Cistanche glüeosiidide mõju kognitsiooni ja sünaptilise plastilisuse õppimisele unehäiretega mudelrottidel

KOKKUVÕTE

Eesmärk: "Uurida, kascistanche glükosiididsaab parandadaunepuuduse õppimine ja kognitiivne funktsioonmudel rotid pooltreguleerib sünaptilist plastilisust. Meetodid: viiskümmend isast Wistari rotti jagati juhuslikult tühjaks kontrollrühmaks (kontroll), platvormi kontrollrühmaks (PC), mudelrühmaks (mudel),Tistanche rühma glükosiidid( GCs) ja estasolaami rühm ( Est). Rottide unepuuduse mudel valmistati modifitseeritud mitmeplatvormilise veekeskkonna meetodil. Rottide tuvastamiseks kasutati Morrise veelabürinti ja avamaa testiruumiline kognitiivne funktsioon aja emotsionaalsed muutused. Muutuste jälgimiseks kasutati Nissli värvimistnärvirakkude morfoloogia ja hulkrottide hipokampuse CAl piirkonnas. Western blot ja R'T-PCl kasutati sünaptofüsiini (SYN), postsünaptilise membraantiheda aine 95 (PSD - 95) ja ajust pärineva neurotroofse faktori (BDNF) ekspressioonitasemete tuvastamiseks. Tulemused: Morrise veelabürindi tulemused näitasid, et võrreldes kontrollrühmaga,õppimisvõime ja kognitiivne võimerottide arv mudelirühmas oli oluliselt vähenenud (P<0. 05 ), and theRottide õppimis- ja mälufunktsioonparanes GC-ravi (P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

Järeldus: Tistanche glükosiididvõib mõjutada sünaptilist plastilisust, reguleerides sünaptiga seotud markerite ekspressiooni, parandades seeläbi unepuuduse mudelrottide õppimist ja kognitiivset funktsiooni.

MÄRKSÕNADtsitanche glükosiidid; hipokampus; Unepuudus; Õppimine ja mälu; ärevus; Sünaptiline plastilisus

MÜÜA TSISTANŠI KÕRGE TASEME GLÜKOSIIDID

Unehäire (SD)on aune funktsionaalne häirepõhjustatud mitmetest keerulistest teguritest, nagu unetus, sagedased unenäod ja kerge ärkamine. SD esinemissagedus on viimastel aastatel järk-järgult suurenenud. Seotud uuringud on teatanud, et SD võib põhjustadasüdame-veresoonkonna haigused, metaboolne düsfunktsioon, immuunhaigusedja kesknärvisüsteemi degeneratiivsed haigused, nagu Alzheimeri tõbi [1]. SD võib põhjustada hipokampuse neuronite oksüdatiivset kahjustust, kognitiivset düsfunktsiooni ja meeleolumuutusi, nagu ärevus ja depressioon [2]. Cistanche deserticola on hinnaline Hiina ravimmaterjal, mida saab kasutada ravimina ja toiduna. Sellel on neere toniseeriv ja qi-d täiendav toime, soolestikku niisutav, soolestiku liikumist soodustav toime ja yangi tugevdamine. Cistanche deserticola põhiekstraktil, cistanche glükosiididel (GC), on antioksüdant, apoptootiline, maksa- ja neuroprotektiivne toime [3]. Meie varasemad uuringud näitasid, et GC-d võivad parandada SAMP8 hiirte õppimis- ja kognitiivset funktsiooni, mängides antioksüdantset ja apoptootilist rolli [4]. Seotud uuringud on näidanud, et SD-st põhjustatud kognitiivne düsfunktsioon on tihedalt seotud sünaptilise plastilisusega [5]. Siiski on vähe teateid mehhanismi kohta, mille abil GC-d reguleerivad sünaptilist plastilisust ning parandavad unepuudusest põhjustatud rottide õppimis- ja mäluhäireid ning kognitiivset langust. Seetõttu on selle uuringu eesmärk uurida, kas GC-d mõjutavad sünaptilist plastilisust, reguleerides sünaptiga seotud markerite ekspressiooni, parandades seeläbi rottide õppimis- ja kognitiivset funktsiooni unepuuduse mudelis ning pakkudes uusi raviideid ja -plaane õppimise ja õppimise raviks. GC-dega seotud unehäiretest põhjustatud kognitiivne kahjustus.

1 Materjalid ja meetodid

1. 1 Katseloomad

Isased Wistari rotid vanuses 6–8 nädalat kaaluga 280–300 g osteti Pekingi Sibeifult loomakasvatuslitsentsiga [SCXK (Peking) 2019-0010]. Kõiki loomi peeti Baotou Meditsiinikolledži loomkatsekeskuses järgmistes tingimustes: temperatuur (24 ± 1) kraadi, niiskus 50% kuni 55%, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust ning toidule ja veele ei seatud piiranguid. Selle katse kiitis heaks koolieetikakomitee [Baoyi Lunshen 2022 nr (63)].

1. 2 Peamised reaktiivid ja instrumendid

Cistanche deserticola glükosiidid osteti ettevõttelt Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd. (partii number: KSM20220609011); Estasolaami tabletid osteti firmalt CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (partii number: 044220343); valgu laadimispuhver (P1015), RIPA lüüsipuhver (R0010), kemoluminestsentslahus (PE0010) jne osteti kõik ettevõttelt Beijing Solebao; postsünaptilise tihedusega aine 95 (PSD-95) antikeha (AB192757), sünaptofüsiini (SYN) antikeha (ab32127), ostetud ettevõttest Abcam, USA; ajust tuletatud neurotroofne faktor (BDNF) (48503-2), -aktiin (52901), ostetud ettevõttest SAB, USA; kitse küülikuvastane IgG sekundaarne antikeha (SA00001-20), ostetud ettevõttelt Proteintech, USA; roti melatoniin (MT), ELISA komplekt (MM-0657R1), ostetud firmalt Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. parafiini viilutaja (Leica, Saksamaa); optiline mikroskoop (Leica, Saksamaa); Morrise veelabürint, avamaa katsekast (Shanghai Xinruan); vertikaalne elektroforeesi instrument

(Peking Liuyi Company); värvitustamise loksuti (Peking Liuyi Company); valgu pildistamise analüüsisüsteem (Shanghai Tanon Technology); fluorestsents-kvantitatiivne PCR instrument (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1. 3 Katsemeetodid

1. 3. 1 Loomade rühmitamine ja ravimite manustamine

50 isast Wistari rotti jagati juhuslikult tühjaks kontrollrühmaks (kontrollrühm), platvormi kontrollrühmaks (platvormi kontrollrühm, PC-rühm), mudelrühmaks (mudelrühm) ja Cistanche deserticola rühma glükosiidide summaarseks rühmaks (GC-de rühm). , 50 mg/kg) ja estasooli rühma (Est rühm, 0,54 mg/kg), igas rühmas 10 rotti. Kontrollrühmale ja PC-rühmale manustati sondiga 0,9% soolalahust. Kõikidele rühmadele tehti sondiga iga päev kell 7 hommikul pärast modelleerimise algust ja sondimine kestis 21 päeva.

1. 3. 2. Unepuuduse loommudeli koostamine

Unepuuduse mudel loodi modifitseeritud mitmeplatvormilise veekeskkonna meetodil [6]. Katsevarustuseks oli 130 cm × 50 cm × 45 cm ristkülikukujuline polüetüleenvaigust veepaak. Veepaaki asetati väike platvorm läbimõõduga 5 cm ja kõrgusega 20 cm. PC-grupi platvormi läbimõõt oli 10 cm ja kõrgus 20 cm. Veepaak täideti veega umbes 18 cm sügavuselt ja vee temperatuuri hoiti (20 ± 1) kraadi juures. Nädal enne katse algust paigutati rotid keskkonnaga tutvumiseks iga päev 60 minutiks unepuuduse kasti. Pärast mudeli loomist, välja arvatud kontrollrühm, paigutati iga rühma rotid iga päev kella 8.00–20.00 väikesele platvormile 21 järjestikuse päeva jooksul unepuuduse tagamiseks. Kõik rotid said vabalt süüa ja juua ning platvormil vabalt liikuda, iga päev 12 tundi valguse ja pimeduse vaheldust.

1.3.3 Morrise veelabürindi katse

Morrise veelabürint jagati 4 alaks, täideti veega ja platvorm asetati 4. kvadranti. Veepind oli platvormist umbes 2 cm kõrgemal. Vette lisati toidukõlblikku söödavat melaniini ja vee temperatuuri hoiti (25 ± 1) kraadi juures. (1) Positsioneerimise navigatsioonikatse: iga ala keskpunkt valiti ja rotid asetati õrnalt vette. Neil lubati vabalt uudistada. Registreeriti aeg, mis kulus rottidel sihtplatvormi leidmiseks 60 sekundi jooksul. Rotid, kes platvormi ei leidnud, juhatati platvormile ja jäid sinna 20 sekundiks. Koolitust jätkati 5 päeva. (2) Ruumilise uurimise test: 6. päeval eemaldati platvorm ja rotid pandi vette 2. kvadrandi keskelt vastu seina. Registreeriti, mitu korda rotid platvormist 120 sekundi jooksul möödusid ja 4. kvadrandis viibimise aeg.

1.3. 4 Avamaa katse

Kasutati 100 cm × 100 cm × 50 cm katsekarpi ja kasti põhi jagati 9 ruudustikuks. Iga rottide rühm pandi eelnevalt avatud väli katseruumi, et kohaneda sisekeskkonnaga 60 minutiks. Katse alguses paigutati katserotid kordamööda avatud väli katsekasti fikseeritud nurkadesse ning käitumisanalüüsi tarkvara abil registreeriti rottide seismisaegade arv, liikumiskaugus ja staatiline aeg 5 minuti jooksul. . Keskkond pidi katse ajal olema vaikne ning katseseadet pühiti kahe katse vahel vastavalt puhta vee ja alkoholiga, et vältida eelmise roti lõhna, mis mõjutaks järgmise roti käitumist.

1. 3. 5 Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA)

Seerumi MT taseme tuvastamine rottidel Rotid anesteseeriti intraperitoneaalse süstiga ja kõhuaordist koguti 5 ml verd. Pärast 30-minutilist ootamist toatemperatuuril tsentrifuugiti verd seerumi saamiseks. Igasse süvendisse lisati 40 μL proovilahjendit ja seejärel 10 μL testitavat proovi. Pärast tihenduskilega sulgemist inkubeerige 37 kraadi juures 30 minutit. Peske 5 korda, lisage 50 μL ensüümi märgistuslahust ja inkubeerige 37 kraadi juures 30 minutit pärast tihenduskilega sulgemist. Peske 5 korda, seejärel lisage kordamööda värvuse tekitav lahus ja reaktsiooni peatamise lahus. Iga süvendi OD väärtust mõõdeti ensüümi märgistusseadmega lainepikkusel 450 nm.

１. ３. ６ Nissli värvimine

Igast rühmast võeti kolm rotti ja ajukude eemaldati dekapitatsiooni teel. Ajukude fikseeriti 4% polümetüülmetakrülaadi lahusega ja kude dehüdreeriti, sukeldati vahalahusesse ja sisestati ning kude viilutati tavapäraste meetoditega. Viile hoiti paksusega 5 μm, loputati PBS-ga ja värviti 0-ga. 1% toluidiinsinist 0 jaoks. 5 tundi, diferentseeritud 95% alkoholiga, dehüdreeritud 100% alkoholiga, läbipaistev ksüleeniga ja suletud neutraalse kummiga. Muutusi morfoloogias ja neuronite arvus roti hipokampuse CA1 piirkonnas vaadeldi mikroskoobi all ja koguti pilte.

１. ３. 7 Western blot katse

Igast rühmast valiti neli rotti ja hipokampus isoleeriti dekapitatsiooni teel. Hipokampuse kude segati jäävanni keskkonnas RIP A lüüsipuhvriga ja tsentrifuugiti supernatandi saamiseks. Valgu kontsentratsioon tuvastati BCA meetodil. Elektroforeesiks lisati 20 ug valku koos valgu laadimispuhvriga. Pärast valgu elektroforeesi lõpetamist kanti membraan üle 300 mA konstantse vooluga, blokeeriti 5% lõssipulbriga, primaarset antikeha inkubeeriti 4 kraadi juures üleöö ja sekundaarset antikeha inkubeeriti toatemperatuuril 2 tundi. Pärast värviarenduslahuse kasutamist kasutati valguribade statistiliseks analüüsiks kemoluminestsentskujutise analüüsisüsteemi.

1. 3. 8 RT-PCR katse

Igast rühmast valiti kolm rotti hipokampuse koe homogenaadi valmistamiseks. Kogu RNA koevedelikus ekstraheeriti Trizoli meetodil ja mõõdeti kontsentratsioon. Pöördtranskriptsiooniks kasutati tühja kõhuga cDNA sünteesikomplekti ja sünaptilise valgu mRNA suhtelise ekspressioonitaseme tuvastamiseks fluorestsents-kvantitatiivse komplekti abil fluorestsentsi kvantitatiivset amplifikatsioonireaktsiooni. Tulemusi analüüsiti kasutades 2-ΔΔCt ja praimeri järjestused on näidatud tabelis 1.

1.4 Statistilised meetodid

Normaaljaotusele vastavad andmetulemused väljendati keskmise ± standardhälbena (x ± s) ja statistiline analüüs viidi läbi GraphPad Prism 9.5 tarkvara abil. Mitme proovi võrdlemiseks kasutati ühefaktorilist dispersioonanalüüsi ja P < 0,05 näitas, et erinevus oli statistiliselt oluline.