Cistanche Tubulosa ekstraktide mõju isaste reproduktiivfunktsioonile streptosototsiini ja nikotiinamiidi poolt indutseeritud diabeetiliste rottide puhul

Märksõnad:diabeet; viljatus;Cistanche tubulosaväljavõte(CTE);ehhinakosiid(ECH);põletikuvastaneaktiivsus;antioksüdantaktiivsus;steroidogeneesmõjusid

Lisateavet cistanche ekstrakti pulbri eeliste kohta

1. Sissejuhatus

Suhkurtõbi (DM) on seisund, mille korral vere glükoosisisaldus on suurenenudpankrease ebatõhusus piisava insuliini tootmisel või keha võimetus seda kasutadatõhusalt. WHO andmetel tõusis diabeetikute arv 1980. aastal 108 miljonilt2014. aastal 422 miljonile [1]. On neli põhikategooriat: eeldiabeet (diabeedile eelnev staadium), 1. tüüp(kus kõhunääre ei tooda insuliini), tüüp 2 (organism ei suuda insuliini kasutada) ja rasedusaegnediabeet (mis esineb raseduse ajal). Oksüdatiivne stress tekib tasakaalustamatuse tõttureaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ja antioksüdantide tootmine [2] viib lõpuks diabeetilise seisundini.Diabeedi tüsistuste hulka kuuluvad neerupuudulikkus, närvikahjustus, pimedus, insult, südarünnak, loote surm ja viljatus. [1]. Uuringud näitavad, et spermatosoidide tuumad, desoksüribonukleiinhape (DNA),ja mitokondrid olid diabeediga meespatsientidel oluliselt kahjustatud [3]. Oksüdatiivne stress ajalsperma transportimine muudab meeste reproduktiivsüsteemi protsessi [4,5]. 

Spermatogeneesi protsessi kontrollib hüpotalamus-hüpofüüs-sugunäärmed (HPG)telg. Hüpotalamuse toodetav gonadotropiini vabastav hormoon (GnRH) stimuleeribluteiniseeriva hormooni (LH) ja folliikuleid stimuleeriva hormooni (FSH) tootmine. Leitakse Leydigi rakudseemnetorukeste kõrval ja toodavad LH kontrolli all testosterooni. FSH vallandabantigeeni siduva valgu (ABP) tootmine, mis aitab läbi viia meessuguhormooni. Seega viljatusja muud probleemid tekivad peamiselt HPG teljel esinevate häirete tõttu. Haldaminestreptozototsiini-nikotiinamiidi kombinatsioon kutsub eksperimentaalsetel rottidel esile diabeedi. Streptozototsiinon insuliini tootmisele mürgine keemiline ühend pankrease rakud ja nikotiinamiid on avees lahustuv vitamiin, mis kaitseb rakud täieliku kahjustuse eest [6]. Cistanche tubulosaon kõrbetaimeliik, mida tuntakse ka kui "Rou Cong-Rong" [7]. See onmitteklorofülliline parasiitaim, mis kasvab peamiselt juurtelCalotropis procerapuu ja onlaialt levinud Gansu, Qinghai, Xinjiangi, Mongoolia, Iraani ja India kuival maal. ÜldinenimiCistanche tubulosaon "Kõrbehüatsint". See on Hiina traditsioonilises meditsiinis laialdaselt aktsepteeritudja talle on antud nimi "Kõrbe ženšenn". Seda kasutatakse laialdaselt meditsiinishaigusliku leukorröa, rikkaliku metrorraagia, krooniliste neeruhaiguste, kõhukinnisuse, impotentsuse javiljatus. Keemilised koostisosadCistanche tubulosakoosnevad mittelenduvatest fenüületanoidglükosiididest(PHG-d), iridoidid, lignaanid, lenduvad õlid, alditoolid, oligosahhariidid ja polüsahhariidid [8]. Uuringudnäitavad, et selle ürdi ehhinakosiid kaitseb kahjustatud fibroblaste, reguleerides ROS-i taset [9]. See ühend tekitab koos antioksüdante, vasorelaksatsiooni ja põletikuvastast toimetneuroprotektsioon ja osteoporoosi ennetamine [10,11]. Selle uuringu eesmärk oli uurida selle mõjuCistanche tubulosaväljavõtemis sisaldab ECH-dstreptozototsiini-nikotiinamiidi poolt indutseeritud diabeetilise roti reproduktiivfunktsiooni häired.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Materjalid

ECH ja CTE osteti ettevõttelt Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Täpsemaltglükatsiooni lõpp-produktid (AGE) osteti ettevõttest Biovision (San Francisco, CA, USA). LC-540ja TM3 rakuliinid osteti toiduainetööstuse uurimis- ja arendusinstituudist(Hsinchu, Taiwan). Viie nädala vanused Sprague-Dawley (SD) isasrotid osteti ettevõttestNational Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Sööda labori dieet® osteti PMI-stNutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüül (DPPH) saadiSigmast (St. Louis, MO, USA). Metanool ja 4-(2-hüdroksüetüül)-1-piperasiinetaansulfoonhapehape (HEPES) osteti samuti firmalt Sigma. Dulbecco modifitseeritud Eagle medium/F12 jatrüpsiin-EDTA saadi firmalt GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid (MTT), diklorodihüdroflfluorestseiindiatsetaat (DCFH-DA), dimetüülsulfoksiid (DMSO) ja nitroblue tetrasoolium (NBT) osteti firmalt Sigma. Ensümaatiline glükooskomplektid saadi Kyokutoseiyakust, Tokyost, Jaapanist. Osteti insuliini ELISA komplektidfirmalt Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Rootsi). T-PER koevalgu ekstraheerimineReaktiiv hangiti firmast Thermo Scientifific (Chicago, IL, USA). Inimese/hiire/roti vastane tuumaenergiategur-kappa B NF-κB polüklonaalsed antikehad osteti Santa Cruz Biotechnology'st, SantaCruz, CA, USA. Hiire/roti vastane retseptor täiustatud glükatsiooni lõpptoodete (RAGE) polüklonaalseks kasutamiseksantikehad, anti-inimese/hiire/roti STAR polüklonaalsed antikehad ja inimese/hiire/roti vastasedTsütokroom P450 17A1 monoklonaalsed antikehad osteti ettevõttest Gene Tex (Irvine, CA, USA).Inimese/hiire/roti vastased CYP11A1 polüklonaalsed antikehad saadi ettevõttest Cell SignalingTehnoloogia (Beverly, PA, USA). Easy-Blue reaktiiv osteti firmalt Invitrogen, Thermo FisherTeaduslik (Carlsbad, CA, USA). Agaroos ja DNA marker 100 bp saadi firmalt Promega,Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit osteti ettevõttelt QIAGEN,Hilden, Saksamaa.

5 protsenti CO2 inkubaator (CO2 inkubaator, Napco 5410, Taiwan). TM3 rakuliini kultiveeriti Dulbeccosmodifitseeritud Eagle sööde (DMEM), millele on lisatud glükoosi (4,5 g/l), naatriumpüruvaadi (0,5 mM),L-glutamiin (2,5 mM), naatriumvesinikkarbonaat (1,2 g/L), 4-(2-hüdroksüetüül)-1-piperasiinetaansulfoonhapehape (HEPES, 15 mM) ja vasika loote seerum (FCS, 10 protsenti) või hobuse seerum (5 protsenti) 37 °C juures◦C 5 protsentiCO2 inkubaator.

Ehhinakosiidi (ECH) rakkude elujõulisuse määramine: 3-(4, 5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-rakkude elujõulisuse testis kasutati difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) reaktiivi. Rakkude kontsentratsioonkohandati 2-le× 105rakke / ml 96-süvendiga plaadil. Siis, 20µL ECH (lahjendatud 2% söötmega)lisati ja inkubeeriti 24 tundi 37 °C juures◦C 5% CO-s2 inkubaator. Hiljem, 100µL MTT reaktiiv olilisati ja inkubeeriti 4 tundi 37 °C juures◦C pimedates tingimustes. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 570 nm(ELISA lugeja, Dynatech MR5000, Kloten, Šveits).Rakkude suhteline elujõulisus (protsent)=[(Aproov lainepikkusel 570 nm− Atühi 570 nm juures)]/[(Akontroll 570 juures− Atühi 570 juures)] × 100.

Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) sisu analüüs:

Lahtri number kohandati2 × 105rakud/ml12-kaevuplaadil, mis sisaldab 2 protsenti FBS-i. Siis, 50µL/mL ECH, RES ja AGElisati plaadile ja inkubeeriti 37 °C juures◦C 24 tundi. 24 tunni pärast, 20 ,70 -diklorofluorestseiindiatsetaat(DCFH-DA) lisati ja inkubeeriti 37 °C juures◦C 30 minutit. Pärast tsentrifuugimist (400× g, 5 min),

ja AGE-d lisati ja inkubeeriti 37 °C juures◦C 5% CO-s2 inkubaator 24 tundi. Pärast 400µT-PER Llisati, kaabiti rakud maha ja tsentrifuugiti temperatuuril 125,000× g 20 minutiks (4◦C). Supernatantkoguti ja säilitati aadressil−80 ◦C (−80 ◦C sügavkülmik, Nuaire, Plymouth, MN, USA) edasiseks analüüsiks.

Valkude kvantifitseerimiseks kasutati bitsinhoniinhappe (BCA) komplekti. Siis, 10µL raku standardlahustja 200µL BCA reaktiivi lisati 8-süvendiga plaatidele ja inkubeeriti 37 °C juures◦C 5% CO-s2 inkubaator30 min. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 562 nm. Viidi läbi valgu tuvastamise analüüsnaatriumdodetsüülsulfaadi (SDS)-polüakrüülamiidgeeli (SDS-PAGE) elektroforeesiga. Proovid olidvalmistati valgu lüsaadi lisamisega valgu laadimispuhvrile ja viidi läbi Western blot analüüsspetsiifiliste valkude tuvastamiseks.

2.2.2. In vivo analüüs

Loomamudeli disain: kuuskümmend 4-nädalast isast Sprague–Dawley (SD) rotti ostetiNational Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Iga rott hoiti eraldi desinfitseerimisvahendisroostevabast terasest puurid kontrollitud temperatuuril (23± 1 ◦C) ja niiskus (40–60 protsenti) 12 tunnigavalguse/12 h pimeduse tsükkel. Toitu ja vett anti ad libitum. Iga rott kodustati esimeselnädalal ja määrati põhitoiduks laboratoorse näriliste dieet 5001. Kõik protseduurid järgisid standarditriikliku loomade hooldamise ja kasutamise institutsionaalse komitee (IACUC heakskiidu nr 101026)Taiwani ookeaniülikool, Taiwan. Pärast kodustamist jagati rotid kahte rühma: kontrollrühm (Con), keda toideti laboratoorse dieediga 5001, ja diabeetikute rühm, keda toideti kõrge rasvasisaldusega dieediga.(HFD, 40 protsenti) kogu katse jaoks. Pärast 4-nädalast HFD-ga toitmist diabeetikute rühmrottidele süstiti suhkurtõve (DM) esilekutsumiseks streptozototsiini (65 mg/kg) (STZ). Sees15 minutit pärast STZ süstimist süstiti nikotiinamiid (230 mg / kg kehamassi kohta). Nädal pärast süstimistSuukaudne glükoositaluvuse test (OGTT) viidi läbi, et teha kindlaks diabeedi edukas esilekutsumine.Mellitus (DM). Pärast seda jagati loomad kuue rühma: kontrollrühmad (toideti laboratoorse dieediga5001); DM rühm (DM pluss 45 protsenti HFD); DMR rühm (DM pluss rosiglitasoon: 0,571 mg/kg BW) pluss 45 protsenti HFD;DME1 rühm (DM pluss CTE: 80 mg/kg BW) pluss 45 protsenti HFD; DME2 rühm (DM pluss CTE: 160 mg/kg kehamassi kohta)pluss 45 protsenti HFD; ja DME4 rühm (DM pluss CTE: 320 mg/kg BW) pluss 45 protsenti HFD. Rosiglitasoon (RSG) olivõtta positiivse kontrollina. Kasutati kolme CTE annust (80, 160 ja 320 mg/kg).Taiwani toidu- ja ravimiameti (TFDA) soovitusel tervislik toithindamisjuhised. Ravi viidi läbi kuni katse lõpuni. Kõik katserotidohverdati 6 nädala pärast. Rottidelt kogutud veri tsentrifuugiti kiirusel 3000 p/min15 min kell 4◦C. Supernatanti uuriti järgmise analüüsi jaoks:Üldine glükoos, triglütseriid ja kolesterool

Määramine:

Glükoosi määramine oliviiakse läbi glükoosi ensümaatiliste komplektide abil. Siis, 20µLisati L vereplasma proovereaktiive ja hoiti 37 °C juures◦C 5 minutit. Üldine triglütseriidide ja üldkolesterooli kontsentratsioon olidmääratakse triglütseriidide ja kolesterooli ensümaatiliste komplektide abil. Siis, 10µL vereplasma olidlisati reagentidele ja katse viidi läbi vastavalt tootja juhistele.Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 510 nm.Plasma üldglükoosi/triglütseriidi/kolesterooli sisaldus (mg/dl)=(Anäidis− ATühi)/(Astandard− ATühi) × 200. Näidis: vereproovide neeldumine, ATühi: proovita komplektide neeldumisväärtus, standardne: standardreaktiivi neeldumisväärtus, 200: standardreaktiivid kontsentratsioonil200 mg/dl.Insuliini, leptiini ja homöostaatilise mudeli hindamine – insuliiniresistentsuse (HOMA-IR) määramine:Insuliini tase määrati insuliini ELISA komplektidega. Siin, 25µLisati L vereplasmareaktiive ja neeldumist mõõdeti 450 nm juures. Leptiini üldsisaldus määrati kasutadesleptiini ensüümi immunomeetrilise analüüsi komplekt. Siis 100µAnalüüsiti l plasmat ja neeldumistmõõdeti 450 nm juures, kasutades ELISA lugejat. Kogu katse viidi läbi vastavalttootja juhised. HOMA-IR väärtus määrati homöostaasi mudeli põhjalhindamisvõrrand=tühja kõhuga plasma insuliinikontsentratsioon (mU/mL)× tühja kõhuga plasma glükoosisisalduskontsentratsioonid (mmol/L)/22,5.Plasma lipiidide peroksüdatsioon: siin segati 0,5 ml vereplasmat 1 ml reagendiga (15 protsenti,w/v trikloroäädikhape {{0}},25 N vesinikkloriidhappes (HCl) ja 0,375 protsenti,w/v tiobarbituurhape sisse0,25 N HCl) ja asetati veevanni (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Šveits) temperatuuril 100◦C jaoks15 min. Pärast jahutamist lisati 1 ml n-butanooli, loksutati tugevalt ja tsentrifuugiti 1500 °C juures.× g 10 min. Supernatant koguti ja neeldumist mõõdeti lainepikkusel 532 nm [12]. Malondialdehüüdi (MDA) kontsentratsioon (nM/mL)=[(Proov532 nm juures− Atühi 532 nm juures)/ (Standard532 nm juures− Atühi 532 nm juures)] × 5. Plasma testosterooni ja luteiniseeriva hormooni (LH) taseme määramine: testosteroonTestosterooni taseme mõõtmiseks vereplasmas kasutati ELISA komplekti. RIA komplekt oli harjunudmäärake LH kontsentratsioon. Siis, 50µLisati L plasmat ja arvutused põhinesidhormooni LH-RP-3 (standard) kontsentratsiooni kohta. Edasised sammud viidi läbi vastavalttootja juhistele.Kasvaja nekroosifaktori (TNF) määramine – ja interleukiini-6 (IL-6) kontsentratsioon:Püütud antikeha lahjendati 250 korda kattepuhvris ja lisati 96-süvendiga plaadile (100µL/kaev),ja hoiti 4 juures◦C üleöö. Supernatant aspireeriti ja pesti viisteist korda pesemisegapuhver (1 kord PBS, 0,05 protsenti Tween 20). Pärast inkubeerimist (1 h) 200 uiµg analüüsilahjendit, rakud olidpestud 5 korda pesupuhvriga ja 100µL TNF- standardlahus või katseproovid olidlisati igasse süvendisse ja inkubeeriti 2 tundi. Pärast pesemist 100µLisati L IL-6 tuvastatud antikehija inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril. Supernatant aspireeriti ja pesti 5 korda. Siis480 µLisati L ensüümi avidiin-mädarõika peroksidaasi (HRP) ja inkubeeriti 30 minutit toas.temperatuuri. Supernatant aspireeriti ja pesti viis korda pesupuhvriga. Siis 100µL lisati substraadi lahust ja inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril. Hiljem, 50µL peatusIgasse süvendisse lisati lahus (1 M fosforhape) ja neeldumist mõõdeti lainepikkusel 450 nm.Sperma ja munandite parameetrite analüüsSpermaproovide kogumine: spermaproovide kogumine viidi läbi vastavaltmeetodit, millest on varem teatatud [13]. Sperma koguti supernatandist ja kasutati selleksedasine analüüs.Spermade arv, spermatosoidide liikuvus ja ebanormaalne sperma: Spermade arv oliarvutatakse hemotsütomeetri ja trüpaansinise lahuse abil. Siis 100µL sperma vedelikku olidsegatud trüpaansinise lahusega ning spermatosoidide arv, liikuvus ja ebanormaalsed spermatosoididarvutatakse hemotsütomeetri ja mikroskoobi abil [14]. Nitrosinine tetrasoolium NBT sperma ja munandite redutseerimine ja lipiidide peroksüdatsioon: lipiidperoksüdatsiooni ja NBT redutseerimist analüüsiti sama plasmaanalüüsi protseduuri kohaselt.

Superoksiidi dismutaasi (SOD) ja katalaasi aktiivsuse määramine: superoksiiddismutaas(SOD) aktiivsust analüüsiti RANSEL komplekti abil. Siin on 0,05 ml munandihomogenaatelisati 1,7 ml reaktsioonilahusele (0.05 mM ksantiini, 0,025 mM 2-(4-jodofenüül)-{{0}}(4-nitrofenool)-5-fenüültetrasooliumkloriid (INT)). Pärast segamist 0,25 ml ksantiinoksüdaasi (80 U/L)lisati ja lasti toatemperatuuril reageerida 30 sekundit toatemperatuuril. Neelduvus olimõõdetuna 505 nm juures. Munandite homogenaadi valgu kontsentratsioon määratiArvutati Bio-Rad DC valgu analüüsi komplekt ja selle spetsiifiline aktiivsus (U/mg valku). Katalaas(CAT) aktiivsus määrati eelnevalt teatatud meetodil [15]. H&E (hematoksüliini ja eosiini) värvimineMunandeid leotati 10% formaliinis 24 tundi ja säilitati temperatuuril 4 °C◦C. Viilutasid koedmikrosuuruses ja kinnitatud slaidi külge. Pärast fikseerimist (95 protsenti metanooli pluss 5 protsenti äädikhapet) slaidid olidkastetakse 3 minutiks hematoksüliini sisse, pestakse 5 minutiks jooksva veega ja leotatakse seejärel50 protsenti, 70 protsenti ja 90 protsenti alkoholi ühe minuti jooksul. Pärast seda värviti objektiklaase eosiiniga 10 s jaleotatud 100-protsendilises alkoholis ühe minuti jooksul, kuni see pleekib. Lõpuks leotati slaidi ühe jaoks ksüleenigaminut. Hiljem slaid kuivatati õhu käes ja suleti. Värvitud toru asetati ümberpööratud faasikontrastimikroskoop (inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokyo, Jaapan), et jälgidamorfoloogia.Hüpotalamuse analüüsHiire KISS1, G-valguga seotud retseptor (GPR) 54, tsütokiini signaalimise 3 supressor (SOCS-3)ja sirtuiin 1 (SIRT1)geenijärjestused tuvastati NCBI-st (National Center for BiotechnologyTeave) geenide andmebaas ja konkreetne praimer töötati välja, kasutades Primer 5.0 PREMIER Biosoft,Palo Alto, CA, USA). Katses kasutatud praimerid on loetletud tabelis1.

Ribonukleiinhappe (RNA) ekstraheerimine hüpotalamusest. RNA ekstraheerimineaju hüpotalamus viidi läbi RNeasy Lipid Tissue Mini Kit abil. SaadudmRNA-sid mõõdeti kvantitatiivselt pöördtranskriptsiooni (RT) ja polümeraasi ahelreaktsiooni abil(PCR). RT analüüsist saadud kompliment-DNA-d säilitati temperatuuril−20 ◦C hilisemaks kasutamiseks.Ekstraheeritud DNA-le viidi läbi polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüs, kasutades Taq polümeraasi.Siis 5-10µVõeti L PCR produkti ja analüüsiti elektroforeesiga 1,5% agarilkolloid. Pilt tehti UVP BioDoc-It pildisüsteemis. Pöördtranskribeeritud komplementaarVõeti desoksüribonukleiinhape (cDNA) ja viidi läbi PCR, kasutades IQ SYBR Green Supermixikomplekt. Hiljem analüüsiti seda iQTM 5 optilise süsteemi tarkvaraga. Valgud ekstraheeriti, kasutades avalgu ekstraheerimisreaktiiv (T-PER). Seejärel lisati 400-le 20 mg munandite homogenaatiµL T-PER ja tsentrifuugiti (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Saksamaa) 4 °C juures◦C (125,000× g) 20 minutiks. Järgmine meetod oli sarnane "identifitseerimisele ja kvantifitseerimisele".valgu analüüs" in vitro analüüsis.2.3. Statistiline analüüsKatsetulemused väljendati keskmisena± standardhälve (keskmine± SD) jaandmeid analüüsiti, kasutades tarkvara Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk,New York, NY, USA. Rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise analüüsigadispersioon (ANOVA). Erinevate rühmade mitut võrdlust analüüsiti Duncani testigaväärtusp < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Tulemused

3.1. In vitro analüüs

3.1.1. ECH, CTE ja RES antioksüdantide aktiivsuse võrdlus

Pikaajaline kõrge oksüdatiivne stress ja krooniline põletik on diabeedi peamised põhjusedtüsistused [16]. CTE-d sisaldavad erinevaid fenüületanoidglükosiide, näiteks ehhinakosiid(ECH) ja akteosiid, millel on potentsiaalne antioksüdantne toime [17]. DPPH radikaalide eemaldamineECH antioksüdantse aktiivsuse hindamiseks viidi läbi test. Trolox ja resveratrool(3,5,4'-trihüdroksüstilbeen, RES) võeti vastavalt standardseks ja positiivseks kontrolliks. Nagu näidatudjoonisel1, näitas ECH paremat radikaali eemaldamise aktiivsust ja aktiivsus oli oluliselt suuremkui positiivse kontrolli (RES) oma.

3.1.2. ECH rakkude elujõulisus LC-540 ja TM3 Leydigi rakkudesMTT test viidi läbi ECH erineva kontsentratsiooni rakkude elujõulisuse hindamiseks.LC-540 Leydigi rakkude ja TM3 Leydigi rakkude elujõulisus oli pärast raviECH (joonis2). Võrreldes teiste kontsentratsioonidega on 100-µM kontsentratsioon (lahjendused 100µM 2-protsendilises FBS) ECH-s näitas TM3 Leydigi rakkudes paremat rakkude elujõulisust. Tulemus näitas, etECH suurenenud kontsentratsioon ei põhjusta rakkudele olulist toksilisust.

3.1.3. ECH mõju AGE-indutseeritud superoksiidi tootmisele NBT testiga LC-540 ja TM3 korralLeydigi rakk

AGE-d põhjustavad organismis oksüdatiivseid kahjustusi glükoosi oksüdeerumise ja glükoosi moodustumise tõttuvabad radikaalid nagu O2-, hüdroksüülradikaalid ja karbonüülrühmad [18]. Pärast stimuleerimist50 µg/mL AGE-sid, LC-540 (joonis3a) ja TM3 (joonis3b) rakke töödeldi ECH ja RES-ga(5 µM ja 10µM iga). Tulemused näitasid, et superoksiidi aniooni tootmine suureneskontrollrühmas (stimuleeritud AGE-d), kuid pärast seda vähenes superoksiidi aniooni tootmineravi ECH ja RES-ga. Jooniselt3, saadi aru, et ECH ja RES vähendavad tasetsuperoksiidi tootmist ja kaitsta rakke oksüdatiivsete kahjustuste eest. LC-540 lahtrite puhul10 µM ECH näitas peaaegu sarnast aktiivsust tavalise rühmaga. Superoksiidi tootmine mõlemasrakud vähenesid nii ECH kui ka RES kontsentratsiooni suurenemisega.3.1.4. ECH mõju H-le2O2 Tootmine AGE-stimuleeritud LC-540 Leydigi rakkudesOksüdatiivsete liikide olemasolu tuvastamiseks viidi läbi DCFH-DA test. Pärast sisenemistrakud, FL fluorestseeruv värv DCFH-DA oksüdeeritakse rakusisese H poolt2O2 ja moodustab diklorofluorestseiini(DCF). Nagu on näidatud joonisel4, suurenes rakusisene H märkimisväärselt2O2 tootmine aastalAGE-stimuleeritud rühm (kontroll), kusjuures 10 lisamineµM ECH ja RES oluliselt vähenenudH2O2 tootmine rakkudes. 10. administratsioonµM ECH andis ainult umbes 47,1 protsenti H-st2O2 toodang, oluliselt madalam kui kontrollrühmas.

3.1.5. ECH mõju RAGE-le ja NF-leκB valgu ekspressioonitasemed AGE-stimuleeritud LC-s-540Leydigi rakud

RAGE esinemise kinnitamiseks LC-540 Leydigis viidi läbi Western blot analüüsrakud. ECH mõju RAGE-le (joonis5a) ja NF-κB (joonis5b) valgu ekspressioonitasemedAGE-dega stimuleeritud Leydigi rakkudes on näidatud joonisel5. Tulemused näitasid, et 50µg/mlAGE-de kontsentratsioon kutsus esile kõrgema RAGE ja NF-κB ekspressioon LC-540 Leydigi rakkudes ja10 µECH ja RES M kontsentratsioon on märkimisväärselt vähendanud RAGE ja NF- ekspressiooniκB. NF-i väljendusκB oli RES ja ECH osas oluliselt madalam kui RAGE antagonistidel. Niisiis, tulemusedkinnitas, et ECH vähendas põletiku taset, vähendades RAGE ja NF- tasetκB.

.1.6. ECH mõju testosterooni sünteesi rajale AGE-stimuleeritud LC-540 Leydigi rakkudes.

Spermatogeneesi ja meeste viljatuse protsess sõltub testosterooni olemasolust.Nagu on näidatud joonisel6, StAR-i avaldised (joonis6a), CYP11A1 (joonis6b), CYP17A1 (joonis6c), ja HSD17 3 (joonis6d) AGE-stimuleeritud LC-540 Leydig'is vähenes oluliselt valkude hulkrakud (kontrollrühm). StAR, CYP11A1, CYP17A1 ja HSD17 ekspressioonid 3 valku olidsuurenes märkimisväärselt, kui lisati RAGE antagonist, RES ja ECH. SuurenenudStAR ja CYP11A1 valkude ekspressiooni täheldati nii ECH- kui ka RES-ga töödeldud rühmas.CYP17A1 ekspressioonitase oli RES ja ECH rühmades peaaegu sarnane. VäljendidHSD17 3 valk ECH-ga töödeldud Leydigi rakkudes oli palju suurem kui RES ja RAGEantagonistiga töödeldud rakud. StAR, CYP11A1, CYP17A1 ja HSD17 suurenenud ekspressioon 3 valkunäitas normaalset testosterooni tootmist.

5rakud/mL ning töötlemine RES ja ECH-ga(10µM) manustati 24 tundi. -aktiini võeti sisekontrolliks. Tavaline rühm (Nor)töödeldi söötmega ja kontrollrühma (Con) töödeldi AGE-dega (50µg/mL).

Tulemusednäidati keskmistena±SD (n = 3). Olulised erinevused (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">analüüsitud Duncani mitme vahemiku testiga.