Ehhinakosiid aeglustab inimese fibroblastiliste rakkude vananemist MRC{0}}

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Cistanche toimeaine: kuidas ehhinakosiid vananemisvastane on?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

Selles uuringus uuriti ehhinakosiidi, ühe Hiina traditsioonilise taimse ravimi Cistanches salsa vartest eraldatud fenüületanoide, mõju inimese embrüo kopsu fibroblastilistele MRC{0}} rakkudele. Rakkude proliferatsiooni aktiivsust hinnati Alamar Blue abil, mis näitas, et ehhinakosiidiga töötlemine võib aeglustada vananemist. Voolutsütomeetria tulemused näitavad, et ehhinakosiid võib käivitada G1-faasis rakud sisenema S-faasi ja G2-faasi ning parandada ROS-i lagunemist. Komeetanalüüsi tulemused näitavad, et ehhinakosiid võib kaitsta rakke DNA kahjustuste eest, selgitades osaliselt selle toimemehhanismi. Kõik ülaltoodud tulemused viitavad sellele, et ehhinakosiidil on potentsiaalne vananemisvastane toime.

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

In vitro kultiveeritud normaalsed rakud vohavad piiratud arvu populatsiooni kahekordistumiseni (Hayflflicki piirmäär) ja sisenevad replikatiivse vananemise etappi. Vananevad rakud läbivad G1 faasis rakkude kasvu peatumise ning muutused morfoloogias ja ainevahetuses, sealhulgas rakkude suurenemine, lüsosoomide biogenees ja kõrgema galaktosidaasi aktiivsuse ekspressioon pH 6 juures (vananemisega seotud galaktosidaas, SA- - -Gal ) (Hayflflick ja Moorhead 1961; Dimri 1995). Vananevate rakkude kogunemine ennustab vanusega seotud langustpabertaskurätik/orelfunktsioonid. Vananemise edasilükkamise või tagasipööramise viiside leidmiseks pole kunagi lakanud jõupingutused aktiivsete vananemisvastaste ainete leidmiseks.ehhinakosiidon üks fenüületanoide, mis on eraldatud vartestCistanches salsa, Hiina traditsiooniline taimne ravim, millel on potentsiaalne bioloogiline toime nii antiseerumina kui kaväsimusevastaneaine (Deng et al. 2004; Xiong jt 1996). Samuti on teatatud, et see käitub in vitro tugevatoimelisenatasutaradikaalnekoristaja(Facino et al. 1995) ja eksponaadidneuroprotektiivnetegevusedin vitro ja in vivo (Koo jt 2005; Geng jt 2007). Ehhinakosiid võib olla vananemisvastase aine kandidaat ja vananemisvastane toime võib olla üks selle bioloogilistest omadustest. Seega ravisime inimese embrüo kopsu fibroblasti rakuliini MRC-5 ehhinakosiidiga, eeldades, et see võib vananemist aeglustada või tagasi pöörata.

2. Uuringud ja tulemused

Esiteks lisasime söötmesse ehhinakosiidi, et kontrollida selle mõju rakkude kasvule ja rakutsüklitele. Täheldati, et 48-tunnise ehhinakosiidiga kokkupuute korral suurenes rakkude elujõulisus kontrolliga võrreldes ilmselgelt, kuna kontsentratsioon suurenes (joonis 1A), mis näitab, et ehhinakosiid aitas vananevatel rakkudel vohada. SA-Gal värvimise tulemus näitas, et SA-Gal tase langes ilmselgelt pärast ehhinakosiidiga töötlemist (andmeid pole näidatud), mis viitab sellele, et osa vananevatest rakkudest oli vananemisest vastupidine. Kinnitamaks, kas ehhinakosiidiga ajendas tõepoolest vananevaid rakke vohama, viidi sisse kaastsütomeetria, et kontrollida vananevate MRC{5}} rakkude rakutsükli faasi muutusi pärast ehhinakosiidiga töötlemist. Meie uuringus täheldasime, et ehhinakosiidi kontsentratsiooni suurenemisega vähenes järk-järgult rakkude suhe G1 perioodil. Vastupidi, rohkem rakke ajendati sisenema S-faasi ja G2-faasi (joonis 1B). Vananemisega seotud heterokromatiini fookuste (SAHF) akumuleerumine on vananevate rakkude teine ​​spetsiifiline biomarker (Shay ja Wright 2001). Vananevatel rakkudel olid punktidega DNA kolded, mis visualiseeriti Hoechsti värvimisega (joonis 1C). Seevastu ehhinakosiidiga töödeldud MRC{12}} rakkudel näis olevat vähem SAHF-i.

Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tase tõuseb, kui rakud lähenevad Hayflflicki piirile (Hutter et al. 2002). ROS-i subletaalse tasemega rakkude pidev töötlemine mitte ainult ei suurenda oksüdatiivsete kahjustuste, nagu lipofustsiini, taset (Sitte et al. 2001), vaid põhjustab ka püsivat kasvu peatumist, millega kaasneb p53-kasvu pärssiva aine aktiveerimine. rada (Toussaint et al. 2000). Seetõttu mängib ROS rakutasandil võtmerolli vananemise esilekutsumisel. ROS-i sisalduse mõõtmiseks kaastsütomeetriaga kasutati FL-fluorestsentsvärvi DCFH-DA. Näidati, et võrreldes kontrolliga oli ehhinakosiidiga inkubeeritud rakkudes ROS-i sisaldus ilmselgelt vähenenud (joonis 2A). Need tulemused näitavad, etehhinakosiidvõib toimida antioksüdandina, vähendades ROS-i tootmist või kiirendades ROS-i eemaldamist.

Kogunenud reaktiivsed hapniku liigid (ROS) põhjustavad rakkudes makromolekulide, sealhulgas valkude, DNA ja telomeeride märkimisväärset kahjustust (Kovtun et al. 2007). Oksüdatiivsed DNA kahjustused põhjustavad p53-sõltuva G1 kasvu peatamise pärast p21Waf-1/SDI-1/Cip1 ekspressiooni (Chen et al. 1998) ja rakkude vananemist normaalsetes inimeste fibroblastides. DNA kahjustuse ja selle parandamise mõõtmiseks kasutasime komeedi testi. DNA fragmentide suurus ja pauside arv määravad nähtud komeedi rände ja mustri. Saba DNA sisaldus (saba pikkuse ja saba DNA sisalduse korrutis) suureneb kahjustuse korral. Meie tulemused näitavad, et eeltöötlus ehhinakosiidiga võib osaliselt soodustada DNA kahjustuste paranemist, vähemalt kaitsta rakke H2O2 põhjustatud DNA kahjustuste eest (joonis 2B). Nende faktide põhjal järeldame, et ehhinakosiidil on vananemisvastane toime vähemalt MRC{12}} rakkudes. Meie uuringu tulemused näitavad, et ehhinakosiid võib vähendada ROS-i akumulatsiooni, kaitsta rakke DNA kahjustuste eest, edendada MRC-5 rakke G1-faasist S- ja G2-faasidesse ning seega parandada rakkude proliferatsiooni. Üldiselt võib ehhinakosiidi mõju MRC{16}} rakkudele jagada kahte aspekti: rakkude proliferatsiooni soodustamine ja ROS-i akumulatsiooni vähendamine. Kuigi rakkude vananemise täpne mehhanism on endiselt teadmata ja rakutsükli reguleerimise võrgustik on endiselt vastuoluline, oleme näidanud, et ehhinakosiid võib kaitsta rakke oksüdatiivsete kahjustuste eest. Seetõttu spekuleerime selle üleehhinakosiidvõib olla hea kandidaat vananemise reguleerimiseks, kuigi täpne alusmehhanism jääb lahtiseks ja edasised uuringud on käimas.

3. Eksperimentaalne

3.1. Rakukultuur ja ravi

Inimese embrüo kopsu fibroblastilist rakuliini MRC{{0}} (Biokeemia ja rakubioloogia instituut, SIBS, CAS) hoiti modifitseeritud minimaalses olulises söötmes (Gibco/BRL) ja sellele lisati 10 protsenti veise loote seerumit. MRC-5 rakud läbivad pärast mitut rakkude passaaži replikatiivse vananemise, mida hinnatakse ainevahetuse aeglustumise ja jagunemise lakkamise järgi 7 päeva jooksul. Kõik kultuurid külvati rakutihedusega 104/cm2, kui ei ole teisiti märgitud, ja lasti 7 päeva segamatult vohada. 48 tundi enne kontrollimist lahustiga lisati erinevad kontsentratsioonid ehhinakosiidi, kui pole öeldud teisiti. DMSO kontsentratsioon kultuurides oli alla 0,3 mahuprotsendi. H2O2-ga töötlemiseks indutseeriti rakke 250 M H2O2-ga 12 tundi.

3.2. Elulemusmäära test

Rakke kultiveeriti ja töödeldi ehhinakosiidiga 96 süvendiga plaatidel. Enne tuvastamist lisati söötmele 10 protsenti Alamar BlueTM ja inkubeeriti 4 tundi. Neeldumist mõõdeti spektrofotomeetriga.

3.3. Voolutsütomeetria analüüs

DNA sisalduse ja intratsellulaarse ROS taseme mõõtmiseks kasutati voolutsütomeetriat, kasutades vastavalt propiidiumjodiidi ja DCFH-DA. Rakud plaaditi tihedusega 105 rakku 10 ml rakulahuse kohta 100 mm läbimõõduga tassidesse ja lisati ehhinakosiidi 48 tunniks pärast rakkude külvamist. Pärast 48-tunnist töötlemist rakud koguti ja pesti pärast tsentrifuugimist PBS-is, seejärel resuspendeeriti 30 minuti jooksul PBS-i lahuses, milles oli 0,1 protsenti RNaasi ja 50 g/ml propiidiumjodiidi või 10 M DCFH-DA-d sisaldavat söötme. Seejärel määrati DNA või ROS-i sisaldus Beckman Coulter Flow Cytometry Systemis FL fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimisega. Andmeid analüüsiti tarkvara MultiCycle abil.

3.4. Hoechsti värvimine

Rakke kultiveeriti ja töödeldi ehhinakosiidiga 48 tundi 96 süvendiga plaadil. Sööde eemaldati, rakke pesti PBS-ga, seejärel fikseeriti 4% formaldehüüdiga PBS-is 20 minutit, millele järgnes üks kord pesemine PBS-iga ja värviti 10 minutit Hoechsti värviga. Pildid jäädvustatud.

3.5. Üherakuline geelelektroforees (komeedi test)

Komeedi test viidi läbi vastavalt aruannetele (Olive ja Banath 2006). Üksikuid komeedipilte analüüsiti CometScore tarkvaraga. Tänuavaldus: Seda tööd toetasid rahaliselt Hiina riiklik alusuuringute programm (973 projekt) (nr 2007CB507406), Hiina riiklik loodusteaduste fond (nr 30572341) ja Tsinghua-Yue-Yueni meditsiiniteaduste fond (THYY20070008). ).