Ⅰ OSA: Cistanche Tubulosa ekstraktide mõju isaste reproduktiivfunktsioonile streptosototsiin-nikotiinamiidist põhjustatud diabeetiliste rottide puhul
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He ja Shu-Chun Cheng
Abstraktne:Suhkurtõbi on krooniline haigus, mida iseloomustab hüperglükeemia, mis on tingitud insuliini taseme langusest või kudede ebaefektiivsusest selle tõhusaks kasutamiseks. Viljatus on tuntud kui diabeedi peamine tagajärg ja see mõjutab meeste reproduktiivsüsteemi, põhjustades sperma kahjustusi ja sugunäärmete talitlushäireid.Cistanche tubulosaon parasiitaim, millel on võime parandada mälu, immuunsust ja seksuaalset võimekust, vähendada impotentsust ja minimeerida kõhukinnisust. See uuring keskendus ehhinakosiidi (ECH) põletikuvastase ja kaitsva toime uurimisele.Cistanche tubulosa ekstrakt(CTE) diabeetiliste rottide isaste reproduktiivsüsteemi kohta. CTE antioksüdantset, põletikuvastast ja kaitsvat toimet hinnati nii in vitro kui ka in vivo meetoditega. In vitro tulemused näitavad, et ECH inhibeeris reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmist ja parandas StAR, CYP11A1, CYP17A1 ja HSD17p3 valgu ekspressiooni. In vivo analüüs viidi läbi kolme ehhinakosiidi (ECH) annusega (80, 160 ja 320 mg/kg) CTE-s. Kokku manustati positiivse kontrollina 0,571 mg/kg rosiglitasooni (RSG). Diabeedi põhjustasid streptosototsiin (STZ) (65 mg/kg) ja nikotiinamiid (230 mg/kg) koos rasvarikka dieediga (45 protsenti). In vivo uuringud kinnitasid, et ECH parandas veresuhkru taset, insuliiniresistentsust, leptiini resistentsust ja lipiidide peroksüdatsiooni. See võib taastada kisspeptiin 1 (KiSS1), G-valguga seotud retseptori GPR 54, tsütokiini signaaliülekande 3 (SOCS-3) ja sirtuiin 1 (SIRT1) sõnumitooja ribonukleiinhappe (mRNA) ekspressiooni hüpotalamuses ning taastada sugu. hormoonide tase. Seega kinnitas see uuring CTE antioksüdantset, põletikuvastast ja steroidogeneesi toimet.
Märksõnad:diabeet; viljatus;Cistanche tubulosa ekstrakt (CTE); ehhinakosiid (ECH); põletikuvastane toime; antioksüdantne aktiivsus; steroidogeneesi mõju
Diabeedi ravi:Cistanche tubulosa ekstrakt(CTE)
1. Sissejuhatus
Suhkurtõbi (DM) on seisund, mille korral veresuhkru tase on suurenenud, kuna kõhunääre ei tooda piisavalt insuliini või organism ei suuda seda tõhusalt kasutada. WHO andmetel kasvas diabeetikute arv 108 miljonilt 1980. aastal 422 miljonini 2014. aastal [1]. On neli peamist kategooriat: eeldiabeet (diabeedile eelnev staadium), tüüp 1 (kus kõhunääre ei tooda insuliini), tüüp 2 (organism ei kasuta insuliini) ja rasedusdiabeet (mis esineb raseduse ajal). Oksüdatiivne stress tekib reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ja antioksüdantide tootmise vahelise tasakaalustamatuse tõttu [2], mis viib lõpuks diabeetilise seisundini. Diabeedi tüsistuste hulka kuuluvad neerupuudulikkus, närvikahjustus, pimedus, insult, südameatakk, loote surm ja viljatus. [1]. Uuringud näitavad, et diabeediga meespatsientidel olid spermatosoidide tuumad, desoksüribonukleiinhape (DNA) ja mitokondrid oluliselt kahjustatud [3]. Oksüdatiivne stress sperma transportimisel muudab meeste reproduktiivsüsteemi protsessi [4,5].
Spermatogeneesi protsessi juhib hüpotalamuse-hüpofüüsi-sugunäärmete (HPG) telg. Hüpotalamuse toodetav gonadotropiini vabastav hormoon (GnRH) stimuleerib luteiniseeriva hormooni (LH) ja folliikuleid stimuleeriva hormooni (FSH) tootmist. Leydigi rakud asuvad seemnetorukese kõrval ja toodavad LH kontrolli all testosterooni. FSH käivitab antigeeni siduva valgu (ABP) tootmise, mis aitab kaasa meessuguhormoonide väljutamisele. Seega tekivad viljatus ja muud probleemid peamiselt HPG teljel esinevate häirete tõttu. Streptosototsiini-nikotiinamiidi kombinatsiooni manustamine kutsub eksperimentaalsetel rottidel esile diabeedi. Streptozototsiin on keemiline ühend, mis on toksiline pankrease insuliini tootvatele p-rakkudele ja nikotiinamiid on vees lahustuv vitamiin, mis kaitseb p-rakke täielike kahjustuste eest [6].
Cistanche tubulosa on kõrbetaimeliik, mida tuntakse ka kui "Rou Cong-Rong" [7]. See on mitteklorofülliline parasiitaim, mis kasvab peamiselt Calotropis Procera puu juurtel ja on laialt levinud Gansu, Qinghai, Xinjiangi, Mongoolia, Iraani ja India kuival maal. Cistanche tubulosa üldnimetus on "kõrbehüatsint". See on Hiina traditsioonilises meditsiinis laialdaselt aktsepteeritud ja sellele on antud nimi "kõrbe ženšenn". Seda kasutatakse meditsiinis laialdaselt haigestunud leukorröa, rohke metrorraagia, krooniliste neeruhaiguste, kõhukinnisuse, impotentsuse ja viljatuse raviks. Keemilised koostisosadCistanche tubulosakoosnevad mittelenduvatest fenüületanoidglükosiididest (PHG), iridoididest, lignaanidest, lenduvatest õlidest, alditoolidest, oligosahhariididest ja polüsahhariididest [8]. Uuringud näitavad, et selle ürdi ehhinakosiid kaitseb kahjustatud fibroblaste, reguleerides ROS-i taset [9]. See ühend tekitab antioksüdante, vasorelaksatsiooni ja põletikuvastast toimet koos neuroprotektsiooni ja osteoporoosi ennetamisega [10,11].
Selle uuringu eesmärk oli uuridaCistanche tubulosa ekstrakti toimemis sisaldab ECH-d streptozototsiin-nikotiinamiidi poolt indutseeritud diabeetilise roti reproduktiivfunktsiooni häirete kohta.
Cistanche tubulosa
2. Materjalid ja meetodid
2.1.Materjalid
ECH ja CTE osteti ettevõttelt Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Täiustatud glükatsiooni lõpp-produktid (AGE) osteti ettevõttest Biovision (San Francisco, CA, USA). LC-540 ja TM3 rakuliinid osteti toiduainetööstuse uurimis- ja arendusinstituudist (Hsinchu, Taiwan). Viie nädala vanused Sprague-Dawley (SD) isasrotid osteti riiklikust laboriloomade keskusest (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® osteti ettevõttelt PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüül (DPPH) saadi firmalt Sigma (St. Louis, MO, USA). Sigmalt osteti ka metanooli ja 4-(2-hüdroksüetüül)-1-piperasiinetaansulfoonhapet (HEPES). Dulbecco modifitseeritud Eagle sööde/F12 ja trüpsiin-EDTA saadi firmalt GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetüültiasool-2-üül)-2, 5-difenüültetrasooliumbromiid (MTT), diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaat (DCFH-DA), dimetüülsulfoksiid (DMSO) ja nitroblue tetrasoolium (NBT) osteti firmalt Sigma. Glükoosi ensümaatilised komplektid saadi Kyokutoseiyakust, Tokyost, Jaapanist. Insuliini ELISA komplektid osteti firmalt Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Rootsi). T-PER Tissue Protein Extraction Reagent hangiti firmast Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Inimese/hiire/roti vastased tuumafaktor-kappa B NF-kB polüklonaalsed antikehad osteti ettevõttest Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA. Hiire/roti vastane retseptor täiustatud glükatsiooni lõppproduktide (RAGE) polüklonaalsete antikehade jaoks, inimese/hiire/roti vastased polüklonaalsed STAR-i antikehad ja inimese/hiire/roti vastased tsütokroom P450 17A1 monoklonaalsed antikehad osteti ettevõttelt Gene Tex (Irvine, CA, USA). Inimese/hiire/roti vastased CYP11A1 polüklonaalsed antikehad saadi ettevõttest Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA). Easy-Blue reaktiiv osteti ettevõttest Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agaroos ja DNA marker 100 aluspaari saadi ettevõttelt Promega, Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit osteti firmalt QIAGEN, Hilden, Saksamaa.
2.2.Meetodid
2.2.1. In vitro analüüs
LC{{0}} ja TM3 rakukultuur: LC-540 rakuliine kultiveeriti 37 OC juures Earle'i tasakaalustatud soolalahuse (EBSS) söötmes, millele oli lisatud naatriumvesinikkarbonaati (1,5 g/L), L. -glutamiin (2 mM), asendamatud aminohapped (0,1 mM), naatriumpüruvaat (10 mM) ja veise loote seerum (FBS) (10 protsenti) 5-s protsenti CO2 inkubaator (CO2 inkubaator, Napco 5410, Taiwan). TM3 rakuliini kasvatati Dulbecco/s modifitseeritud Eagle söötmes (DMEM), millele oli lisatud glükoosi (4,5 g/l), naatriumpüruvaadi (0,5 mM), L-glutamiini (2,5 mM), naatriumvesinikkarbonaadi (1,2 g/l), 4-(2-hüdroksüetüül)-1-piperasiinetaansulfoonhape (HEPES, 15 mM) ja vasika loote seerum (FCS, 10 protsenti) või hobuse seerum (5 protsenti) temperatuuril 37 OC 5-s protsenti CO2 inkubaator.
Ehhinakosiidi (ECH) rakkude elujõulisuse määramine: 3-(4, 5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5- difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) reaktiiv oli kasutatakse rakkude elujõulisuse analüüsiks. Rakkude kontsentratsioon reguleeriti 96-süvendiga plaadil väärtusele 2 x 105 rakku/ml. Seejärel lisati 20 µL ECH-d (lahjendatud 2% söötmega) ja inkubeeriti 24 tundi temperatuuril 37 OC 5% CO2 inkubaatoris. Hiljem lisati 100 µl MTT reaktiivi ja inkubeeriti 4hat37 OC pimedas. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 570 nm (ELISA lugeja, Dynatech MR5000, Kloten, Šveits).
Restive CeH viabiHiy ( protsenti )=[(Proov 570 nm juures – tühikatse 570 nm juures)]/[(Akontroll 570 juures – tühikatse 570 juures)] x 100.
Nitroblue Tetrazoliumi (NBT) reduktsioonianalüüs ja 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüüli (DPPH) test: rakkude arv reguleeriti väärtusele 1x 1{{10}}6 rakku/ml . Seejärel lisati 50 mg/ml ECH-d, resveratrooli (RES) ja täiustatud glükatsiooni lõpp-produkte (AGE) (kontroll) ja kultiveeriti koos 18 tundi 37 °C juures. Seejärel lisati 0,3 ml NBT lahust (0,1 mg/ml NBT, 5% FBS ja 3% dimetüülsulfoksiidi (DMSO), lahustatuna 10 ml DMEM-is) ja inkubeeriti 37 °C juures 5% CO2 atmosfääris 1 tund. Pärast tsentrifuugimist (800 xg 3 minutit) supernatant eemaldati ja lisati 200 µl DMSO-d ja loksutati 5 minutit ultraheliostsillaatoris (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 630 nm. DPPH radikaali testis võeti standardina Trolox (95% alkoholis). Seejärel segati 75 µl 0,5 mM DPPH lahust 25 µL proovidega ja lasti reageerida toatemperatuuril pimedas kohas 30 minutit. Segu loksutati ja neeldumine mõõdeti lainepikkusel 517 nm.
Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) sisalduse analüüs: 2% FBS-i sisaldaval 12-süvendiga plaadil reguleeriti rakkude arv väärtusele 2 x 105 rakku/ml. Seejärel lisati plaadile 50 µL/ml ECH-d, RES-i ja AGE-sid ning inkubeeriti 37 OC juures 24 tundi. 24 tunni pärast lisati 2Z,7Z-diklorofluorestseiindiatsetaati (DCFH-DA) ja inkubeeriti 37 °C juures 30 minutit. Pärast tsentrifuugimist (400x g, 5 min) supernatant eemaldati ja rakke pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Pärast rakkude suspendeerimist 1 ml PBS-s ja ROS-i tasemed määrati voolutsütomeetriga (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).
Valkude identifitseerimine ja kvantitatiivne analüüs: Valgud ekstraheeriti valgu ekstraheerimisreagendi (T-PER) abil. Rakkude tihedus reguleeriti 12-süvendiga plaadil väärtusele 2 x 105 rakku/ml ja 50 µL/ml ECH-d, RES-i ja arenenud glükatsiooni lõppprodukti (RAGE) antagonisti retseptorit ning lisati AGE-d ja inkubeeriti 37 OC juures 5% CO2 inkubaatoris 24 tundi. Pärast seda lisati 400 µL T-PER-i, kaabiti rakud ära ja tsentrifuugiti 125 xg juures 20 minutit (4 OC). Supernatant koguti ja säilitati edasiseks analüüsiks temperatuuril -80 OC (-80 OC sügavkülmik, Nuaire, Plymouth, MN, USA). Valkude kvantifitseerimiseks kasutati bitsinhoniinhappe (BCA) komplekti. Seejärel lisati 8-süvendiplaatidele 10 µL standardset rakulahust ja 200 RL BCA reaktiivi ning inkubeeriti 37 °C juures 5% CO2 inkubaatoris 30 minutit. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 562 nm. Valkude identifitseerimise analüüs viidi läbi naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS)-polüakrüülamiidgeeli (SDS-PAGE) elektroforeesiga. Proovid valmistati valgu lüsaadi lisamisega valgu laadimispuhvrisse ja spetsiifiliste valkude tuvastamiseks viidi läbi Western blot analüüs.
2.2.2.In vivo analüüs
Loomamudeli disain: kuuskümmend {{0}}nädalast isast Sprague-Dawley (SD) rotti osteti riiklikust laboriloomade keskusest (Taipei, Taiwan). Iga rott hoiti eraldi desinfitseerivates roostevabast terasest puurides kontrollitud temperatuuri (23 °C 1 kraadi) ja niiskuse (40-60 protsenti) all 12-tunnise valguse/12-tunnise pimeduse tsükliga. Toitu ja vett anti ad libitum. Iga rott kodustati esimesel nädalal ja talle anti põhitoiduna laboratoorse näriliste dieet 5001. Kõik protseduurid järgisid Taiwani riikliku ookeaniülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee (IACUC heakskiidu nr 101026) standardit. Pärast kodustamist jagati rotid kahte rühma: kontrollrühm (Con), keda toideti labori dieediga 5001, ja diabeetikute rühm, keda toideti kogu katse vältel rasvarikka dieediga (HFD, 40 protsenti). Pärast 4-nädalast HFD-ga toitmist süstiti diabeedirühma rottidele streptozototsiini (65 mg/kg) (STZ), et kutsuda esile suhkurtõbi (DM). 15 minuti jooksul pärast STZ süstimist süstiti nikotiinamiid (230 mg / kg kehamassi kohta). Nädal pärast süstimist viidi läbi suukaudne glükoositaluvuse test (OGTT), et teha kindlaks diabeetilise mellitus (DM) edukas esilekutsumine. Pärast seda jagati loomad kuue rühma: kontrollrühmad (toidetud laboratoorse dieediga 5001); DM rühm (DM pluss 45 protsenti HFD); DMR rühm (DM pluss rosiglitasoon: 0,571 mg/kg BW) pluss 45 protsenti HFD; DME1 rühm (DM pluss CTE: 80 mg/kg kehamassi kohta) pluss 45 protsenti HFD; DME2 rühm (DM pluss CTE: 160 mg/kg BW) pluss 45 protsenti HFD; ja DME4 rühm (DM pluss CTE: 320 mg/kg BW) pluss 45 protsenti HFD. Rosiglitasoon (RSG) võeti positiivseks kontrolliks. Taiwani toidu- ja ravimiameti (TFDA) tervisliku toidu funktsionaalse hindamise juhiste kohaselt kasutati kolme CTE annust (80, 160 ja 320 mg/kg). Ravi viidi läbi kuni katse lõpuni. Kõik katserotid surmati 6 nädala pärast. Rottidelt kogutud veri tsentrifuugiti kiirusel 3000 p/min 15 minutit 4 kraadi juures.
Cistanche tubulosa tõhusad koostisosad
Supernatanti uuriti järgmise analüüsi jaoks
Üldglükoosi, triglütseriidi ja kolesterooli määramine: glükoosi määramine viidi läbi glükoosi ensümaatiliste komplektidega. Seejärel lisati reagentidele 20 ui vereplasma proovi ja hoiti 37 kraadi juures 5 minutit. Triglütseriidide üldsisaldus ja üldkolesterooli kontsentratsioon määrati triglütseriidide ja kolesterooli ensümaatiliste komplektide abil. Seejärel lisati reagentidele 10 ^L vereplasmat ja katse viidi läbi vastavalt tootja juhistele. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 510 nm.
Plasma üldglükoosi/triglütseriidide/kolesterooli sisaldus (mg/dL)=(-ABtühi)/(Astandard - ABtühi) x 200.
A Proov: vereproovide neeldumine, ABTühik: Ilma proovita komplektide neeldumisväärtus, A standard: standardreaktiivi neeldumisväärtus, 200: standardreaktiivid kontsentratsiooniga 200 mg/dl.
Insuliini, leptiini ja homöostaatilise mudeli hindamine-insuliiniresistentsuse (HOMA-IR) määramine: insuliini tase määrati insuliini ELISA komplektidega. Siin lisati reagentidele 25 ui vereplasmat ja neeldumist mõõdeti 450 nm juures. Leptiini kogusisaldus määrati leptiini ensüümi immunomeetrilise analüüsi komplekti abil. Seejärel analüüsiti 100 ui plasmat ja neeldumist mõõdeti 450 nm juures, kasutades ELISA lugejat. Kogu katse viidi läbi vastavalt tootja juhistele. HOMA-IR väärtus määrati homöostaasi mudeli hindamise võrrandist=tühja kõhuga insuliini kontsentratsioon (mU/mL) x tühja kõhu plasma glükoosikontsentratsioon (mmol/L)/22,5.
Plasma lipiidide peroksüdatsioon: siin segati {{0}},5 ml vereplasmat 1 ml reagendiga (15%, w/v trikloroäädikhape 0,25 N vesinikkloriidhapetes (HCl) ) ja 0,375 protsenti, w/v tiobarbituurhape 0,25 N HCl-s) ja asetati 15 minutiks veevanni (Water Bath, BUCHI461, Zürich, Šveits) temperatuuril 100 °C. Pärast jahutamist lisati 1 ml n-butanooli, loksutati tugevalt ja tsentrifuugiti 1500 xg juures 10 minutit. Supernatant koguti ja neeldumist mõõdeti lainepikkusel 532 nm [12].
Malondialdehüüdi (MDA) kontsentratsioon (nM/mL)=[(ASProov 532 nm juures - Tühikatse 532 nm juures)/ (Astandard 532 nm juures - Tühikatse 532 nm juures)] x 5.
Plasma testosterooni ja luteiniseeriva hormooni (LH) taseme määramine: Testosterooni ELISA komplekti kasutati testosterooni taseme mõõtmiseks vereplasmas. LH kontsentratsiooni määramiseks kasutati RIA komplekti. Seejärel lisati 50 卩L plasmat ja arvutused põhinesid hormooni LH-RP-3 (standard) kontsentratsioonil. Edasised sammud viidi läbi vastavalt tootja juhistele.
Kasvaja nekroosifaktori (TNF)-a ja interleukiini-6 (IL-6) kontsentratsiooni määramine: püütud antikeha lahjendati kattepuhvris 250 korda ja lisati {{4} }augu plaat (100 卩L süvendi kohta) ja hoiti öö läbi temperatuuril 4 °C. Supernatant aspireeriti ja pesti viis korda pesupuhvriga (1 kord PBS, 0,05 protsenti Tween 20). Pärast inkubeerimist (1 h) 200 μg analüüsi lahjendiga pesti rakke 5 korda pesupuhvriga ja igasse süvendisse lisati 100 μl TNF-a standardlahust või testproove ja inkubeeriti 2 tundi. Pärast pesemist lisati 100 RL IL-6 tuvastatud antikehi ja inkubeeriti 1 kuu jooksul toatemperatuuril. Supernatant aspireeriti ja pesti 5 korda. Seejärel lisati 480 RL ensüümi avidiin-mädarõika peroksüdaasi (HRP) ja inkubeeriti 30 minutit toatemperatuuril. Supernatant aspireeriti ja pesti viis korda pesupuhvriga. Seejärel lisati 100 RL substraadi lahust ja inkubeeriti 15 minutit toatemperatuuril. Hiljem lisati igasse süvendisse 50 RL stopplahust (1 M fosforhapet) ja neeldumist mõõdeti 450 nm juures.
Cistanche ehhinakosiidi eelised: oksüdatsioonivastane toime
Sperma ja munandite parameetrite analüüs
Sperma proovide kogumine: spermaproovide kogumine viidi läbi vastavalt meetodile, mida on eelnevalt kirjeldatud artiklis [13]. Sperma koguti supernatandist ja kasutati edasiseks analüüsiks.
Spermade arv, spermatosoidide liikuvus ja ebanormaalne sperma: spermatosoidide arv arvutati hemotsütomeetri ja trüpaansinise lahuse abil. Seejärel segati 100 RL sperma vedelikku trüpaansinise lahusega ning spermatosoidide arv, liikuvus ja ebanormaalsed spermatosoidid arvutati hemotsütomeetri ja mikroskoobi abil [14].
Nitrosinine tetrasoolium NBT redutseerimine ja sperma ja munandite lipiidide peroksüdatsioon: lipiidide peroksüdatsiooni ja NBT redutseerimist analüüsiti sama plasmaanalüüsi protseduuri kohaselt.
Superoksiiddismutaasi (SOD) ja katalaasi aktiivsuse määramine: Superoksiidi dismutaasi (SOD) aktiivsust analüüsiti RANSEL komplekti abil. Siin lisati {{0}}.05 ml munandihomogenaate lisati 1,7 ml reaktsioonilahusele (0,05 mM ksantiini, 0,025 mM 2-({ {9}}jodofenüül)- 3-(4-nitrofenool)-5-fenüültetrasooliumkloriid (INT)). Pärast segamist lisati 0,25 ml ksantiinoksüdaasi (80 U/L) ja lasti reageerida toatemperatuuril 30 sekundit toatemperatuuril. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 505 nm. Munandi homogenaadi valgukontsentratsioon määrati Bio-Rad DC valguanalüüsi komplektiga ja arvutati selle spetsiifiline aktiivsus (U/mg valku). Katalaasi (CAT) aktiivsus määrati eelnevalt teatatud meetodil [15].
H&E (hematoksüliini ja eosiini) värvimine
Munandeid leotati 24 tundi 10% formaliinis ja säilitati temperatuuril 4 °C. Koed viilutati mikrosuurusteks ja kinnitati objektiklaasile. Pärast fikseerimist (95 protsenti metanooli pluss 5 protsenti äädikhapet) sukeldati objektiklaasid 3 minutiks hematoksüliini, pesti 5 minutiks jooksva veega ja seejärel leotati neid üheks minutiks 50 protsenti, 70 protsenti ja 90 protsenti alkoholiga. Pärast seda värviti objektiklaase eosiiniga 10 sekundit ja leotati 100-protsendilises alkoholis üks minut, kuni see tuhmus. Lõpuks leotati slaidi üks minut ksüleenis. Hiljem slaid kuivatati õhu käes ja suleti. Värvitud tuub asetati morfoloogia jälgimiseks pööratud faasikontrastmikroskoobi (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokyo, Jaapan).
Hüpotalamuse analüüs
Hiire KISS1, G-valguga seotud retseptor (GPR) 54, tsütokiini signaaliülekande supressor 3 (SOCS-3) ja sirtuiin 1 (SIRT1) geenijärjestused tuvastati NCBI (National Center for Biotechnology Information) geenide andmebaasist. ja konkreetne praimer töötati välja, kasutades Primer 5.{8}} PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Katses kasutatud praimerid on loetletud tabelis 1.
Ribonukleiinhappe (RNA) ekstraheerimine hüpotalamusest. RNA ekstraheerimine aju hüpotalamusest viidi läbi RNeasy Lipid Tissue Mini Kit abil. Saadud mRNA-sid mõõdeti kvantitatiivselt pöördtranskriptsiooni (RT) ja polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil. RT analüüsist saadud komplimendi DNA-d säilitati hilisemaks kasutamiseks -20 kraadi juures. Ekstraheeritud DNA-le viidi läbi polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüs, kasutades Taq polümeraasi. Seejärel võeti 5-10 µl PCR produkti ja analüüsiti elektroforeesiga 1,5% agarkolloidil. Pilt tehti UVP BioDoc-It pildisüsteemis. Võeti pöördtranskribeeritud komplementaarne desoksüribonukleiinhape (cDNA) ja viidi läbi PCR, kasutades komplekti IQ SYBR Green Supermix. Hiljem analüüsiti seda iQTM 5 optilise süsteemi tarkvaraga. Valgud ekstraheeriti valgu ekstraheerimisreagendi (T-PER) abil. Seejärel lisati 400 µl T-PER-ile 20 mg munandihomogenaati ja tsentrifuugiti (High Speed Centrifuge, Hettich CR{12}}, Tuttlingen, Saksamaa) 4 kraadi juures (125, 000 xg) 20 min. Järgmine meetod oli sarnane "valgu tuvastamise ja kvantifitseerimise analüüsiga" in vitro analüüsiga.
2.3.Statistiline analüüs
Katsetulemused väljendati keskmise 土 standardhälbena (keskmine 土 SD) ja andmeid analüüsiti Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 tarkvara abil, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil. Erinevate rühmade mitut võrdlust analüüsiti Duncani testiga olulise tasemena p <>
