt tootja protokollile. MDA reageerib tiobarbituurhappega (TBA), saades punase ühendi, mille maksimaalne neeldumine on 532 nm juures. TBA reaktiiv valmistati, segades 0,2 ml SDS-i (8,1 protsenti), 1,5 ml äädikhapet (20 protsenti, pH=3,5) ja 1,5 ml TBA-d (0,8 protsenti). kokku, seejärel segati 100 uL iga homogeniseeritud munaraku proovi selle 200 uL TBA reagendiga. Segu inkubeeriti keevas veevannis 15 minutit ja seejärel jahutati jääl. Pärast jahutamist tsentrifuugiti segu kiirusel 4000 p/min 10 minutit. Supernatandi neeldumine määrati 532 nm juures, võrreldes pimekatsega.

In vitro viljastamine ja embrüo kultiveerimine IVF-katse viidi läbi nagu varem teatatud.14 Lühidalt, kohalikust tapamajast kogutud munarakke kultiveeriti 44 tundi ja denudeeriti 1 mg/ml hüaluronidaasi lahuses DPBS-is mehaanilise pipetiga; seejärel rühmitati 10-15 ootsüüdid ja kanti üle 50 μL TBM-i viljastamissöötmesse (113,1 mM NaCl, 3.0mM KCl, 7,5 mMCaCl2:2H2 O.2{{18}). }.{{20}} mM Tris, 11,0 mM glükoosi, 5,0 mM naatriumpüruvaati), mis sisaldab 2,5 mM kofeiini ja 2 mg/mL BSA-d (fraktsioon V), kaetud mineraalõliga. Guangxi Yangxiang Company Co. Ltd. (Guangxi, Hiina) värsket spermat (umbes 12 kuu vanuselt Duroc sigadelt, kellel on olnud mitu aretust) pesti kolm korda tsentrifuugimisega DPBS-ga, millele oli lisatud 0,1 protsenti BSA-d kiirusel 1500 pööret minutis. 4 minutiks. Spermatosoidi graanulid resuspendeeriti ja lahjendati TBM-iga 30 minutiks CO2 inkubaatoris mahutamiseks 1 × 10 kraadi sperma/ml. Seejärel lisati mahtuvuslikud spermatosoidid tilka sisaldavatele munarakkudele lõpliku spermakontsentratsiooniga 1 × 10 sperma/ml ja inkubeeriti 6 tundi 39 kraadi juures 5% CO2 atmosfääris. Pärast viljastamist pesti ootsüüte 3 korda PZM3 söötmega ja kultiveeriti PZM3 söötmega temperatuuril 39 °C; 5% O2, 5% CO2 ja 90% N2; ja 100 protsenti niiskust. Embrüonaalset lõhustumist ja blastotsüstide moodustumist hinnati vastavalt 48 tundi ja 6 päeva pärast viljastamist. Lõhustumise ja blastotsüstide määrade hindamise valemid olid järgmised: lõhustumise kiirus=lõhustumise arv/küpsenud munarakkude arv; blastotsüstide määr=blastotsüstide arv/küpsenud munarakkude arv.

Kvantitatiivne reaalajas PCR (qRTPCR) Kogu RNA ekstraheeriti küpsenud munarakkudest, kasutades Trizol reagenti (Invitrogen, USA) ja kvantifitseeriti neeldumise mõõtmisega 260 nm juures. RNA pöördtranskribeeriti cDNA-ks, kasutades HiScript"III-RT SuperMix komplekti (Vazyme, Nanjing, Hiina). Reaalajas PCR viidi läbi qTOWER³ termotsükleril (Analytik Jena, Saksamaa), kasutades ChamQrM Universal SYBR" qPCR Master Mix komplekti. (Vazyme). Tuvastatud geenide mRNA ekspressioonitasemed normaliseeriti GAPDH abil ja arvutati 2-AAc meetodi abil. Praimerite järjestused on näidatud täiendavas tabelis S1.

Statistiline analüüs

Kogu andmete analüüs viidi läbi R Statistical Software (versioon 3.6.3) abil. Kõik andmed esitati kui keskmine ± standardhälve. Erinevate ravirühmade vahelisi olulisi erinevusi hinnati permutatsioonitestide abil. P<0.05 was="" considered="" statistically="">

Tulemused

EGCG mõju kummuli laienemisindeksile

Esimese polaarse keha ekstrusiooniga küpsete munarakkude ja munarakkude morfoloogia, nagu on näidatud vastavalt lisajoonisel S1A ja S1B. Esiteks uurisime munarakkude kummuli laienemise indeksit pärast ravi erinevate kontsentratsioonidega EGCG-ga ja nagu on näidatud tabelis 1, suurendas EGCG kontsentratsioonil 5 ja 1 0 μM oluliselt kummuli laienemisindeksit võrreldes kontrollrühmaga. (5 μM rühm versus 0 μM rühm∶ 2,989 ±0.068 versus 2,438 ±0.081;10 µM rühm versus {{30}} μM rühm: 3,079±0,110 versus 2,438±0,081). Siiski ei mõjutanud EGCG 20 μM juures kumuluse laienemisindeksit, võrreldes kontrollrühmaga (20 μM rühm versus 0 μM rühm - 2,879 ± 0,076 versus 2,438 ± 0,081).

EGCG mõju munarakkude IVM-i kiirusele

Edasi määrati EGCG mõju munarakkude in vitro küpsemiskiirusele. Nagu on näidatud tabelis 2, oli munarakkude küpsemise määr kõrgem 5 ja 20 μM rühmas, võrreldes 0 μM EGCG kontrollrühmaga; samas kui erinevus ei olnud statistiliselt oluline (tabel 2). Teisest küljest suurendas 10 uM EGCG-ravi märkimisväärselt munarakkude küpsemise kiirust võrreldes O μM EGCG kontrollrühmaga (10 μM rühm versus 0 μM rühm∶58,63 ± 2,79 protsenti versus 46,27 ± 3,25 protsenti ;P<>

EGCG mõju munarakkude oksüdatiivsele stressile

EGCG-ga töödeldud munarakkude ROS-i tootmine määrati ROS-i tootmise testiga. ROS-i fluorestseeruvate signaalide tüüpilised kujutised munarakkudes pärast töötlemist erinevate kontsentratsioonidega EGCG-ga on näidatud joonisel 1A. Immunofluorestseeruva värvimise kvantifitseerimine näitas, et EGCG 5 μM juures ei mõjutanud ROS-i tootmist munarakkudes, võrreldes 0 μM kontrollrühmaga (joonis 1B). EGCG kontsentratsiooniga 10 ja 20 uM vähendas oluliselt munarakkude ROS-i taset võrreldes 0 μM EGCG kontrollrühmaga (joonis 1B).

Kuna EGCG kontsentratsioonis 10 μM võib suurendada kummuli laienemise indeksit ja munarakkude küpsemise kiirust ning samuti vähendada munarakkude ROS-i taset, valiti järgmisteks uuringuteks EGCG kontsentratsiooniga 10 μM. Nagu on näidatud joonisel fig 1C, suurendas EGCG 10 uM juures oluliselt munarakkude antioksüdantset võimekust võrreldes 0 µM kontrollrühmaga (joonis 1C). Lisaks tõusis glutatiooni tase, samal ajal kui MDA tase langes 10 μM EGCG-ga töödeldud munarakkudes (joonis 1D ja E).

Lisaks viidi läbi qRT-PCR oksüdatiivse stressiga seotud geenide, sealhulgas katalaasi (CAT), glutatioonperoksidaasi (GPx) ja superoksiiddismutaasi (SOD).EGCG mRNA ekspressioonitasemete määramiseks 10 μM juures oluliselt. reguleeris üles CAT, GPx ja SOD mRNA ekspressioonitasemeid võrreldes 0 μM kontrollrühmaga (joonis 2A-C).

EGCG mõju apoptoosiga seotud geenide mRNA ekspressioonitasemetele munarakkudes

qRT-PCR viidi läbi, et määrata apoptoosiga seotud geenide mRNA ekspressioonitasemed, sealhulgas

Joonis I EGCG mõju oksüdatiivsele stressile laagerdunud sea munarakkudes. (A) ROS-i fluorestsentssignaalide tüüpilised kujutised munarakkudes pärast töötlemist erinevate EGCG kontsentratsioonidega. (B) EGCG mõju munarakkude ROS-i tootmisele. EGCG mõju antioksüdantide võimele (C), glutatiooni kontsentratsioonile (D) ja MDA kontsentratsioonile (E) küpses munarakkudes määrati vastavate in vitro testidega. N=3; olulised erinevused tähistati kui * P<>

Bax, Bcl-2 ja kaspaas-3. EGCG 10 μM juures vähendas oluliselt Baxi ja kaspaasi-3 mRNA ekspressioonitasemeid ning suurendas Bcl-2 mRNA ekspressioonitaset võrreldes OμM kontrollrühmaga (joonis 3A–C). IVM-i ja IVF-i ajal kasutatava EGCG mõju munarakkude arengupotentsiaalile

Embrüote ja blastotsüstide tüüpilised kujutised on näidatud lisajoonisel SIC-S1E. MUNA

ravi IVF-i ajal suurendas kontrollrühmaga võrreldes oluliselt lõhustumise kiirust ja blastotsüstide määra (tabel 3). EGCG-ravi IVM-i ajal suurendas kontrollrühmaga võrreldes märkimisväärselt blastotsüstide määra, kuid mitte lõhustumise kiirust (tabel 3). Lisaks suurendas EGCG-ravi nii IVM-i kui ka IVC-i ajal märkimisväärselt lõhustamiskiirust ja blastotsüsti kiirust võrreldes ülejäänud kolme rühmaga (tabel 3). Need tulemused näitasid, et EGCG IVM-i ja IVF-i ajal võib soodustada munarakkude arengupotentsiaali.

IVM ja VC ajal kasutatava EGCG mõju munarakkude arengupotentsiaalile

EGCG-ravi IVC ajal vähendas oluliselt ootsüütide lõhustamiskiirust ja blastotsüstide määra, võrreldes rühmaga, kus EGCG-ravi ei ravitud (tabel 4). Teisest küljest suurendas EGCG-ravi IVM-i ajal märkimisväärselt munarakkude lõhustamiskiirust ja blastotsüstide kiirust, võrreldes rühmaga, kus EGCG-ravi ei olnud (tabel 4). EGCG-ravi IVM-i ja IVC-i ajal vähendas oluliselt ootsüütide lõhustamiskiirust ja blastotsüstide määra, võrreldes rühmaga, kus EGCG-ravi ei saanud, ja rühmaga, kes sai IVM-i ajal EGCG-ravi (tabel 4). Need tulemused näitasid ühiselt, et EGCG-ravi IVM-i ajal suurendas munarakkude arengupotentsiaali, samas kui EGCG-ravi IVC-i ajal nõrgendas munarakkude arengupotentsiaali.

Arutelu

The IVM technique for the COC has been developed and applied to produce offspring in mammals including pigs, however, the rate of blastocytes formation following IVF is still low using IVM oocytes compared with that of in vivo-matured oocytes such as pigs. In pigs, the COCs are usually collected from medium size antral follicles(>3 mm läbimõõduga), kus ootsüüdil on võime indutseerida munarakkude küpsemist, samas kui follikulaarsed somaatilised rakud ei omanda võimet reageerida ovulatsiooni stiimulitele. Lisaks suurendavad in vitro keskkonnad tavaliselt ROS-i rakkude tootmist, mida peetakse rakukahjustuste peamiseks põhjuseks.15 Seetõttu on ootsüütide normaalseks kasvuks ja küpsemiseks hädavajalik optimeerida kultiveerimistingimusi, et jäljendada in vivo keskkondi. Käesolevas uuringus lisati IVM, IVF ja IVC söötmele erinevad kontsentratsioonid EGCG-d.

jälgida munarakkude küpsemise kvaliteeti. EGCG kontsentratsioonis 10 uM parandab oluliselt sea munarakkude IVM-i. Selles uuringus annab EGCG lisamine IVF ja IVC ajal kahte erinevat mõju. 10 uM EGCG lisamine IVF-i ajal võib soodustada munarakkude lõhustumise kiirust, mis oli kooskõlas Spinaci jt leidudega, mis näitavad, et 10 uM EGCG lisamine IVF-i ajal, kuid mitte IVM-i ajal, suurendas oluliselt viljastamissagedust.17 EGCG IVF-i ajal võib olla tingitud selle toimest spermale, mitte munarakule.

In vitro kultiveerimise käigus puutuvad munarakud ja embrüod vältimatult kokku valguse ja kõrgema hapnikukontsentratsiooniga kui in vivo, mis võib viia RO-de (superoksiidi aniooni, vesinikperoksiidi ja väga reaktiivse hüdroksüülrühma) suurenenud tootmiseni. Paljud uuringud on näidanud, et antioksüdantide lisamine IVM söötmele võib parandada embrüo arenguvõimet. On leitud, et EGCG toimib antioksüdandina, mis vähendabkahjulikema hüpertermia mõju folliikuliga suletud munarakkudele hiirtel.' Barberino jt näitasid, et pärast lamba munasarjakoe in vitro kultiveerimist vähendas EGCG preantraalsete folliikulite apoptoosi fosfatidüülinositool-3-kinaasi/proteiinkinaasi B signaaliraja kaudu." Huang jt väitsid, et 50 μM EGCG võib parandada veise munarakkude küpsemist ja EGCG kaitsev roll võib olla korrelatsioonis selle antioksüdatiivse omadusega.6 Koos varasemate uuringutega näitasid meie tulemused, et EGCG mõju sea munarakkude IVM-ile võib olla seotud antioksüdandi ja apoptoosivastase toimega, mida käesolevas uuringus lähemalt uuriti.

ROS-i liigne akumuleerumine võib põhjustada oksüdatiivset stressi ja meie tulemused näitasid, et EGCG võib suurendada antioksüdantide koguvõimsust ja vähendada ROS-i ja MDA taset sea munarakkudes. See võib olla tingitud sellest, et EGCG võib ROS-i otse elimineerida ja/või EGCG võib toimida sünergistlikult antioksüdantide süsteemiga. Mitteensümaatilised süsteemid tuginevad ROS-i otseseks kustutamiseks molekulidele, samas kui ensümaatilised süsteemid koosnevad spetsiifilistest ensüümidest, mis detoksifitseerivad ROS-i. Viimases on SOD perekond oluline oksüdatiivse stressi reguleerimisel. SOD on ainus teadaolev ensüüm, mis eemaldab otseselt vabu radikaale, katalüüsides superoksiidi aniooni dismutatsiooni vesinikperoksiidiks. SOD ensüüm reguleerib rakkude poolt toodetud superoksiidi ja vesinikperoksiidi taset ning seejärel raku signaaliülekannet.1 Katalaas on oluline antioksüdant ja markerensüümperoksisoomidest. See moodustab 40 protsenti kõigist peroksisoomi ensüümidest. See on antioksüdantne oligomeer, millel on neli identset tetraeedritesse paigutatud subühikut ja see on oluline ensüüm, mis kaitseb rakke ROS-i oksüdatiivsete kahjustuste eest.20 Glutatioon on tripeptiid, mis koosneb glutamiinhappest, tsüsteiinist ja glütsiinist, mis sisaldab Y-amiidsidemeid ja sulfhüdrüülrühmi. See suudab säilitada normaalset immuunsüsteemi funktsiooni ja omab antioksüdantset toimet. Glutatioonperoksidaas (GPX) ühendab GSH oksüdatsiooni H, O ja detoksifitseerimisega.21 Uuringud näitasid, et kuumastress võib põhjustada bubaliini munarakkudes oksüdatiivset stressi, mis käivitab ROS-i elimineerimise antioksüdantse ensüümi kaitsesüsteemi poolt.22 Meie uuringud näitasid järjekindlalt, et EGCG vähenes. munarakkude ROS taset ja MDA sisaldust, suurendades samal ajal rakusisest GSH sisaldust ja kogusummatantioksüdantmahutavus.

Theapoptoosprotsess võib mõjutada selle kvaliteeti ja ellujäämise määramunarakudja seega mõjutada embrüonaalset arengut.23 Bcl-2 perekonna valgud mängivad võtmerolli rakusurma reguleerimisel proapoptootiliste ja antiapoptootiliste valkude liikmete tasakaalustatud interaktsiooni kaudu.24 Proapoptootiline valk Bax on imetajate tuum. mitokondriaalsest sõltuvast apoptoosist. Kaspaas{7}} mängib samuti asendamatut rolli raku apoptoosis. Kaspaas-3 on raku apoptoosi protsessis kõige olulisem terminaalne splaissimise ensüüm ja aktiveeritud kaspaas-3 on raku apoptoosi peamine elluviija. Meie tulemused näitavad, et EGCG reguleeris Bcl{11}} mRNA ekspressioonitaset üles, kuid vähendas Baxi ja kaspaasi{12}} mRNA ekspressioonitaset. Need tulemused viitasid ühiselt sellele, et EGCG antioksüdant ja apoptootiline toime sea munarakkudes on suures osas seotud SOD1, CAT ja GPX regulatsiooniga, samuti apoptoosiga seotud geenidega.

See artikkel on välja võetud ajakirjast Drug Design, Development ja Therapy