Cistanche Tubulosa ekstraktide mõju isaste reproduktiivfunktsioonile streptosototsiini ja nikotiinamiidi poolt indutseeritud diabeetiliste rottide puhul -Ⅰ

1. Sissejuhatus

Suhkurtõbi (DM) on seisund, mille korral suurenebglükoositasemedveres, mis on tingitud kõhunäärme ebaefektiivsusest piisava insuliini tootmisel või organismi võimetusest seda tõhusalt kasutada. WHO andmetel kasvas diabeetikute arv 108 miljonilt 1980. aastal 422 miljonini 2014. aastal [1]. On neli põhikategooriat: eeldiabeet (diabeedieelne staadium), tüüp 1 (kus kõhunääre ei tooda insuliini), tüüp 2 (organism ei kasuta insuliini) ja rasedusdiabeet (mis esineb raseduse ajal). Oksüdatiivne stress tekib reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ja antioksüdantide tootmise vahelise tasakaalustamatuse tõttu [2], mis viib lõpuks diabeetilise seisundini. Diabeedi tüsistuste hulka kuuluvad neerupuudulikkus, närvikahjustus, pimedus, insult, südameatakk, loote surm ja viljatus. [1]. Uuringud näitavad, et diabeediga meespatsientidel olid spermatosoidide tuumad, desoksüribonukleiinhape (DNA) ja mitokondrid oluliselt kahjustatud [3]. Oksüdatiivne stress sperma transportimisel muudab meeste reproduktiivsüsteemi protsessi [4,5].

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Spermatogeneesi protsessi juhib hüpotalamuse-hüpofüüsi-sugunäärmete (HPG) telg. Hüpotalamuse toodetav gonadotropiini vabastav hormoon (GnRH) stimuleerib luteiniseeriva hormooni (LH) ja folliikuleid stimuleeriva hormooni (FSH) tootmist. Leydigi rakud asuvad seemnetorukese kõrval jatoota testosterooniLH kontrolli all. FSH käivitab antigeeni siduva valgu (ABP) tootmise, mis aitab kaasa meessuguhormoonide väljutamisele. Seega tekivad viljatus ja muud probleemid peamiselt HPG teljel esinevate häirete tõttu. Streptosototsiini-nikotiinamiidi kombinatsiooni manustamine kutsub eksperimentaalsetel rottidel esile diabeedi. Streptozototsiin on keemiline ühend, mis on toksiline pankrease insuliini tootvatele rakkudele ja nikotiinamiid on vees lahustuv vitamiin, mis kaitseb rakke täieliku kahjustuse eest [6].

Cistanche tubulosa on kõrbetaimeliik, mida tuntakse ka kui "Rou Cong-Rong" [7]. See on mitteklorofülliline parasiitaim, mis kasvab peamiselt Calotropis procera puu juurtel ja on laialt levinud Gansu, Qinghai, Xinjiangi, Mongoolia, Iraani ja India kuival maal. Cistanche tubulosa üldnimetus on "kõrbehüatsint". See on Hiina traditsioonilises meditsiinis laialdaselt aktsepteeritud ja sellele on antud nimi "kõrbe ženšenn". Seda kasutatakse meditsiinis laialdaselt haigestunud leukorröa, rohke metrorraagia, krooniliste neeruhaiguste, kõhukinnisuse, impotentsuse ja viljatuse raviks. Keemilised koostisosadCistanche tubulosa koosneb mittelenduvatest fenüületanoidglükosiididest(PHG-d), iridoidid, lignaanid, lenduvad õlid, alditoolid, oligosahhariidid ja polüsahhariidid [8]. Uuringud näitavad, etehhinakosiidsee ravimtaim kaitseb kahjustatud fibroblaste, reguleerides ROS-i taset [9]. See ühend tekitab antioksüdante, vasorelaksatsiooni ja põletikuvastast toimet koos neuroprotektsiooni ja osteoporoosi ennetamisega [10,11].

Selle uuringu eesmärk oli uurida selle mõjuCistanche tubulosa ekstraktmis sisaldab ECH-d streptozototsiini-nikotiinamiidi poolt indutseeritud diabeetilise roti reproduktiivfunktsiooni häirete kohta.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Materjalid

ECH ja CTE osteti ettevõttelt Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Täiustatud glükatsiooni lõpptooted (AGE) osteti ettevõttest Biovision (San Francisco, CA, USA). LC-540 ja TM3 rakuliinid osteti toiduainetööstuse uurimis- ja arendusinstituudist (Hsinchu, Taiwan). Viie nädala vanused Sprague-Dawley (SD) isasrotid osteti riiklikust laboriloomade keskusest (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® osteti ettevõttelt PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüül (DPPH) saadi firmalt Sigma (St. Louis, MO, USA). Metanool ja 4-(2-hüdroksüetüül)-1-piperasiinetaansulfoonhape (HEPES) osteti samuti ettevõttelt Sigma. Dulbecco modifitseeritud Eagle sööde/F12 ja trüpsiin-EDTA saadi firmalt GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetüültiasool-2-üül)-2, 5-difenüültetrasooliumbromiid (MTT), diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaat (DCFH-DA), dimetüülsulfoksiid (DMSO) ja nitroblue tetrasoolium (NBT) osteti firmalt Sigma. Glükoosi ensümaatilised komplektid saadi Kyokutoseiyakust, Tokyost, Jaapanist. Insuliini ELISA komplektid osteti firmalt Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Rootsi). T-PER Tissue Protein Extraction Reagent saadi firmast Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Inimese/hiire/roti tuumafaktor-kappa B NF-κB polüklonaalsed antikehad osteti ettevõttest Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA. Anti-hiire/roti retseptor täiustatud glükatsiooni lõpptoodete (RAGE) polüklonaalsete antikehade jaoks, anti-inimese/hiire/roti STAR polüklonaalsed antikehad ja inimese/hiire/roti tsütokroom P450 17A1-vastased monoklonaalsed antikehad osteti ettevõttelt Gene Tex (Irvine, CA, USA). Inimese/hiire/roti vastased CYP11A1 polüklonaalsed antikehad saadi firmast Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA). Easy-Blue reaktiiv osteti firmast Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agaroos ja DNA marker 100 bp saadi ettevõttest Promega, Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit osteti firmalt QIAGEN, Hilden, Saksamaa.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. meetodid

2.2.1. In vitro analüüs

LC{{0}} ja TM3 rakukultuur: LC-540 rakuliine kultiveeriti 37 ◦C juures Earle'i tasakaalustatud soolalahuse (EBSS) söötmes, millele oli lisatud naatriumvesinikkarbonaati (1,5 g/l), L-glutamiin (2 mM), asendamatud aminohapped (0,1 mM), naatriumpüruvaat (10 mM) ja veise loote seerum (FBS) (10%) 5% CO2 inkubaator (CO2 inkubaator, Napco 5410, Taiwan). TM3 rakuliini kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle söötmes (DMEM), millele oli lisatud glükoosi (4,5 g/l), naatriumpüruvaati (0,5 mM), L-glutamiini (2,5 mM), naatriumvesinikkarbonaati (1,2 g/l), {{ 28}}(2-hüdroksüetüül)-1-piperasiinetaansulfoonhape (HEPES, 15 mM) ja vasika loote seerum (FCS, 10%) või hobuse seerum (5%) temperatuuril 37 ◦C 5% CO2 inkubaator.

Rakkude elujõulisuse määramineehhinakosiid (ECH): 3-(4, 5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5- difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) reaktiivi kasutati rakkude elujõulisuse testis. Rakkude kontsentratsioon reguleeriti 96-süvendiga plaadil väärtusele 2 × 105 rakku/ml. Seejärel lisati 20 µl ECH-d (lahjendatud 2% söötmega) ja inkubeeriti 24 tundi temperatuuril 37 °C 5% CO2 inkubaatoris. Hiljem lisati 100 µl MTT reaktiivi ja inkubeeriti 4 tundi 37 °C juures pimedas. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 570 nm (ELISA lugeja, Dynatech MR5000, Kloten, Šveits).

Rakkude suhteline elujõulisus (%)=[(proov 570 nm juures – tühikatse 570 nm juures)]/[(Akontroll 570 juures – tühikatse 570 juures)] × 100.

Nitroblue Tetrazoliumi (NBT) reduktsioonianalüüs ja 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüüli (DPPH) test: rakkude arv reguleeriti 1 × 1{{10}}6 rakku/ ml. Seejärel lisati 50 mg/ml ECH-d, resveratrooli (RES) ja täiustatud glükatsiooni lõpp-produkte (AGE) (kontroll) ja kultiveeriti koos 18 tundi 37 °C juures. Seejärel lisati 0,3 ml NBT lahust (0,1 mg/ml NBT, 5% FBS ja 3% dimetüülsulfoksiid (DMSO) lahustatuna 10 ml DMEM-is) ja inkubeeriti 37 °C juures 5% CO2-s 1 tund. Pärast tsentrifuugimist (800 x g 3 minutit) supernatant eemaldati ja lisati 200 µL DMSO-d ja loksutati 5 minutit ultraheliostsillaatoris (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). Neeldumist mõõdeti 630 nm juures. DPPH radikaali testi jaoks võeti standardina Trolox (95% alkoholis). Seejärel segati 75 µl 0,5 mM DPPH lahust 25 µL proovidega ja lasti reageerida toatemperatuuril pimedas kohas 30 minutit. Segu loksutati ja neelduvus mõõdeti lainepikkusel 517 nm.

Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) sisalduse analüüs: 2% FBS-i sisaldaval 12-süvendiga plaadil reguleeriti rakkude arv väärtusele 2 × 105 rakku/ml. Seejärel lisati plaadile 50 µL/ml ECH-d, RES-i ja AGE-sid ning inkubeeriti 37 °C juures 24 tundi. 24 tunni pärast lisati 20, 70 -diklorofluorestseiindiatsetaati (DCFH-DA) ja inkubeeriti 37 °C juures 30 minutit. Pärast tsentrifuugimist (400 x g, 5 min) eemaldati supernatant ja rakke pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Pärast seda suspendeeriti rakud 1 ml PBS-is ja ROS-i tasemed määrati voolutsütomeetriga (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).

Valkude identifitseerimine ja kvantitatiivne analüüs: Valgud ekstraheeriti valgu ekstraheerimisreagendi (T-PER) abil. Rakkude tihedus reguleeriti 12-süvendiga plaadil väärtusele 2 × 105 rakku/ml ja 50 µL/mL ECH-d, RES-i ja arenenud glükatsiooni lõppprodukti (RAGE) antagonisti retseptorit ning lisati AGE-d ja inkubeeriti. temperatuuril 37 ◦C 5% CO2 inkubaatoris 24 tundi. Pärast seda lisati 400 µl T-PER-i, kaabiti rakud maha ja tsentrifuugiti 125,000 × g juures 20 minutit (4 ◦C). Supernatant koguti ja säilitati edasiseks analüüsiks temperatuuril –80 ◦C (-80 ◦C sügavkülmik, Nuaire, Plymouth, MN, USA). Valkude kvantifitseerimiseks kasutati bitsinhoniinhappe (BCA) komplekti. Seejärel lisati 8-süvendiga plaatidele 10 µL standardset rakulahust ja 200 µL BCA reaktiivi ning inkubeeriti 37 ◦C juures 5% CO2 inkubaatoris 30 minutit. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 562 nm. Valkude identifitseerimise analüüs viidi läbi naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS)-polüakrüülamiidgeeli (SDS-PAGE) elektroforeesiga. Proovid valmistati valgu lüsaadi lisamisega valgu laadimispuhvrisse ja spetsiifiliste valkude tuvastamiseks viidi läbi Western blot analüüs.

2.2.2. In vivo analüüs

Loomamudeli disain: kuuskümmend {{0}}nädalast isast Sprague–Dawley (SD) rotti osteti riiklikust laboriloomade keskusest (Taipei, Taiwan). Iga rott hoiti eraldi desinfitseerivates roostevabast terasest puurides kontrollitud temperatuuri (23 ± 1 °C) ja niiskuse (40–60%) all 12-tunnise valguse/12-tunnise pimeduse tsükliga. Toitu ja vett anti ad libitum. Iga rott kodustati esimesel nädalal ja talle anti põhitoiduna laboratoorse näriliste dieet 5001. Kõik protseduurid järgisid Taiwani riikliku Taiwani ookeaniülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee (IACUC heakskiidu nr 101026) standardeid. Pärast kodustamist jagati rotid kahte rühma: kontrollrühm (Con), kellele toideti laboratoorset dieeti 5001, ja diabeetikute rühm, kellele toideti kogu katse vältel kõrge rasvasisaldusega dieeti (HFD, 40%). Pärast 4-nädalast HFD-ga toitmist süstiti diabeedirühma rottidele suhkurtõve (DM) esilekutsumiseks streptozototsiini (65 mg/kg) (STZ). 15 minuti jooksul pärast STZ süstimist süstiti nikotiinamiid (230 mg / kg kehamassi kohta). Nädal pärast süstimist viidi läbi suukaudne glükoositaluvuse test (OGTT), et teha kindlaks suhkurtõve (DM) edukas esilekutsumine. Pärast seda jagati loomad kuue rühma: kontrollrühmad (toidetud laboratoorse dieediga 5001); DM rühm (DM + 45% HFD); DMR rühm (DM + rosiglitasoon: 0,571 mg/kg BW) + 45% HFD; DME1 rühm (DM + CTE: 80 mg/kg kehamassi kohta) + 45% HFD; DME2 rühm (DM + CTE: 160 mg/kg BW) + 45% HFD; ja DME4 rühm (DM + CTE: 320 mg/kg BW) + 45% HFD. Rosiglitasoon (RSG) võeti positiivseks kontrolliks. Taiwani toidu- ja ravimiameti (TFDA) tervisliku toidu funktsionaalse hindamise juhiste kohaselt kasutati kolme CTE annust (80, 160 ja 320 mg/kg). Ravi viidi läbi kuni katse lõpuni. Kõik katserotid surmati 6 nädala pärast. Rottidelt kogutud verd tsentrifuugiti kiirusel 3000 p/min 15 minutit temperatuuril 4 °C. Supernatanti uuriti järgmise analüüsi jaoks:

Üldglükoosi, triglütseriidide ja kolesterooli määramine: glükoosi määramine viidi läbi glükoosi ensümaatiliste komplektidega. Seejärel lisati reagentidele 20 µl vereplasma proove ja hoiti 5 minutit temperatuuril 37 ◦C. Triglütseriidide üldsisaldus ja üldkolesterooli kontsentratsioon määrati triglütseriidide ja kolesterooli ensümaatiliste komplektide abil. Seejärel lisati reagentidele 10 µl vereplasmat ja katse viidi läbi vastavalt tootja juhistele. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 510 nm.

Plasma üldglükoosi/triglütseriidide/kolesterooli sisaldus (mg/dL)=(proov – ABtühik)/(Astandard – ABlank) × 200.

Proov: vereproovide neeldumine, ABTühik: proovita komplektide neeldumisväärtus, Astandard: standardreaktiivi neeldumisväärtus, 200: standardreaktiivid kontsentratsiooniga 200 mg/dl.

Insuliini, leptiini ja homöostaatilise mudeli hindamine – insuliiniresistentsuse (HOMA-IR) määramine:Insuliini tase määrati insuliini ELISA komplektidega. Siin, 25µLisati L vereplasmareaktiive ja neeldumist mõõdeti 450 nm juures. Leptiini üldsisaldus määrati, kasutades aleptiini ensüümi immunomeetrilise analüüsi komplekt.Siis 100µAnalüüsiti l plasmat ja neeldumistmõõdeti 450 nm juures, kasutades ELISA lugejat. Kogu katse viidi läbi vastavalttootja juhised. HOMA-IR väärtus määrati homöostaasi mudeli põhjalhindamisvõrrand=tühja kõhuga plasma insuliinikontsentratsioon (mg/ml)× tühja kõhuga plasma glükoosisisalduskontsentratsioonid (mmol/L)/22,5.

Plasma lipiidide peroksüdatsioon: siin segati {{0}},5 ml vereplasmat 1 ml reagendiga (15%, w/v trikloroäädikhape 0,25 N vesinikkloriidhappes (HCl) ) ja 0,375%, w/v tiobarbituurhapet 0,25 N HCl-s) ning asetati 15 minutiks veevanni (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Šveits) temperatuuril 100 °C. Pärast jahutamist lisati 1 ml n-butanooli, loksutati tugevalt ja tsentrifuugiti 1500 × g juures 10 minutit. Supernatant koguti ja neeldumist mõõdeti lainepikkusel 532 nm [12].

Malondialdehüüdi (MDA) kontsentratsioon (nM/mL)=[(Proov lainepikkusel 532 nm – tühiproov lainepikkusel 532 nm)/ (A standard 532 nm juures – tühiproov lainepikkusel 532 nm)] × 5.

standard 532 nm juures – tühikatse 532 nm juures)] × 5. Plasma testosterooni ja luteiniseeriva hormooni (LH) tasemete määramine: Testosterooni ELISA komplekti kasutati testosterooni taseme mõõtmiseks vereplasmas. LH kontsentratsiooni määramiseks kasutati RIA komplekti. Seejärel lisati 50 µl plasmat ja arvutused põhinesid hormooni LH-RP-3 (standard) kontsentratsioonil. Edasised sammud viidi läbi vastavalt tootja juhistele.

Kasvaja nekroosifaktori (TNF) ja interleukiini-6 (IL-6) kontsentratsiooni määramine: püütud antikeha lahjendati kattepuhvris 250 korda ja lisati 96- süvendiga plaat (100 µL süvendi kohta) ja hoiti temperatuuril 4 ◦C üleöö. Supernatant aspireeriti ja pesti viis korda pesupuhvriga (1 kord PBS, 0,05% Tween 20). Pärast inkubeerimist (1 h) 200 µg analüüsi lahjendiga pesti rakke 5 korda pesupuhvriga ja igasse süvendisse lisati 100 µL TNF-standardlahust või testproove ja inkubeeriti 2 tundi. Pärast pesemist lisati 100 µl IL-6- tuvastatud antikehi ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril. Supernatant aspireeriti ja pesti 5 korda. Seejärel lisati 480 µl ensüümi avidiin-mädarõika peroksidaasi (HRP) ja inkubeeriti 30 minutit toatemperatuuril. Supernatant aspireeriti ja pesti viis korda pesupuhvriga. Seejärel lisati 100 µl substraadi lahust ja inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril. Hiljem lisati igasse süvendisse 50 µl stopplahust (1 M fosforhapet) ja neeldumist mõõdeti 450 nm juures.

LOODUSLIK TUBULOOS SEKSUAALFUNKTSIOONIDE PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sperma ja munandite parameetrite analüüs

Sperma proovide kogumine: spermaproovide kogumine viidi läbi vastavalt meetodile, mida on eelnevalt kirjeldatud artiklis [13]. Sperma koguti supernatandist ja kasutati edasiseks analüüsiks.

Spermade arv, spermatosoidide liikuvus ja ebanormaalsed spermatosoidid: spermatosoidide arv arvutati hemotsütomeetri ja trüpaansinise lahuse abil. Seejärel segati 100 µl spermatosoidi vedelikku trüpaansinise lahusega ning hemotsütomeetri ja mikroskoobi abil arvutati spermatosoidide arv, liikuvus ja ebanormaalsed spermatosoidid [14].

Nitrosinise tetrasooliumi NBT redutseerimine ja sperma ja munandite lipiidide peroksüdatsioon: lipiidide peroksüdatsiooni ja NBT redutseerimist analüüsiti sama plasmaanalüüsi protseduuri kohaselt.

Superoksiiddismutaasi (SOD) ja katalaasi aktiivsuse määramine: Superoksiidi dismutaasi (SOD) aktiivsust analüüsiti RANSEL komplekti abil. Siin lisati {{0}}.05 ml munandite homogenaate lisati 1,7 ml reaktsioonilahusele (0,05 mM ksantiini, 0,025 mM 2-({ {9}}jodofenüül)- 3-(4-nitrofenool)-5-fenüültetrasooliumkloriid (INT)). Pärast segamist lisati 0,25 ml ksantiinoksüdaasi (80 U/L) ja lasti reageerida toatemperatuuril 30 sekundit. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 505 nm. Munandite homogenaadi valgukontsentratsioon määrati Bio-Rad DC valguanalüüsi komplektiga ja arvutati selle spetsiifiline aktiivsus (U/mg valku). Katalaasi (CAT) aktiivsus määrati eelnevalt teatatud meetodil [15].

H&E (hematoksüliini ja eosiini) värvimine

Munandeid leotati 10% formaliinis 24 tundi ja säilitati temperatuuril 4 °C. Kuded olid mikrosuuruses ja kinnitatud slaidi külge. Pärast fikseerimist (95% metanool + 5% äädikhapet) sukeldati objektiklaasid 3 minutiks hematoksüliini, pesti 5 minutiks jooksva veega ja seejärel leotati neid 50%, 70% ja 90% alkoholiga. üks minut. Pärast seda värviti slaide eosiiniga 10 sekundit ja leotati 100% alkoholis üks minut, kuni see tuhmus. Lõpuks leotati slaidi üks minut ksüleenis. Hiljem slaid kuivatati õhu käes ja suleti. Värvitud toru asetati morfoloogia jälgimiseks pöördfaasi kontrastmikroskoobi (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokyo, Jaapan).

Hüpotalamuse analüüs

Hiire KISS1, G-valguga seotud retseptor (GPR) 54, tsütokiini signaaliülekande supressor 3 (SOCS-3) ja sirtuiin 1 (SIRT1) geenijärjestused tuvastati NCBI (National Center for Biotechnology Information) geenide andmebaasist. ja konkreetne praimer töötati välja, kasutades Primer 5.{8}} PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Katses kasutatud praimerid on loetletud tabelis 1.

Ribonukleiinhappe (RNA) ekstraheerimine hüpotalamusest. RNA ekstraheerimine aju hüpotalamusest viidi läbi RNeasy Lipid Tissue Mini Kit abil. Saadud mRNA-sid mõõdeti kvantitatiivselt pöördtranskriptsiooni (RT) ja polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil. RT analüüsist saadud kompliment-DNA-d säilitati hilisemaks kasutamiseks temperatuuril –20 ◦C. Ekstraheeritud DNA-le viidi läbi polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüs, kasutades Taq polümeraasi. Seejärel võeti 5-10 µl PCR produkti ja analüüsiti elektroforeesiga 1,5% agarkolloidil. Pilt tehti UVP BioDoc-It pildisüsteemis. Võeti pöördtranskribeeritud komplementaarne desoksüribonukleiinhape (cDNA) ja viidi läbi PCR, kasutades komplekti IQ SYBR Green Supermix. Hiljem analüüsiti seda iQTM 5 optilise süsteemi tarkvaraga. Valgud ekstraheeriti valgu ekstraheerimisreagendi (T-PER) abil. Seejärel lisati 400 µl T-PER-ile 20 mg munandihomogenaati ja tsentrifuugiti (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Saksamaa) temperatuuril 4 °C (125,000 × g). ) 20 minutiks. Järgmine meetod oli sarnane "valgu tuvastamise ja kvantifitseerimise analüüsiga" in vitro analüüsis.

2.3. Statistiline analüüs

Katsetulemused väljendati keskmise ± standardhälbena (keskmine ± SD) ja andmeid analüüsiti, kasutades tarkvara Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.{1}}, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil. Erinevate rühmade mitut võrdlust analüüsiti Duncani testiga olulise tasemena p < 0,05.

3. Tulemused

3.1. In vitro analüüs

3.1.1. ECH, CTE ja RES antioksüdantide aktiivsuse võrdlus

Pikaajaline hkõrge oksüdatiivne stress ja krooniline põletik on diabeedi peamised põhjusedtüsistused [16]. CTE-d sisaldavad erinevaidfenüületanoidglükosiidid nagu ehhinakosiid(ECH) ja akteosiid, millel on potentsiaal antioksüdantseks toimeks [17]. DPPH radikaalide eemaldamineECH antioksüdantse aktiivsuse hindamiseks viidi läbi test. Trolox ja resveratrool(3,5,4'-trihüdroksüstilbeen, RES) võeti vastavalt standardseks ja positiivseks kontrolliks. Nagu näidatudjoonisel1, näitas ECH paremat radikaali eemaldamise aktiivsust ja aktiivsus oli oluliselt suuremkui positiivse kontrolli (RES) oma.

3.1.2. ECH rakkude elujõulisus LC-540 ja TM3 Leydigi rakkudes

ECH erinevate kontsentratsioonide rakkude elujõulisuse hindamiseks viidi läbi MTT test. LC-540 Leydigi rakkude ja TM3 Leydigi rakkude elujõulisus oli pärast ECH-ga töötlemist enam kui 80% (joonis 2). Võrreldes teiste kontsentratsioonidega näitas ECH 100-µM kontsentratsioon (lahjendused 100 µM 2% FBS-s) TM3 Leydigi rakkudes paremat rakkude elujõulisust. Tulemus näitas, et ECH suurenenud kontsentratsioon ei põhjusta rakkudele olulist toksilisust.

3.1.3. ECH mõju AGE-indutseeritud superoksiidi tootmisele NBT testiga LC-540 ja TM3 Leydigi rakkudes

AGE-d põhjustavad organismis oksüdatiivseid kahjustusi glükoosi oksüdeerumise ja vabade radikaalide, nagu O2-, hüdroksüülradikaalide ja karbonüülrühmade moodustumise tõttu [18]. Pärast stimuleerimist 50 ug/ml AGE-dega töödeldi LC-540 (joonis 3a) ja TM3 (joonis 3b) rakke ECH ja RES-iga (mõlemad 5 µM ja 10 µM). Tulemused näitasid, et superoksiidi aniooni produktsioon suurenes kontrollrühmas (stimuleeritud AGE-d), kuid superoksiidi aniooni tootmine vähenes pärast kontrollrühma (stimuleeritud AGE-d), kuid superoksiidi aniooni produktsioon vähenes pärast superoksiidi tootmist ja kaitstud. rakud oksüdatiivsete kahjustuste eest. LC-540 rakkude puhul näitas 10 µM ECH peaaegu sarnast aktiivsust normaalse rühmaga. Superoksiidi tootmine mõlemas rakus vähenes nii ECH kui ka RES kontsentratsiooni suurenemisega.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. ECH mõju H2O2 tootmisele AGE-stimuleeritud LC-540 Leydigi rakkudes

Oksüdatiivsete liikide olemasolu tuvastamiseks viidi läbi DCFH-DA test. Pärast rakkudesse sisenemist oksüdeerub fluorestseeruv värv DCFH-DA rakusisese H2O2 toimel ja moodustab diklorofluorestseiini (DCF). Nagu on näidatud joonisel 4, suurenes rakusisene H2O2 tootmine AGE-stimuleeritud rühmas (kontroll), samas kui 10 uM ECH ja RES lisamine vähendas oluliselt H2O2 tootmist rakkudes. 10 µM ECH manustamine andis tulemuseks vaid umbes 47,1% H2O2 produktsioonist, mis on oluliselt madalam kui kontrollrühmas.

3.1.5. ECH mõju RAGE ja NF-κB valgu ekspressioonitasemetele AGE-stimuleeritud LC-540 Leydigi rakkudes

RAGE esinemise kinnitamiseks LC-540 Leydigi rakkudes viidi läbi Western blot analüüs. ECH mõju RAGE (joonis 5a) ja NF-κB (joonis 5b) valgu ekspressioonitasemetele AGE-dega stimuleeritud Leydigi rakkudes on näidatud joonisel 5. Tulemused näitasid, et AGE-de kontsentratsioon 50 µg/ml kutsus esile kõrgema RAGE ja NF- κB ekspressioon LC-540 Leydigi rakkudes ja 10 µM ECH ja RES kontsentratsioon vähendasid oluliselt RAGE ja NF-κB ekspressiooni. NF-κB ekspressioon oli RES ja ECH puhul oluliselt madalam kui RAGE antagonistides. Seega kinnitasid tulemused, et ECH vähendas põletiku taset, vähendades RAGE ja NF-κB taset.

3.1.6. ECH mõju testosterooni sünteesi rajale AGE-stimuleeritud LC-540 Leydigi rakkudes.

Spermatogeneesi ja meeste viljatuse protsess sõltub testosterooni olemasolust. Nagu on näidatud joonisel 6, vähenesid StAR-i (joonis 6a), CYP11A1 (joonis 6b), CYP17A1 (joonis 6c) ja HSD17 3 (joonis 6d) valkude ekspressioon AGE-stimuleeritud LC-s oluliselt }} Leydigi rakud (kontrollrühm). Valkude StAR, CYP11A1, CYP17A1 ja HSD{16}} ekspressioon suurenes märkimisväärselt, kui lisati RAGE antagonist, RES ja ECH. StAR ja CYP11A1 valkude suurenenud ekspressiooni täheldati nii ECH- kui ka RES-ga töödeldud rühmas. CYP17A1 ekspressioonitase oli RES ja ECH rühmades peaaegu sarnane. HSD17 3 valgu ekspressioon ECH-ga töödeldud Leydigi rakkudes oli palju kõrgem kui RES ja RAGE antagonistiga töödeldud rakkudes. Valkude StAR, CYP11A1, CYP17A1 ja HSD{30}} suurenenud ekspressioon viitas testosterooni normaalsele tootmisele.