Perfusioonisurve mõju podotsüütide kadumisele isoleeritud perfundeeritud hiire neerus
Mar 13, 2022
Abstraktne
Taust/eesmärgid: Podotsüüdid kaovad enamikus glomerulaarsetes haigustes, mis põhjustab glomeruloskleroosi ja progresseeruvatneeruhaigus. Üldiselt eeldatakse, et podotsüüdid puutuvad kokku filtreerimisvooluga ja seega oluliste nihkejõududega, mis juhivad nende eraldumist glomerulaarsest keldrimembraanist (GBM). Sellega seoses on välja pakutud jalaprotsessi kustutamine võimaliku adaptiivse vastusena, et suurendada podotsüütide kleepumist GBM-iga. Meetodid: Oleme testinud neid hüpoteese optilise kliiringu ja kõrge eraldusvõimega 3-mõõtmelise morfomeetrilise analüüsi abil isoleeritud perfundeeritud muriinisneer.Me uurisime podotsüütide eraldumise dünaamikat erinevatel perfusioonisurvetel (50, 300 ja rohkem kui 450 mmHg) tervetel noortel või vanadel hiirtel (20 vs 71 nädalat vanused) või hiirtel, kellele süstiti ANTI-GBM seerumit, et kutsuda esile ülemaailmset jalaprotsessi hävimist. Tulemused: Tulemused näitavad, et noorte hiirte terved podotsüüdid on GBM-i külge tihedalt kinnitatud ja isegi supramaminaalne rõhk ei põhjustanud märkimisväärset eraldumist. Võrreldes noorte hiirtega oli vananenud hiirtel ja hiirtel, kellel oli anti-GBM nefriit ja jalgade protsessi kustutamine, podotsüütide järkjärguline järkjärguline progresseeruv kadu juba enne perfusiooni. Kõrge perfusioonisurve põhjustas vananenud hiirtel podotsüütide suhteliselt väikese täiendava kadumise. ANTI-GBM nefriidiga hiirtel tekkis märkimisväärne täiendav podotsüütide kadu sel varajasel ajal, kui perfusioonisurve tõsteti 300 mmHg-ni või kõrgemale. Järeldus: See töö annab esimesed eksperimentaalsed tõendid selle kohta, et podotsüüdid on erakordselt vastupidavad ägedalt suurenenud perfusioonirõhule isoleeritud eksvokvasneerperfusioonimudel. Ainult glomerulaarse haiguse korral eraldus märkimisväärne hulk vigastatud podotsüüte pärast perfusioonirõhu ägedat suurenemist.
Märksõnad:Glomerular hüpertensioon; Glomerular hüperfiltratsioon; Mehaaniline stress; Progressioon; Krooniline neeruhaigus
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
Sissejuhatus
Glomerular hüpertensioon ja hüperfiltratsioon kahjustavad glomerulust, mis viib progresseeruva glomerulaarse haiguseni. Laialdaselt arvatakse, et suurenenud perfusioonirõhk seab tufti suurenenud mehaanilisele stressile, mis vaidlustab podotsüütide kleepumise glomerulaarse keldrimembraaniga (GBM), aidates kaasa nende eraldumisele [1, 2]. Podotsüüdid on väga diferentseerunud post-mitootilised rakud, mis on olulised terve glomerulaarse filtreerimise barjääri jaoks. Podotsüütide kadu on tõenäoliselt tingitud elujõuliste rakkude eraldumisest GBM-ist, mitte apoptoosist või nekroosist[ 3-6], kuna patsientide uriinist taastunud podotsüüte on olnud võimalik kasvatada [4]. Elujõuliste podotsüütide eraldumine GBM-ist võib tuleneda kinnitusmehhanismide või altemehaaniliste jõudude halvenemisest. GBM-i külge kinnitamise halvenemine võib olla tingitud rakukahjustusest või adhesioonimolekulide vähenenud ekspressioonist ning on peamiselt seotud põletikuliste glomerulaarsete haigustega. Podotsüüti jaoks oluliste mehaaniliste jõudude puhul on kaks peamist määrajat, nimelt filtreerimisrõhk ja filtraadivool [7-9]. Filtreerimisrõhk tekitab seina ümbermõõdu stressi ja toimib GBM-i distendeeriva jõuna. Transmuraalse hüdrostaatilise rõhu erinevusi kompenseerib tõhusalt GBM-i võime toimida elastse membraanina ja laieneda või kahaneda pindalas [8, 10]. Teisest küljest avaldab filtraadivool üle GBM-i podotsüütide pinnale tangentsiaalseid jõude, st nihke stressi. Me teame in vitro uuringutest, et podotsüüdid on väga vastuvõtlikud nihke stressi eraldumisele nende substraadist, kui nad puutuvad kokku nihkepingetega rohkem kui 0,025 Pa [11] ja võttes kasutusele vahepealse fenotüübi, mis võib aidata neil voolust saadud jõudude vastu võidelda [12]. Kas glomerulaarne hüpertensioon mõjutab podotsüüte suurenenud filtreerimisrõhu ja / või suurenenud filtreerimise kaudu, jääb veel ebaselgeks. Selles uuringus esitame esimese analüüsi podotsüütide võime kohta seista vastu suurenenud mehaanilistele jõududele ex vivo mudelis. Podotsüütide kadu kvantifitseeriti kõrge eraldusvõimega, kasutades kudede puhastamist ja 3-mõõtmelist morfomeetrilist analüüsi noortel ja tervetel hiirtel.
Materjalid ja meetodid
Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt Saksamaa loomade heaolu seaduse suunistele ja need kiitsid heaks Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02.04). 2015.A469). Hiiri hoiti konkreetses patogeenivabas rajatises, kus oli vaba juurdepääs chow'le ja veele ning 12-tunnine päeva/ öö tsükkel. Aretus ja genotüpiseerimine toimus standardprotseduuride kohaselt. Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP hiiri FVB/N geneetilisel taustal on kirjeldatud juba varem [13]. Pod-rtTA-eGFP transgeense ekspressiooni aktiveerimiseks said hiired doksütsükliini joogivee ad libitumi kaudu 7 päeva (2 g/l, 5% sahharoosi, kaitstud valguse eest), millele järgnes 1 nädala pikkune pesemisperiood nagu eelmiste aruannete kohaselt. Anti-GBM nefriit indutseeriti ühe intraperitoneaalse süstiga 5 mg/g kehakaalu nefrotoksilise seerumiga, nagu eespool kirjeldatud [14].
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI
Neeru perfusioon
Isoleeritudneerperfusioonimudelit kasutati mujal kirjeldatud viisil [15]. Lühidalt öeldes narkootiliseeriti hiired ksülasiini/ketamiini intraperitoneaalse süstimisega (0,1ml/10g kehakaalu ehk 10 g kehakaalu ehk p.p.) süstimisega ja seejärel imbuti neerud keeruka modifitseeritud Krebs-Henseleit-lahusega (tabel 1), millele lisandus 5% veiste seerumi albumiin (BSA) 37 °C juures, et jäljendada katse ajal füsioloogilist miljööd. Maksimaalne vasodilatatsioonneerVaskulaarsus indutseeriti 1 poolt. verapamili (50μl) nahaalune süstimine kohe pärast anesteesia sisseelamist ja 2. papaveriini lisamine perfusioonilahendusele. Pärast esialgset perfusiooni 5 minutit 50 mmHg juures, fluorestseeruvalt märgistatud lektiin (Kommunism I - RCA120; Vektorlaborid: RL-1082; 4 μl 986 μl soolalahuses) süstiti endoteelirakkude märgistamiseks.Neerudläbistati veel 5 minutit modifitseeritud Krebs-Henseleit-lahusega 5% BSA-ga. Pärast seda vasakpoolsedneermis oli seotud kontroll igas katses eemaldati pärast vasaku hoolikat ligeerimistNeeruanumad lõigatakse viiludeks ja kastetakse otse 3% paraformaldehüüdi (PFA) fosfaadipuhvriga soolalahuses (PBS). Parempoolneneerperfundeeriti kas täiendavaks 5 minutiks 300 mmHg juures või supramaximaalrõhul (>>300mmHg, filtreerimisrõhk oli hinnanguliselt tublisti üle 400 mmHg), mida rakendati käsitsi, kogumaht 50 ml perfusioonilahust. Neerudläbistati pideva rõhuga 50 mmHg või 300 mmHg, kasutades rõhuga juhitavat pumpa (Universal Perfusion Systems UP-100, Hugo-Sachs Electronics, Saksamaa). Siis parempoolneneereemaldati, lõigati 2 mm viiludeks ja kasteti fosfaadi puhverdatud soolalahuses (PBS) 3% paraformaldehüüdi (PFA).
3D-pildistamine ja arvutusanalüüs PFA-kastetudneerviilud inkubeeriti mehaanilisel loksutil 5 päeva toatemperatuuril. Seejärel pesti fikseeritud proove 1x PBS-is ja asetati toatemperatuuril üleöö mehaanilisele loksutile.Neerseejärel paigutati viilud kõrge kvaliteediga 100% etanooli (Merck; 100983) 1 tunniks toatemperatuuril õrna raputamisega (vähemalt 1 muutus värskeks etanooliks), millele järgnes otsene keelekümblus Etüülkanemaatis (ECi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) ja jäeti valguse kaitse all toatemperatuuril ööseks õrna loksutisse. Kudede läbipaistev toime saavutati vähem kui 1 tunni jooksul. Püstiste mikroskoopide puhul kasutasime varem kirjeldatud ühekordselt kasutatavaid majas ehitatud kambreid [16]. Enamik katseid viidi läbi 2-footonilise mikroskoobi abil (LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Core Facilities). Fidži pildindustarkvara kasutati iga jadaoptiliste sektsioonide virna Z-telje liikumiseks ja üksikute glomerulite isoleerimiseks 3D kärpimise kaudu [16]. 40 glomeruli perneer(Analüüsiks valiti 20 subkortikaalset ja 20 kõrvutamist). Seega analüüsiti selles uuringus kokku 1200 glomerulit, et saada tulemusi piisava täpsusega. Podotsüüdid tuvastati kui eGFP + rakud. Kapillaaride mahu, glomerulaarse helitugevuse, tuumade arvu (punktid) ja helitugevuse kvantifitseerimine toimus 3D-renderdamis- ja analüüsitarkvara abil (Imaris v9.1; Bitplane AG, Zürich, Šveits) Podotsüütide kaugus vaskulaarsest poolusest arvutati Bitplane XTensioni "Spot Closest. Kaugus". Podotsüütide automaatne kvantifitseerimine viidi läbi nii, nagu eelnevalt kirjeldatud [17]. Pildianalüüs viidi läbi Imarise abil (Biplane AG Zürich, Šveits). Iga glomerulus oli määratletud selle lektiiniga märgistatud aferentse arteriooliga. 20 subkortikaalset ja 20 jukstamedullary (määratletud nende kaugusega kortikaalsest pinnast).
CISTANCHE PARANDAB NEERU- / NEERUVALU
Kerge mikroskoopia ja immunofluorestsents
Kerge mikroskoopia puhul on 4% puhverdatud formaliini fikseeritudneerfragmendid dehüdreeriti, manustati parafiini ja värviti perioodilise happe-Schiffiga (PAS). Ebanormaalsete/vigastatud glomerulite protsent arvutati 50 tüüpilise glomerulaarse ristlõike tuvastamise põhjal hiire kohta, mis valiti süstemaatilisel jalutuskäigul üleNeeruCortex. Meie standardne immunofluorestsentsprotokoll [18] viidi läbi 2 μm parafiiniga manustatud sektsioonidel. Kasutati järgmisi antikehi: kana polüklonaalne anti-GFP (ab13970; Abcam), hiire monoklonaalne sünaptotopodiin (sc-515842; Santa Cruz Biotechnology), polüklonaalne küüliku hiirevastane p57 (sc-8298; Santa-Cruz Biotechnology), küüliku polüklonaalne anti-WT1 (sc-192; Santa-Cruzi biotehnoloogia), Cy2 eesel kanavastane (703-225-155; Dianova, Hamburg, Saksamaa), Alexa Fluor546 kitse hiirevastane IgG1(A-21123; Thermo Fischer), polüklonaalne eesel küülikuvastane AF555 (A31572; Life Technologies, Carlsbad, CA).
Elektronmikroskoopia
Väikesed ajukoore tükid kinnitati Karnovski-lahusesse ja integreeriti Eponisse (Serva, Heidelberg, Saksamaa). Ultratiini sektsioone uuriti ülekande elektronmikroskoobiga ZEISS Leo 906 60 kV juures suurendusega 3597-6000x. Proovid pesti 0,1 M Soerenseni fosfaadis (Merck, Darmstadt, Saksamaa), mis fikseeriti 1% OsO 4-s (Roth, Karlsruhe, Saksamaa) 17% sahharoosipuhvris (Merck, Darmstadt, Saksamaa) ja dehüdreeriti tõusva etanooli seeriaga (30, 50, 70, 90 ja 100%) 10 minuti jooksul. Viimast sammu korrati kolm korda. Veetustatud isendeid inkubeeriti propüleenoksiidis (Serva, Heidelberg, Saksamaa) 30 minutit, Eponi vaigu (Serva, Heidelberg, Saksamaa) ja propüleenoksiidi (1:1) segus 1h ja lõpuks puhtas Eponis 1h. Epon polümerisatsioon viidi läbi 90 °C juures 2h. Ultrathin lõigud (70-100 nm) lõigati ultramikrotoomiga (Reichert Ultracut S, Leica teemantnoaga (Leica) ja korjati Cu/Rh võrkudesse (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar Germany). Kontrasti suurendas värvimine 0,5% uraanhappeatsetaadi ja 1% pliitsitraadiga (mõlemad EMS, München, Saksamaa). Proove vaadeldi kiirenduspingel 60 kV, kasutades Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksamaa) ülekande elektronmikroskoobi.
Statistiline analüüs
Statistilised analüüsid tehti GraphPad Prism v8 tarkvaraga. Kõiki väärtusi väljendatakse SD ± vahenditena. Kahe rühma võrdlemiseks kasutati t-testi. Mitme rühma võrdlemisel kasutati dispersiooni analüüsi; post hoc Tukey parandust kasutati mitme võrdluse jaoks. Kõik testid olid kahe sabaga ja statistiline tähtsus määratleti kui P<>
Tulemused
Poolautomaatne meetod podotsüütide arvu määramiseks glomeruluse kohta Uuriti kolme rühma, st terveid noori ja vanu hiiri ja hiiri, kellel oli anti-GBM glomerulonefriit (♂: ♀ 1:1). Noored terved hiired olid 15-21 nädala vanused, samas kui vanad (vanuses) olid 74 nädalat vanad. Ülemaailmne jalgade protsessi eemaldamine indutseeriti 14-20 nädala jooksul ol hiirtel ühe GBM-vastase seerumi süstimise kaudu 3 päeva enne isoleeritud perfundeeritudneermudel (joonis 1A), nagu eelnevalt kirjeldatud [19].
Neerupealiste perfusioonisurve mõju määramiseks podotsüütidele,Neerudisoleeritutesneerperfusioonimudel. Esiteks, mõlemadNeerudoli alati perfundeeritud 50 mmHg juures 5 minutit. Et kontrollida, kas meie perfusioonilahus säilitas glomeruluse terviklikkuse elujõulises fikseerimataNeerud, 2 hiirt läbistati konstantse rõhu all 100 mmHg 90 minutit. Perfusioon, kuseteede vool (25 μl/min/ gr kehakaalu kohta) ja inuliini kliirens (22 μl/min) püsisid kogu aeg stabiilsena (lisakuju 1 – kogu lisamaterjali kohta vtwww.cellphysiolbiochem.com).Eksperimentaalhiirtel, pärast esialgset perfusiooni 50 mmHg juures, vasakneereemaldati ja seda kasutati kontrollina kõigis katsetes. Seejärel rakendati ülejäänud paremale konstantset rõhku 300 mmHg või rõhku, mis oli oluliselt suurem kui 300 mmHg (>>300 mmHg; supramaximaalne filtreerimisrõhk umbes 450 –500 mmHg).neer5 minutit (joonis 1B). Isoleeritud perfundeeritudNeerud, tuvastati podotsüüdid eGFP-histooniga tuumamärgistuse abil meie transgeensetel hiirtel, kes väljendasid eGFP-d podotsiini promootori all (eGFP:Pod-rtTA hiired). Podotsüütide arvu kvantifitseeriti selle in vivo metaboolse märgistuse ja 3D morfomeetria kombinatsiooni abil (joonis 1C).
Podotsüütide kadu tervetel ja vananenud hiirtel
Terved hiired sisaldasid algtasemel 87,46 ± 5,66 (SD) podotsüüti glomeruluse kohta (i.e.at füsioloogiline perfusioonirõhk 50 mmHg) (joonis 2A). Juxtamedullary glomeruli olid suuremad kui välimises ajukoores (täiendav joonis 2), kuid seda ei seostatud suuremate podotsüütide arvuga (vastavalt 87,0± 23,65 vs 90,1 ± 18,49, Fib 2B). Suguga seotud podotsüütide arvu erinevusi ei täheldatud (vt allpool). Noortel hiirtel ei olnud podotsüütide olulist kadu vastavalt kõrgel (300 mmHg) või maksimaalsel (>>300 mmHg) perfusioonirõhul (85,62 ± 10,83 ja 81,98 ± 6,45 podotsüüti glomeruluse kohta) (joonis 1A). PAS-i sektsioonides täheldati kerget histoloogilist changwere'i eriti vananenud hiirtel (joonis 2A), mis ei sõltunud perfusioonirõhust. Lisaks ilmnes perfusiooni tagajärjel torukujuline laienemine ja interstitsiaalne turse. Inimestel on vanemat vanust (53 ± 10 aastat) seostatud absoluutse ja suhtelise podotsüütide ammendumisega [20]. Võrreldes noorte hiirtega sisaldasid meie 72 nädala vanused hiired algtasemel oluliselt väiksemat podotsüütide arvu glomeruluse kohta (52,81 ± 13,8 SD), mis näitab, et umbes 40% podotsüütidest oli kadunud. Perfusioon kõrge või maksimaalse rõhu korral põhjustas podotsüütide arvu väga kerge vähenemise (vastavalt 48,65 ± 16,8 SD ja 41,06 ± 17,7 SD). Loendamismeetodi täpsuse tõttu (absoluutsed podotsüütide arvud 40 glomerulis hiire kohta) [21], podotsüütide kadumine 7,9% ja 22% pärast perfusiooni vastavalt 300 või >>300 mmHg-ga võrreldes lähtejoonega viitab sellele, et see podotsüütide kadude väike suurenemine suurema rõhuga ei ole juhuslik leid. PAS-i sektsioonides täheldati ravieelsetel vananenud hiirtel kergeid glomerulaarseid muutusi (mesangiaalne laienemine ja juhuslik skleroos, joonis 2F). A
Podotsüütide kaotus pärast ägedat vigastust
Anti-GBM seerumit rakendati noortele tervetele hiirtele, et tekitada podotsüütidele olulisi ja spetsiifilisi vigastusi. Väga varajases ajapunktis (st 3 päeva) pärast ANTI-GBM glomerulonefriiti induktsiooni täheldati üldistatud jalaprotsessi effacementi kõigis glomerulites ülekande elektronmikroskoopia abil (joonis 3A-D). Isoleeritud perfundeeritudNeerudsaadud nendest hiirtest, vähenesid algtasemel (st perfusioon 50 mmHg-ga) podotsüütide arv glomeruluse kohta kontrollidega võrreldes 20% (vastavalt 69,76 ± 7,07 vs 87,46 ± 5,66) (joonis 3E). Suurema rõhuga perfusioon (vastavalt 300 ja >>300 mmHg) vähendas märkimisväärselt podotsüütide arvu glomeruluse kohta (vastavalt 50,84 ± 7,82 ja 53,18 ± 4,26), st 27% ja 24% täiendavat vähendamist (joonis 3E). Üksikute glomerulite analüüsimisel põhjustasid GBM-vastased hiired perfusioon >>300 mmHg-ga rohkem kui 80% podotsüütide kadu glomeruli vähemuses (joonis 3E). See on kooskõlas GBM-i vastase haiguse mudeli fokaalse iseloomuga. Juxtamedullary glomerulis oli podotsüütide kadu tugevam võrreldes subkortikaalse glomeruliga (vastavalt 56,66 ± 16,9 ja 47,35 ± 17,07) (joonis 3F) (joonis 3F)
Ülekandeelektronmikroskoopia (TEM) abil täheldati spetsiifilisi muutusi pärast suurt perfusioonisurvet, eelkõige fokaalpodotsüütide eraldumist GBM-ist ja alasti keldrimembraanist (Fig.3D). Rakujäätmed olid nii kapillaarides kui ka Bowmani ruumis (>>300 mmHg); endoteel ei näidanud olulisi muutusi. PAS värvimine tuvastas torukujulise laienemise. Kolm päeva pärast GBM-vastase seerumi süstimist ei olnud veel tekkinud poolkuu kahjustusi (joonis 3G-I). Meestel oli naistega võrreldes suurem podotsüütide kadu (63,71 ± 2,11 vs 75,81 ± 3,83 podotsüüti glomerulus kohta), mis on kooskõlas tähelepanekuga, et mal hiired on vastuvõtlikumad ANTI-GBM antiserumile ja moodustavad haiguse käigus rohkem rakulisi poolkuusid (joonis 3J). Kuid podotsüütide täiendav kadu pärast suurt perfusioonisurvet oli meestel ja naistel sarnane (joonis 3J).
Joonis 3. Podotsüütide kaotus pärast ägedat vigastust. (A-B) Ülekande elektronmikroskoopia juhtelemendistneermadala rõhu all sulatatud ja pärast supramaminaalset rõhku (>>300 mmHg) näitab normaalset jalaprotsessi arhitektuuri. (C-D) Ülekandeelektronmikroskoopia näitab tüüpilist jalgade protsessi eemaldamise leidmist pärast GBM-vastase seerumi süstimist algtasemel. Pärast kõrgema rõhuga perfusiooni täheldati alasti keldrimembraani alasid. (E) podotsüütide koguarv hiire kohta GBM-i-vastastel hiirtel algtasemel ja alla selle (300 mmHg) või supramaximaalrõhul (>> 300 mmHg); (iga ring tähistab 1 neeru; n = 7 kontroll neerud 50mmHg, n = 8 anti-GBM neerud 50mmHg, n = 4 neerud 300 mmHg või >> 300mmHg). (F) Podotsüütide koguarv glomeruluse kohta jukstamedullaarses ja subkortikaalses glomerulis; iga ring tähistab 1 subkortikaalset glomerulust (n = 20 glomeruli pro hiirt) ja iga kolmnurk tähistab 1 kõrvutatuddullaarset glomerulust (n = 20 glomeruli pro hiirt). (G-I) ANTI-GBM hiirte histoloogiline värvimine algtasemel tuvastas valguvalud, samas kui kolm päeva pärast GBM-vastase seerumi süstimist ei leitud poolkuu kahjustusi. Pärast kõrgema rõhuga perfusiooni täheldati tubule-interstitsiaalset dilatatsiooni ja turset. j) podotsüütide koguarv hiire kohta meeste ja naiste vahel; iga ring tähistab 1 neeru (n = 4 kontroll neerud 50mmHg, n = 4 anti-GBM neerud 50mmHg, n = 2 neerud 300 mmHg või >> 300mmHg). Mitme võrdluse puhul ANOVA. P<0.0001, ***p ="">< 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">
Kadunud podotsüütide jälgimine tubulites
eGFP+ podotsüüte täheldati regulaarselt proksimaalsete tubulite luumenis, kus nad näisid kinni pidavat proksimaalsete torurakkude harjapiirist (joonis 4A). Neid podotsüüte ei pestud hüperperfeeritudneers, selle asemel kleepusid nad üsna tihedalt harja piirile, et taluda primaarse uriini erakordset voolu väga kõrge perfusioonirõhu korral. Oma identiteedi kinnitamiseks värviti podotsüüdid podotsüütide spetsiifiliste markeritega (st p57, sünaptotopodiin ja WT-1) lisaks geneetilisele liini jälgimise markerile tuuma eGFP (joonis 4B). Podotsüütide arv oli nendes glomerulites oluliselt väiksem, kui seotud proksimaalses tubules olid kleepuvad podotsüüdid, ja podotsüütide olemasolu tubulites korreleeris pöördvõrdeliselt podotsüütide arvuga glomerulus (joonis 4C).
Podotsüütide eeliskaotus perihilar asukohas
Lõpuks uurisime, kas perfusioonirõhu ägedast suurenemisest tingitud podotsüütide kadu võib esineda glomeruluse sooduskohtades (st vaskulaarse pooluse ja glomerulaarse tufti torukujulise pooluse juures). Podotsüütide eraldumise ruumilise jaotuse analüüsimiseks märgiti vaskulaarne poolus igasse glomerulusse (omandatud 3D-s) lektiini signaali põhjal ja iga podotsüüti kaugus vaskulaarsest poolusest määrati poolautomaatselt. Üksikud kaugused vaskulaarsest poolusest eraldati kvartiilideks (joonis 4E). Nagu joonisel 4E kujutatud, on enamik podotsüüte koondunud kahte keskmisesse kvartiili (st kvartiili 2 ja 3). Vähem kui 12 % podotsüütidest paiknes kas esimeses, st vaskulaarses pooluses või neljandas kvartiilis, st vaskulaarsest poolusest kõige kaugemal. Perfusiooni korral rõhuga >> 300 mmHg ei täheldatud noortel ja tervetel hiirtel olulisi muutusi podotsüütide spacial jaotuses. Vananenud hiirtel suurenesid üldiselt podotsüütide kaugused vaskulaarsest poolusest, mis tõenäoliselt peegeldas glomerulaarset hüpertroofiat, samas kui hüperperfusioon põhjustas vaskulaarse pooluse lähedal olevate podotsüütide eelisseisundi eraldumise (1. kvartiil vähenes 11,5%-lt 4,9%-le vananenud hiirtel, joonis 4E). Samamoodi täheldati vaskulaarse pooluse lähedal asuvate podotsüütide eelistatavat eraldumist eemaldatud podotsüütides (anti-GBM, 1. kvartiil vähenes 25-lt 5% -le).
Arutelu
Selles uuringus uurisime kõrgendatud filtreerimisrõhu ja filtreerimisvoolu ägedat mõju podotsüütide kadumisele isoleeritud perfundeeritud muriini neerus, kasutades praegu kõige täpsemat meetodit podotsüütide arvu määramiseks. Meie uuringu esimene suur järeldus oli see, et terved podotsüüdid ei ole in vivo ägeda nihke stressi suhtes vastuvõtlikud, nagu varem näitasid rakukultuuri uuringud [11]. Meie üllatuseks ei põhjustanud isegi äärmuslik suprafüsioloogiline rõhk (üle 450 mmHg) märkimisväärset podotsüütide eraldumist. Pigem näitas ülekande elektronmikroskoopia, et kõik kolm filtreerimisbarjääri kihti jäid suhteliselt hästi säilinud. Vanematel hiirtel oli vähenenud podotsüütide arv (nagu varem teatatud) ja see oli seotud ainult väga piiratud suurenenud vastuvõtlikkusega kõrge perfusioonirõhu suhtes. Teine suur järeldus oli see, et eelnev podotsüütide vigastus muutis podotsüüdid vastuvõtlikuks eraldumisele kõrge perfusioonirõhu korral. GBM-vastased hiired näitasid globaalseid jalaprotsesse kolm päeva pärast GBM-i antiserumi süstimist ja märkimisväärseid numbreid, mis eraldusid kõrge perfusioonirõhuga. Vananenud hiirtel oletame, et podotsüütide füsioloogia on suhteliselt hästi säilinud, muutes need eraldumise suhtes vähem vastuvõtlikuks. Poolautomaatset loendamismeetodit rakendades analüüsiti iga glomerulust eraldi (analüüsiti kokku 1200 glomerulit). Me kinnitasime, et kõrvutatud glomeruli maht on suurem kui subkortikaalsel glomerulil. Huvitav on see, et podotsüütide arv oli sama, mis näitab, et podotsüütide tihedus väheneb jukstamedullaarses glomerulis. Lisaks olid kõrvutatud glomerulid haavatavamad ka suurenenud filtreerimisrõhu suhtes võrreldes subkortikaalse glomeruliga. Need leiud võivad osaliselt seletada, miks FSGS-i kahjustusi võib täheldada suurema sagedusega nii suuremates glomerulites [22, 23].
Joonis 4. Podotsüütide tuvastamine külgnevas prox. a) Esinduslik pilt, millel on kujutatud eGFP+ podotsüüte (roheline) tubulites. b) Transgeeni histooni eGFP (roheline) ja endogeensete podotsüütide p57 (punane), wt-1 (punane) ja sünaptotopodiini (lilla) poolt märgistatud podotsüütide immunofluorestsentsvärvimine. C) Podotsüütide arvu seos glomeruluse kohta tubulis tuvastatud podotsüütide arvuga (kontrollhiirtelt n=81 glomeruli, vananenud hiirtelt n = 41 glomeruli ja anti GBM hiirtelt n = 81 glomeruli). Mitme võrdluse puhul kasutati ANOVA-d. P<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">
Selle uuringu piiramine on lühike vaatlusperiood, kuna ei saa teha järeldusi podotsüütide pikaajalise kohanemise kohta suurenenud filtreerimissurvega. On tehtud ettepanek, et nihkepingega kokkupuutuvate podotsüütide esimene reaktsioon on läbi viia kaitsvad struktuurimuutused [8, 24]. Nende muudatuste hulka kuuluvad filtreerimislõhede (st FPE) kadumine ja pilu-diafragmade asendamine ummistuste või tihedate ristmikega. Okludeerivaid ristmikke on varem kirjeldatud mitmes glomerulaarse haiguse mudelis [25-28]. Kuid meie uuringus täheldasime, et FPE-ga podotsüüdid olid vastuvõtlikumad suurema perfusiooni = rõhu suhtes. Seega näitasid meie tulemused, et need adaptiivsed muutused ei olnud piisavad, et kaitsta eraldumise või potentsiaalselt isegi vastupidi, et nad muudavad podotsüüdid eraldumisele vastuvõtlikumaks. Järgmisena võib väita, et isoleeritud perfundeerisneersee ei ole füsioloogiline süsteem ja et rakendatud rõhk oli palju suurem kui in vivo tingimustes. Meile teadaolevalt ei kasuta ükski teine mudel puutumatut elujõulist mudelit.neeron olemas, mis võimaldaks otseselt uurida suurenenud perfusioonisurve mõju. Vasodilataatorite pealekandmisega enne perfusiooni ja selle ajal on preglomerulaarsete anumate maksimaalne laienemine indutseeritud, et võimaldada piiramatut voolu (hüperfiltratsioon) ja suurenenud perfusioonirõhu maksimaalset ülekandumist glomerulusse. Käesolevas uuringus uuriti kõrgema perfusioonisurve ägedat mõju. Patoloogilise hüperperfusiooni pikaajalised mõjud võivad olla kahjulikumad, põhjustades veelgi rohkem podotsüütide kadu. Kuid meie uuring näitab, et see krooniline podotsüütide kadu ei ole tingitud filtreerimisvoolu suurest jõust iseenesest, vaid pigem podotsüütide (mal-) adaptiivsetest muutustest, mis vähendavad nende vastavust GBM-ile. Glomerulaarsete haigustega patsiendid saavad antihüpertensiivsest ravist kasu, ennetades podotsüütide (mal-)adaptiivseid struktuurimuutusi.
Järeldus
See töö annab esimese in vivo tõendeid selle kohta, et terved podotsüüdid on tervete hiire neerudes erakordselt kindlalt GBM-iga seotud ja võivad vastu seista isegi väga kõrgele perfusioonirõhule. Vananemine või veelgi tugevam äge podotsüütide vigastus globaalse effacementiga muudab podotsüüdid vastuvõtlikuks eraldumisele suurenenud perfusioonisurve korral.