Cistanche Tubulosa ekstraktide mõju isaste reproduktiivfunktsioonile streptosototsiini ja nikotiinamiidi poolt indutseeritud diabeetiliste rottide puhul – Ⅱ

3.2. In vivo analüüs

3.2.1. CTE mõju kehakaalule ja kalorite tarbimisele

Pärast 6-nädalast katsetamist näitas diabeetikute rühm (HFD-DM) suuremat kehakaalu kui kontrollrühmal. HFD-DME4 rühmal oli väiksem kehakaal kui HFD-DM ja HFD-DMER rühmadel (joonis 7a). Kontrollrühma kalorite tarbimine oli oluliselt madalam kui teistes rühmades. Ülejäänud viie rühma kalorite tarbimise vahel ei olnud olulist erinevust (joonis 7b).

3.2.2. Suukaudne glükoositaluvuse test (OGTT) diabeedi eduka esilekutsumise määramiseks

Suukaudset glükoositaluvuse testi (OGTT) kasutatakse paljutõotava vahendina suhkurtõve tuvastamiseks. Vere glükoosisisalduse tõus näitab diabeetilist seisundit. Nagu on näidatud joonisel 8a, oli plasma glükoosisisaldus CTE rühmades madalam kui DM rühmas 0, 30, 90 ja 120 minuti pärast. Lisaks näitas plasma glükoosikontsentratsiooni kõveraalune pindala (AUC), et CTE ja RSG rühmades suurenes vere glükoosi omastamise kiirus (joonis 8b).

3.2.3. Plasma glükoosi, kolesterooli ja triglütseriidide üldsisaldus

Plasma tühja kõhu glükoosisisaldus oli kõrgem DM rühmas ja madalam DME2 rühmas (välja arvatud kontroll) kui teistes. Rühmade vahel, välja arvatud DME4 rühm, üldkolesterooli tasemes olulist erinevust ei olnud. DME4 rühmas oli kolesteroolitase madalam kui teistel. Triglütseriidide tase oli kõrgem DM rühmas ja madalam DME4 rühmas ning triglütseriidide sisaldus vähenes koos CTE kontsentratsiooni suurenemisega (tabel 2). Tulemused näitavad, et plasma glükoosi, kolesterooli ja triglütseriidide tase oli kõrgem DM-i rühmas ja CTE-ravi korral vähenes see oluliselt.

3.2.4. Plasma insuliini tase, plasma leptiini tase ja homöostaasi mudeli hindamine – insuliiniresistentsuse (HOMA-IR) väärtused

Plasma insuliini, leptiini ja HOMA-IR väärtused on näidatud tabelis 3. DM rühmas oli plasma insuliini ja plasma leptiini tase kõrgem kui kontrollrühmal. HOMA-IR indeks oli samuti oluliselt kõrgem DM rühmas. CTE kontsentratsiooni suurenemisega vähenesid plasma insuliini, leptiini ja HOMA-IR väärtused. Plasma leptiin vähenes oluliselt CTE rühmades, kuid RSG ravimirühm (DMR) ei näidanud olulist erinevust DM rühmast.

3.2.5. CTE mõju plasma LH ja testosterooni tasemele diabeetilistel rottidel

Nagu on näidatud tabelis 4, vähenesid diabeetiliste rottide testosterooni kontsentratsioonid oluliselt, samas kuitestosterooni kontsentratsioon on oluliselt suurenenuderinevates CTE annustes. Lisaks näitasid tulemused LH taseme kerget langust DM rühmas võrreldes DMR, DME1, DME2 ja DME4-ga. LH produktsioon oli suurem DME4 rühmas.

3.2.6. CTE mõju diabeetiliste rottide sperma parameetritele

Katsetulemused näitasid, et DM rühmas oli spermatosoidide arv ja liikuvus oluliselt vähenenud kui kontrollrühmas, samas kui spermatosoidide ebanormaalsuse määr oli DM rühmas oluliselt suurenenud. Huvitaval kombel paranesid DMR-rühma spermatosoidide arv, spermatosoidide liikuvus ja spermatosoidide ebanormaalsuse määr, kuid spermatosoidide liikuvus ei saavuta DME4-ga võrreldes olulist taset. DME2 näitas paremat spermatosoidide arvu kui neil kõigil ja DME4 rühmas oli liikuvus märkimisväärselt suurenenud. RSG- ja CTE-ga ravitud rühmade vahel ei esinenud olulist erinevust ebanormaalsete spermatosoidide arvu vahel (tabel 5).

3.2.7. CTE mõju diabeetiliste rottide seemnetorukeste morfoloogiale

Joonisel 9 on näidatud munandiosa H&E värvimine. Must nool tähistab Leydigi rakku ja valge nool Sertoli lahtrit. Nii Leydigi rakk kui ka Sertoli rakk DM rühmas näitasid olulist atroofiat ja luumenis nähti õõnsust. Leydigi rakkude ja Sertoli struktuur taastati CTE- ja RSG-ga töödeldud rühmades. Seemnetorukeste paksus oli suurem CTE ja RSG rühmades kui DM rühmas.

3.2.8. CTE mõju KiSS1, GPR54, SOCS-3 ja SIRT1 MRNA-dele diabeetiliste rottide hüpotalamuses

KiSS1 (joonis 10a), GPR54 (joonis 10b), SOCS-3 (joonis 10d) ja SIRT1 (joonis 10c) ekspressioon on näidatud joonisel 10. KiSS1 ja retseptori GPR54 mRNA ekspressioon diabeetilistel rottidel oli oluliselt madalam kui kontrollrühmas. KiSS1 ja GPR 54 mRNA ekspressioonitasemed DMR-is, DME1-s, DME2-s ja DME4-s suurenesid märkimisväärselt. Täpsemalt, GPR54 mRNA ekspressioon suurenes oluliselt DME4-s ja oli peaaegu sarnane kontrollrühmaga.

LOODUSLIK TUBULOOS TESTOSTEROONI TOOTMISE KAITSMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Selles katses uuriti täiendavalt SOCS-3 ja SIRT1 mRNA-de kogust rottide hüpotalamuses. SOCS-3 mRNA ekspressioon diabeetilistel rottidel suurenes märkimisväärselt, mis näitab, et leptiini impedants oli tõsisem. DMR, DME1, DME2 ja DME4 rühmad näitasid diabeetikute rühmaga võrreldes olulist paranemist. SIRT1 mRNA ekspressioon DM rühmas vähenes oluliselt ja suurenes oluliselt DME1 ja DME4 rühmades.

3.2.9. CTE mõju diabeetiliste rottide plasmas ja munandites sisalduvatele antioksüdantsetele ensüümidele

Tabel 6 näitab, et diabeetiliste rottide plasma SOD aktiivsus, GPx aktiivsus ja katalaasi aktiivsus vähenesid oluliselt ning aktiivsused suurenesid CTE- ja RSG-ga ravitud rühmades. Lisaks sellele näitas DME4 GPx-i aktiivsuse märkimisväärset paranemist kui teised. Tulemused näitasid, et SOD ja katalaasi aktiivsus diabeetilistel rottidel vähenes kuue nädala pärast oluliselt. DMR rühma SOD ja katalaasi aktiivsus ei saavuta märkimisväärset taset. CTE-ga töödeldud rühmad näitasid SOD ja katalaasi aktiivsuse olulist paranemist. Katalaasi ja SOD suurenenud aktiivsust CTE rühmades täheldati ka munandites (tabel 7). SOD ja katalaasi kõrgeim aktiivsus täheldati vastavalt DME1 rühmas ja DME2 rühmas.

3.2.10. CTE mõju diabeetiliste rottide plasma ja munandite oksüdatiivsele stressile ja põletikule

Lämmastikoksiidi (NO) tootmine plasmas (joonis 11a) ja munandites (joonis 11b) on näidatud joonisel 11. NO produktsioon DM rühmas oli kontrollrühmaga võrreldes oluliselt suurenenud nii munandites kui ka plasmas. NO tootmise järkjärgulist vähenemist täheldati DME1, DME2 ja DME4 rühmades (plasmas). DMR rühm näitas ka NO tootmise olulist vähenemist. Munandite puhul täheldati CTE rühmades NO tootmise kerget vähenemist, samas kui DMR rühm ei vähendanud oluliselt NO tootmist.

Nagu on näidatud joonistel 12 ja 13, tõusid TNF- ja IL-6 tasemed diabeetilistel rottidel oluliselt (nii plasmas kui ka munandites), mis näitab, et põletik on tõsisem. Plasmas on TNF-i tase CTE- ja RSG-ga ravitud rühmades sarnane (joonis 12a). CTE rühmad vähendasid oluliselt (eriti DME2) TNF-i taset munandis (joonis 12b). IL-6 tase vähenes oluliselt CTE ja RSG rühmade plasmas (joonis 13a). Munandites täheldati IL-i -6 taseme langust, kuid see ei saavutanud märkimisväärset taset (joonis 13b).

3.2.1.1. CTE mõju kõrge rasvasisaldusega dieedist põhjustatud oksüdatiivsele stressile ja põletikule diabeetiliste rottide spermatosoidides

Joonisel 14 on näidatud superoksiidi anioonide sisaldus roti spermas. Tulemused näitasid, et superoksiidi anioonide produktsioon diabeetiliste rottide spermas suurenes oluliselt ja DMR rühmas olulist paranemist ei täheldatud. DME1 ja DME4 rühmad näitasid oluliselt vähenenud superoksiidi aniooni tootmist.

3.2.12. CTE mõju rasvarikka dieedi poolt põhjustatud lipiidide peroksüdatsioonile diabeetiliste rottide spermatosoidides

Uuringud on näidanud, et lipiidide peroksüdatsioon suurenes nii 1. kui ka 2. tüüpi diabeediga patsientidel [19]. Malondialdehüüdi (MDA) tase plasmas, spermas ja munandites on näidatud tabelis 8. MDA tase plasmas, munandites ja spermatosoidides DM rühmas oli oluliselt kõrgem ning ravi CTE ja RSG-ga vähendas MDA tootmist. Plasma DME4 ja DMEI rühmades täheldati olulist vähenemist. Selles uuringus leiti, et diabeetikutel rottidel ei suurendatud mitte ainult lipiidide peroksüdatsiooni taset plasmas, vaid ka munandites ja spermatosoidides. Märkimisväärset paranemist täheldati erinevate CTE annuste kasutamisel.

4. Arutelu

Suhkurtõbi on krooniline haigus, mis on seotud kõrge veresuhkru tasemega. Tasakaalustamatus antioksüdantide ja ROS-i taseme vahel põhjustab seisundit, mida nimetatakse oksüdatiivseks stressiks. Superoksiid, hüdroksüülradikaal, vesinikperoksiid, lämmastikoksiid ja singletthapnik on mõned näited ROS-ist, mis oksüdatiivse stressi kaudu aitavad kaasa diabeedi seisunditele [20].Cistanche tubulosaon kõrbetaim, mis sisaldab aktiivseid komponente nagupolüsahhariidid, oligosahhariidid, fenüületanoidglükosiidid (ehhinakosiid, verbaskosiid), palmitiinhape, linoolhape, iridoidid, alditoolid ja lignaanid. See taim on võimeline tootma põletikuvastast, neuroprotektiivset, antibakteriaalset, viirusevastast, antioksüdatiivset, kasvajavastast ja immunomoduleerivat toimet [21]. Kirjanduse uuringud näitavad, et Cistanche tubulosa fenüületanoidglükosiidid on antioksüdantse aktiivsuse peamine põhjus [22]. In vitro ja in vivo uuringutes võeti positiivseks kontrolliks vastavalt resveratrool (RES) ja rosiglitasoon (RSG). RSG on võimas insuliini sensibilisaator ja sellel on afiinsus peroksisoomi proliferaator-aktiveeritud retseptori (PPARc) isovormi suhtes. See kontrollib diabeediga patsientide hüperglükeemiat [23]. RES-il on loomulik antioksüdantne toime ja see toimib vasodilataatorina, reguleerides lipoproteiinide metabolismi, pärssides trombotsüütide agregatsiooni ja ennetades vähki [24,25]. Meie uurimine näitas, et ECH näitab paremat radikaali eemaldamise aktiivsust kui CTE ja RES (joonis 1). Samuti on arusaadav, et ECH ei põhjusta olulist toksilisust LC-540 ja TM3 Leydigi rakkudele (joonis 2).

LOODUSLIK TUBULOOS MEESTE seksuaalfunktsionaalsusele PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGE-sid kasutati stressitingimuste esilekutsumiseks Leydigi rakkudes. AGE-de tootmine, põletik, oksüdatiivne stress ja diabeet on omavahel seotud. Diabeedi hüperglükeemiline seisund soodustab rakkude vigastusi AGE-de tootmise ja oksüdatiivse stressi kaudu. AGE-d kutsuvad esile rakkude toksilisuse, mis soodustab veelgi immuunrakkude värbamist ja rakusurma. Kõrgenenud AGE-de tase soodustab kahte tüüpi retseptorite, mida nimetatakse RAGE ja AGER1, ekspressiooni [26]. Elektroni tilkumine ja sellele järgnev ülekandmine mitokondriaalsest hingamisahelast molekulaarsesse hapnikku oksüdatiivse stressi ajal põhjustab superoksiidi aniooni moodustumist. Meie tulemused näitavad, et AGE-de poolt indutseeritud superoksiidi aniooni tootmine suurenes kontrollrühmas ja nii ECH- kui ka RES-ravi puhul täheldati edasist paranemist. Meie uuringu kohaselt saadi aru, et AGE-de poolt indutseeritud superoksiidi (joonis 3) ja H2O2 (joonis 4) tootmine vähenes ECH ja RES juuresolekul.

NF-κB on tuntud kui oluline diabeediga seotud põletiku vahendaja [27]. NF-κB ekspressioon põhjustab raku düsfunktsiooni ja rakusurma. NF-κB aktiveerimine oksüdatiivse stressi poolt stimuleerib põletikueelset vastust, endoteliini ülesreguleerimist ja apoptoosi [28]. RAGE ja NF-κB ekspressioon suurenes AGE-stimuleeritud rühmades ja järgnevat vähenemist täheldati ECH- ja RES-ga töödeldud rakkudes (joonis 5).

Testosteroonon anaboolne steroid ja esmanemeessuguhormoonsünteesitakse kolesteroolist. Protsess algab kolesterooli külgahela oksüdatiivse lõhustamisega kolesterooli külgahela lõhustamise geeni (CYP11A) poolt. See geen paikneb mitokondriaalses membraanis ja muudab kolesterooli pregnenolooniks. Järgmisena eemaldab endoplasmaatilisest retikulumist pärinev CYP17A1 geen kaks täiendavat süsinikuaatomit ja toodab mitu C19 steroidi. Lisaks sellele oksüdeeritakse pregnenoloon hüdroksüsteroiddehüdrogenaasi (3- -HSD) toimel androsteendiooniks/progesterooniks. Lõpuks toodetakse testosterooni ketorühma redutseerimisel androsteendiooni 17. süsiniku positsioonis 17-beeta-hüdroksüsteroiddehüdrogenaasi (17- -HSD) toimel. Leydigi rakud osalevad peamises testosterooni tootmises. Kolesterooli ülekandmine sisemisse mitokondriaalsesse membraani nõuab steroidogeense ägeda regulatoorse valgu (StAR) toimet. Praegused uuringud näitavad, et StAR, CYP11A1, CYP17A1 ja HSD17 3 ekspressioon vähenes AGE-ga töödeldud rakkudes (kontroll) ning ECH- ja RES-ga töödeldud rakkudes ilmnes tohutu tõus (joonis 6). . Seega näitavad tulemused, et tootminetestosterooni tase tõusis ECH- ja RES-ravi saanud rühmades. 

LOODUSLIK TUBULOOS SEKSUÕIMU PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diabeedi korral on glükoosi transport elunditesse piiratud ja selle tulemusena suureneb glükoosisisaldus [29]. Seega on hüperglükeemiline seisund üks olulisemaid diabeedi tuvastamise markereid. Meie uuringud näitavad, et plasma glükoosisisaldus tõusis diabeetikute rühmades ja DM rühma AUC oli oluliselt kõrgem kui teistes rühmades (joonis 8). Koos plasma glükoosiga suurenes DM rühmas oluliselt üldkolesterooli ja triglütseriidide sisaldus (tabel 2). Ateroskleroosi soodustab kolesterooli ja triglütseriidide taseme tõus [30]. Kuid kolesterooli ja triglütseriidide tase langes CTE- ja RSG-ga ravitud rühmades. DME4 rühma triglütseriidide sisaldus saavutas kontrollrühmaga peaaegu sarnased väärtused.

Insuliin on kõhunäärme rakkude poolt toodetud hormoon, mis on funktsionaliseeritud veresuhkru taseme kontrollimiseks kehas, samas kui leptiin on adipotsüütide poolt toodetud hormoon, mis on võimeline reguleerima toidu tarbimist ja energiakasutust. Uuringud näitasid, et leptiin osaleb rasvumise patofüsioloogias ning leptiini ja insuliini vahel on positiivne koostoime [31]. Meie uuringud näitavad, et plasma inuliini ja leptiini tase oli kõrgem DM rühmas ja insuliini tase vähenes CTE kontsentratsiooni suurenemisega. RSG rühm ei näita olulist erinevust DM rühmast. Insuliiniresistentsust ja rakkude funktsiooni hinnati HOMA-IR meetodil. HOMA-IR väärtus tõusis DM rühmas ja erines oluliselt teistest rühmadest (tabel 3).

DM mõjutab reproduktiivfunktsiooni HPG telje hormonaalse vaheldumise kaudu ja uuringud näitasid, et insuliini ekspressiooni munandites mõjutab ka diabeet. Seda iseloomustab Sertoli rakkude vakuolisatsioon, suurenenud DNA fragmentatsioon, halvenenud spermatogenees ja suurenenud sugurakkude ammendumine. Oksüdatiivne stress aitab kaasa ka reproduktiivfunktsiooni kõrvalekalletele [32]. Sperma moodustumise protsessi meeste suguelundis (munandites) nimetatakse spermatogeneesiks. Munand koosneb tihedalt keerdunud tuubulitest, mida nimetatakse seemnetorukesteks. Sertoli rakke on näha seemnetorukese seintes ja need toidavad ebaküpset spermat. Sperma parameetrite uurimine näitas, et DM rühmas vähenes spermatosoidide arv ja liikuvus ning suurenesid kõrvalekalded (tabel 5). CTE- ja RSG-ga ravitud rühmades täheldati vastupidist efekti. Nii Leydigi rakk kui ka Sertoli rakud DM rühmas näitasid olulist atroofiat ja õõnsust nähti luumenis. Seemnetorukeste paksus vähenes ka DM rühmas. CTE- ja RSG-ga ravitud rühmades täheldati paremat tulemust (joonis 9). Lisaks sellele langes LH ja testosterooni tase DM rühmas ning tõusis CTE-ga ravitud rühmades (tabel 4). Meestel seostati madalat seerumi testosterooni taset ja madalamat LH pulsisagedust sageli rasvumise ja II tüüpi suhkurtõvega [33].

KiSS1 geeni poolt kodeeritud kisspeptiinid on tuntud kui HPG telje tugevad stimulaatorid ja mis tahes mutatsioon kisspeptiini geenis viib sugusteroidide ja gonadotropiini madala tasemeni. Uuringud näitavad, et STZ-indutseeritud diabeetilistel rottidel vähenes Kiss1 mRNA tase [33]. Imetajate viljatuse algus ja säilimine on seotud G-valguga seotud retseptoriga 54 (GPR54). GPR 54 mutatsiooni iseloomustab seksuaalse küpsemise puudumine ja gonadotroopsete hormoonide (LH ja FSH) madal tase. Põletikueelsed tsütokiinid, nagu IL-6 ja TNF, reguleerivad üles tsütokiini signaaliülekande 3 (SOCS3) supressori ekspressiooni, mis on seotud põletiku poolt vahendatud insuliiniresistentsusega maksas ja adipotsüütides [34]. SIRT 1 on geen, mis on seotud mitmete vananemishaiguste regulatsiooniga. See geen ekspresseerub silmatorkavalt kõhunäärme rakkudes ja reguleerib insuliini sekretsiooni ja takistab apoptoosi. Praegused uuringud näitasid, et KiSS1, GPR54 ja SIRT1 ekspressioon vähenes DM rühmas, kuid ekspressioon suurenes CTE-ga ravitud rühmades (joonis 10). SOCS-3 ekspressioonide suurenemine DM rühmas näitab põletikulist seisundit. Esimene rasvumise ja põletiku vahel tuvastatud molekulaarne seos oli TNF-. Seega on TNF-i suurenenud tase põletiku näitaja. CTE-ga ravitud rühmades täheldati põletikueelsete tsütokiinide (nt TNF- ja IL{27}}) vähenemist (joonised 12 ja 13).

Tasakaalustamatus ROS-i ja antioksüdantide vahel põhjustab diabeetilise seisundi. Superoksiiddismutaas (SOD), katalaas (CAT) ja glutatioonperoksüdaas (GPX) on tuntud kui peamised antioksüdandid, mis vastutavad optimaalse ROS-taseme säilitamise eest [35]. Tulemustest selgus, et DM rühmas oli antioksüdantide aktiivsus oluliselt madalam. CT-ga töödeldud rühmad näitasid antioksüdantide tootmise paranemist. RSG-ga ravitud rühmas ei ilmnenud antioksüdandi aktiivsuse olulist paranemist (tabelid 6 ja 7).

Lämmastikoksiid (NO) on tuntud kui oluline ROS, mis soodustab põletikku. Meie uuringud näitavad, et NO tase langes CTE-ga ravitud rühmades (joonis 11). Tulemused näitasid, et diabeetiliste rottide sperma superoksiidi anioonide sisaldus suurenes oluliselt ja pärast RSG manustamist ei toimunud olulist paranemist. CTE rühmades vähenes superoksiidi tootmine.

MDA määramine on lipiidide peroksüdatsiooni hindamiseks väga kasulik. Lipiidide peroksüdatsioon on lipiidide oksüdatsiooniprotsess, mis lõpuks põhjustab rakukahjustusi. MDA tekib polüküllastumata rasvhapete lipiidide peroksüdatsiooni tulemusena. Uuringud näitavad, et MDA tase on korrelatsioonis vanuse ja tühja kõhuga veresuhkru tasemega [36]. Praegune uuring näitas, et CTE parandab lipiidide peroksüdatsiooni plasmas, munandites ja spermas (tabel 8).

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Järeldused

Oksüdatiivne stress diabeetiliste seisundite ajal häirib meeste reproduktiivsüsteemi sperma kahjustuse ja sugunäärmete düsfunktsiooni tõttu. Cistanche tubulosa on oma farmakoloogilise toime tõttu Hiina meditsiinis laialdaselt tunnustatud kõrbetaim.ehhinakosiid (ECH)on CTE peamine koostisosa, mis vastutab selle antioksüdantse ja põletikuvastase toime eest. Meie in vitro tulemused näitasid, et ECH taastas testosterooni sünteesi raja ja alandas NF-κB ja RAGE valgu ekspressiooni taset. ECH inhibeeris tõhusalt superoksiidi aniooni ja H2O2 tootmist Leydigi rakkudes. In vivo uuringud näitasid, et ECH vähendas kolesterooli, triglütseriidide, TNF- ja IL-6 taset. Lisaks sellele paranesid oluliselt mRNA ekspressioonid diabeetiliste rottide hüpotalamuses. Samuti tuleb märkida, et ECH vähendas lipiidide peroksüdatsiooni ja parandas insuliiniresistentsust diabeetilistel isastel rottidel. Antioksüdantide aktiivsus suurenes nii plasmas kui ka munandites. Seetõttu näitasid meie uuringud, et ECH pakkus STZ-indutseeritud diabeetilistel isastel rottidel tõhusat kaitset reproduktiivfunktsiooni häirete eest.