Fenüületanooli glükosiidide mõju transformeeruvale kasvufaktorile – P1/Smadsi signaalrada inimese hüpertroofilises armis fibroblastides

Fenüületanoidi glükosiidide mõju transformeeruvale kasvufaktorile – p1/Smads signaalrada inimese hüpertroofiliste armi fibroblastides

Rohkem information:Ali.ma@wecistanche.com

[Abstraktne]Eesmärk Põhineb ümberkujundaval kasvufaktoril - pl (TGF - pl)/Smads signalisatsioonirada, et uurida mõjufenüületanoidi glükosiididalbaaniacistanche tubulosa(CPHG-d) inimese hüpertroofiliste armi fibroblastidel (HSFbs) ja võimalikul mehhanismil. Meetodid 2019. aasta märtsist juunini lubati 9 hüpertroofilise armiga patsienti pärast tagumikku. Fibroblastid eraldati hüpertroofsest armist ja kultiveeriti. Inimese hüpertroofsed armid eemaldati ja fibroblastid kultiveeriti in vitro. Loodi tühi rühm, mudelirühm, positiivne kontrollrühm (TGF - pl + 5 - fluorouracil) ja eksperimentaalrühm (TGF - pl + CPhGs). Mõjud, midafenüületanoidi glükosiididalbaaniacistanche tubulosaerinevates kontsentratsioonides HSFbide levikul tuvastas rakkude loendamise komplekt - 8 (CCK - 8) analüüs. Smad2, Smad3, Smad7, kollageeni I (COL -1) ja kollageeni HI (COL -3) mRNA ekspressioon avastati reaalajas kvantitatiivse pöördtranskriptaasiga - polümeraasi ahelreaktsiooniga (RT - qPCR) igas rühmas. Smad2, Smad3, fosforüleeritud Smad2 (p - Smad2), fosforüleeritud Smad3 (p - Smad3), Smad7, COL -1 ja COL - 3 valgu ekspressiooni avastas Lääne blot. Mõõtmisandmeid väljendati keskmise ± standardhälbena (keskmine ± SD). Mitut rühma võrreldi ühe - viisiga ANOVA. Tulemused Fibroblastide inhibeerimise määr pärast ravi CPHG-dega 60, 90 ja 120 mg/L 48 tunni jooksul oli (36,87 ±0,06)% vs. (43,52 ±0,04)% vs. (78,11 ±0,03)% , F väärtus =45,070, P<0.01. the="" inhibitory="" effects="" of="" cphgs="" on="" fibroblasts="" increased="" with="" the="" increase="" of="" drug="" concentration="" and="" the="" prolonga­tion="" of="" action="" time.="" rt="" -="" qpcr="" results="" showed="" that="" as="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" expression="" of="" col="" -1,="" col="" -="" 3,="" smad2,="" smad3="" mrna="" was="" reduced,="" and="" the="" expression="" of="" smad7="" mrna="" was="" in­creased="" in="" the="" experimental="" and="" positive="" control="" groups="" (0.21="" ±="" 0.04="" vs.="" 0.3="" ±0.25="" vs.="" 1.56="" ±="" 0.01,="" f="" value="39.755,"><0.01), (0.55="" ±0.04="" vs.="" 0.27="" ±0.04="" vs.="" 1.66="" ±0.22,="" f="" value="61.991,">< 0.01),="" (0.55="" ±0.03="" vs.="" 0.78="" ±0.76="" vs.="" 1.06="" ±0.15,="" f="" value="17.769,"><0.01), (0.46="" ±0.08="" vs.="" 0.55="" ±="" 0.10="" vs.="" 2.05="" ±="" 0.29,="" f="" value="56.796," p="">< 0.01),="" (1.77="" ±="" 0.59="" vs.="" 0.11="" ±="" 0.02="">

0,04 ± 0,04, F väärtus = 14,780, P< 0.05)="" ；="" western="" blotting="" results="" showed="" that="" the="" protein="" expression="" of="" p-smad2="" and="" p="" -smad3,="" col="" -="" 1,="" col="" -3,="" in="" the="" experimental="" group="" and="" positive="" control="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" model="" group,="" and="" the="" expression="" of="" smad7="" protein="" was="" significantly="" high­er="" than="" that="" in="" the="" model="" group="" (0.="" 16="" ±="" 0.03="" vs.="" 0.="" 11="" ±="" 0.02="" vs.="" 0.06="" ±="" 0.00),="" (0.="" 12="" ±="" 0.02="">

0,07 ± 0,01 vs 0,04 ±0,01, F väärtus =7,670, P< 0.05),="" (0.12="" ±0.03="" vs.="" 0.15="" ±0.06="" vs.="" 0.23="" 土="" 0.05,="" f="" value="3.936,"><0.05), (0.27="" ±0.02="" vs.="" 0.08="" ±0.01="" vs.="" 0.05="" ±0.04,="" f="" value="34.291," p="">< 0.01),="" (0.33="" ±0.02="" vs.="" 0.16="" ±0.02="" vs.="" 0.17="" ±0.01="" f="" value="16.322,"><0.01). conclusion="" cphg="" inhibited="" hypertrophic="" scar="" fibroblasts="" proliferation="" and="" activation="" via="" blocking="" the="" tgf="" -="" pl/smad="">

[Võtmesõnad] Fenüületanoidi glükosiididalbaaniacistanche tubulosa； Hüpertroofilised armi fibroblastid; Kasvufaktori ümberkujundamine - pl / Smads signalisatsioonirada

Kliki cistanche deserticola ma ja Cistanche toodetele

Hüpertroofne armistumine (HS) on naha fibrootiline haigus, mida iseloomustab fibroblastide (FBS) liigne vohamine, samuti rakuväline maatriks (ECM) sadestumine, mis on armide moodustumise peamised võimaldavad rakud, võivad eritada suures koguses kollageeni ja transformeeriv kasvufaktor (TGF) - P / Smads signalisatsioonirada on tihedalt seotud HS moodustumisega.Cistancheon traditsiooniline toonik traditsiooniline hiina meditsiin, mille ekstrakt fenüületanoidi äädikhappe kogu (cphgs) on üks peamisi koostisosi, mis avaldavad meditsiinilist toimet ja millel on erinevad bioloogilised funktsioonid, nagu põletikuvastane, kasvajavastane, anti-kiirgus, vabade radikaalide püüdmine jne uuringud on näidanud, et cphgs võivad pärssida maksa stellate rakkude vohamist ja et ta saab seda teha, vähendades Smad2 ekspressiooni, Smad3, Smad7 ekspressiooni suurendamine blokeeris seeläbi tgf-p / Smadsi signaaliraja transduktsiooni ja lükkas seejärel maksafibroosi progresseerumise edasi. Selle uuringu eesmärk oli jälgida TGF PL / Smad signaalimisrajal põhinevaid mõju inimese hüpertroofiliste armi fibroblastidega (hsfbs) seotud geenide ja valkude ekspressioonile.

Materjalid ja meetodid

1. Materjalid:Cistanchecphgs osteti hechen pharmaceutical biotech Co., Ltd., Hetian, Hiina; Loote veiste seerum osteti Clark Bioscience'ist, USA-st; Rakkude loendamise komplekt TGF PL osteti USA-st pepro techist; Fluorestsentsi kvantitatiivne PCR-komplekt osteti Takara Corporationist, Jaapanist; Pöördtranskriptsioonikomplektid osteti kõik Thermo Fisher Scientificist, USA-st; Smad2 / 3, p-Smad2 / 3 antikehad osteti rakusignaali tehnoloogiast, USA; Abeamilt (UK) osteti Smad7, COL-1, COL-3, glükeraldehüüdi-3-fosfaadi dehüdrogenaasi (gap-dh) antikehad; Polüvinüülideenfluoriidi (PVDF) membraane osteti MILLIPORE'ist, USA-st.

2. Kõik juhtumid valiti ortopeedia osakonnast, Xinjiangi meditsiiniülikooli esimesest sidushaiglast, ning FBS-i esmaseks kultuuriks valiti juhuslikult kolm isendit (mis kõik diagnoositi patoloogia järgi kindlasti hüpertroofilise armina); Selle eksperimendi kiitis heaks Xinjiangi meditsiiniülikooli esimese sidushaigla meditsiinieetika komitee (heakskiidunumber 20170214-71) ning patsientidelt ja nende perekondadelt saadi informeeritud nõusolek.

3. Lahtrite grupeerimine: juhuslikult jagatud tühja rühma; Mudelirühm: 5 |ug / L TGF - & 1; Positiivne kontroll: 5|ug / L TGF PI + 250 mg / L 5-fluorouracil (5-FU); Katserühm: 5|ug / L TGF PL + (60 mg / L, 90 mg / L >, 120 mg / L) cphgso.

4. Rakkude vohamine määrati kindlaks rakkude loendamise komplekti (CCK-8) abil: logaritmilises kasvufaasis võeti hsfbs, igast rühmast rakke töödeldi nii, nagu see oli kavandatud, ja iga rühma iga kaevu neeldumisväärtust jälgiti järjestikku 450 nm lainepikkusel, kasutades mikroplaadilugerit 24, 48 ja 72 tundi.

5. mRNA ekspressiooni tuvastamine RT qPCR-i poolt: hsfbs igast rühmast pärast 48-tunnise sekkumise kogumist koguti, RNA ekstraheeriti ja määrati mRNA ekspressiooni kogus.

6. Valgu ekspressiooni määras Lääne blot analüüs. Kogu rakuvalk ekstraheeriti 48 tundi pärast ravi igast rühmast, et tuvastada iga valgu ekspressioon.

7. Statistilised meetodid: analüüsimiseks kasutati statistilist tarkvara SPSS 22.0 ja mõõtmisandmeid väljendati keskmise ± standardhälbena (keskmine ± SD) ning mitme rühma võrdlemiseks kasutati dispersiooni ühesuunalist analüüsi ja P< 0.05="" was="" considered="" statistically="">

Tulemused

Rakkude vohamise tulemused näitasid, et fibroblastidel 60, 90 ja 120 mg / L cphgs 48 tunni jooksul oli inhibeerimise määr [(36,87 ±0,06)%: (43,52 ±0,04)% :(78,11 ±0,03)% ,F=45,073,P< 0.01="" ],90="" mg/l="" cphgs.="" 24h-28h="" was="" [(26.29="" ±0.04)%="" :(43.52="" ±0.04)%="" :(64.11="" 土="" 0.03)%,f=""><0.01]. it="" indicated="" that="" the="" inhibition="" rate="" of="" cphgs="" on="" hsfbs="" was="" gradually="" elevated="" with="" time="" extension="" and="" increasing="" concentration,="" showing="" a="" proportional="">

CoL-I, COL-3, Smad2 ja Smad3 mRNA ekspressiooni võrdlus igas rühmas: võrreldes mudelirühmaga võivad nii positiivsed kontroll- kui ka katserühmad vähendada transformeeruvat kasvufaktorit β - indutseeritud CoL-I, COL-3, Smad2 ja Smad3 mRNA ekspressiooni ning edendada Smad7 mRNA ekspressiooni, statistiliselt oluliste erinevustega. (1.56 ±0.01:0. 30 ± 0.25 : 0.21 ±.0.04,F = 39. 755,P<0.01； 1.66="" ±0.="" 22="" :="" 0.="" 27="" ±0.04="" :="" 0.="" 55="" ±0.="" 04.f="61." 991="" ,p=""><0. 01；="" 1.="" 06="" ±="" 0.15="" 比="" 0.="" 78="" ±="" 0.="" 76="" 比="" 0.="" 55="" ±="" 0.="" 03,="" f="17.769" ,p=""><0.01 ；2.05="" ±="" 0.29="" :="" 0.55="" ±="" 0.10="" :="" 0.46±="" 0.08,f=""><0.01 ；0.04="" ±0.04="" :="" 0.11="" ±0.02="" :="" 1.77±0.="" 59,f="14."><0.>

P-Smad2, p-smad3, col-l, COL-3 võrdlus igas rühmas: võrreldes tühja rühmaga suurenes p-Smad2 valgu ekspressioon, col-l mudelirühmas, samas kui Smad7 valgu ekspressioon vähenes; Võrreldes mudelirühmaga võis positiivne kontrollrühm vähendada p-smad3, COL-1, COL-3 valgu ekspressiooni ja katserühm näitas pärssivat toimet p-Smad2, p-smad3, col - 3 kõrgenenud valgu ekspressioonile. COL-3 ekspressiooni pärssiti erineval määral, samas kui Smad7 ekspressioon suurenes mõlemas rühmas suhteliselt ja p-Smad2, p-smad3, Smad7, col-l, COL-3 valgu ekspressiooni väärtused tühjas rühmas, positiivne kontrollrühm ja katserühm olid (0,09 ±0,04,0,0,16 ±0,03,0,11 ± 0,02,0,06 ± 0,00),(0,07 ±0,03,0,12 ± 0,02,0,07 ± 0,01,0. 04 ±0. 01,F = 7. 670, P<0. 05),="" (0.="" 22="" ±0.05、="" 0.12="" ±0.03,0.15="" ±0.06,0.23="" ±="" 0.05,="" f="3.936,">< 0.05),(0.19="" ±0.02,0.27="" ±="" 0.02,0.08="" ±0.01,0.05="" ±="" 0.04,f=""><0.01)、(0.21 ±0.04.0.="" 33="" ±0.02、="" 0.16="" ±0.02,0.17="" ±0.01,f=""><>

Arutelu

HS on kudede parandamise vältimatu tulemus ja selle esinemismehhanism peamiselt FBS-i hüperproliferatsioon, ebapiisav lagunemine ja nii edasi viib HS-i moodustumiseni ja arenguni. Tgf-p1 osaleb laialdaselt rakulistes, koe ebanormaalsetes vohamis- ja diferentseerumishaigustes ning jätkub kogu haavade paranemise ajal; See avaldab oma mõju peamiselt tgf-p / Smadsi signaaliraja kaudu, kus Smad2 / 3 valkude fosforüleerimine põhjustab rakusiseste ja rakuväliste fibrogeensete valkude ekspressiooni suurenemist, soodustab kollageeni tootmist ja kiirendab fibroosi progresseerumist; Smad7 kui negatiivne regulaator võib takistada seda rada koostoimel aktiveeritud tgf-p1 retseptoritega, vähendades seeläbi kollageenikiudude sünteesi; Seega võib Smad7 ekspressiooni suurendamine või Smad2 / 3 ekspressiooni pärssimine takistada hüpertroofsete armide teket.

Selles uuringus rakendati Cistanche cphgs-d naha fibrootilisele haigusele HS-ile ja leiti, et mitmesugused cphg-de annused pärssisid tgf-p1 poolt indutseeritud hsfbide vohamist; Veelgi enam, 90m & / L cphgs inhibeerisid raja signaalimist, edendades Smad7 ekspressiooni ja vähendades Smad2 / 3 ekspressiooni nii geeni kui ka valgu ekspressiooni tasemel ning vähendades CoL-I, COL-3 tootmist, mis omakorda pärssis HS progresseerumist. Meie tulemused kinnitasid, et cphgs pärssis kollageeni tootmist, sekkudes tgf-p / Smadsi signaalimisrajaga seotud valkude ekspressiooni tgf-p1 stimulatsiooni all. Käesoleva uuringu tulemused näitasid, et Cistanche cphgs pärssis hüpertroofiliste armi fibroblastide vohamist ja vähendas tõhusalt kollageeni sekretsiooni tgf-p / Smadsi signaalraja kaudu.