Diosmiini kahekordne moduleeriv toime kaltsiumoksalaadist neerukivide moodustumise protsessidele: kristalliseerumine, kasv, agregatsioon, kristallrakkude adhesioon, sisestamine neerutorurakkudesse ja invasioon rakuvälise maatriksi kaudu

lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

Supaporn Khamchun^a,b,c,1, Sunisa Yoodee^a,1, Külastage Thongbonkerdit^a,*

^aMeditsiinilise proteoomika üksus, teadus- ja arendusbüroo, arstiteaduskonna Siriraji haigla, Mahidoli ülikool, Bangkok 10700, Tai

^bMeditsiinitehnoloogia osakond, liitlaste terviseteaduste kool, Phayao ülikool, Phayao 56000, Tai

^cIntegratiivse molekulaarse biomeditsiini tippüksus, liitlaste terviseteaduste kool, Phayao ülikool, Phayao 56000, Tai

Märksõnad: Bioaktiivne ühend, Flavonoid, Inhibiitor, Modulaator, Nefrolitiaas, Promootor, Urolitiaas

ABSTRAKTNE

Diosminon looduslik flavoonglükosiid (bioflavonoid), mida leidub puuviljades ja taimedes ning millel on mitu farmakoloogilist toimet. Seda on laialdaselt kasutatud toidulisandina või raviainena erinevate haiguste/häirete korral. Kuigi soovitatav, tõendid selle kaitsemehhanismide kohtaneerudkivihaigus (nefrolitiaas/urolitiaas), eriti kaltsiumoksalaadi (CaOx) monohüdraat (COM), mis on kõige levinum tüüp, jäi ebaselgeks. Selles uuringus hindasime seega süstemaatiliselt selle mõjudiosmiin(2,5–160 nM) erinevatel etappidelneerudkivide moodustumise protsessid, sealhulgas COM-i kristalliseerumine, kristallide kasv, agregatsioon, kristallrakkude adhesioon, sisestamine neerutuubulite rakkudesse ja invasioon rakuvälise maatriksi (ECM) kaudu. Tulemused näitasid sedadiosmiinoli annusest sõltuv moduleeriv toime kõigile nimetatud COM-i neerukiviprotsessidele.Diosminsuurendas kristallimise ajal oluliselt COM-i kristallide arvu ja massi, kuid vähendas kristallide suurust ja kasvu. Kuigidiosmiinsoodustas kristallide agregatsiooni, pärssis kristallrakkude adhesiooni ja internaliseerumist neerutuubulite rakkudesse. Lõpuks soodustas diosmiin kristallide sissetungi ECM-i kaudu. Meie andmed annavad tõendeid, mis näitavad nii diosmiini pärssivat kui ka soodustavat mõju COM-ileneerudkivide moodustumise protsessid. Nende diosmiini kahekordse moduleeriva toime põhjal on selle urolitiaasivastane roll kaheldav ja selle kasutamisel tuleb olla ettevaatlik.neerudkivihaigus.

1. Sissejuhatus

Diosmin(3',5,7-trihüdroksü-4'-metoksüflavoon-7-ramnoglükosiid) on looduslik bioflavonoid, mida leidub tavaliselt erinevates taimedes ja puuviljades, peamiselt Citrus spp. [1,2]. Seda saab sünteesida või tuletada teisest flavonoidist, hesperidiinist [1,2]. Diosmiini üksi või kombinatsioonis hesperidiiniga kasutatakse laialdaselt flebotroopse ravimina venoossete ja lümfisüsteemi häirete, nagu krooniline venoosne puudulikkus ja hemorroidid, raviks [3,4]. Lisaks on diosmiinil mitmeid teisi bioloogilisi ja farmakoloogilisi toimeid, sealhulgas antioksüdantne ja põletikuvastane toime [5,6], mutageensed ja kasvajavastased omadused [7,8], antibiootiline toime [9], antihüperglükeemiline toime [5,6]. 10] ja kaitsev toime mitme organi kahjustuste eest, st

kardiovaskulaarne [11], võrkkesta [12],neerud, maksa- ja ajukahjustus [13].

Neerkivitõbi (või neerukivitõbi/urolitiaas) on põhjustatud neerude sees tekkinud ja ladestunud tahketest kividest ning see mõjutab inimesi suure kordumise sagedusega kõikjal maailmas [14–17]. Kõigist mitmesugustest põhjustavatest kristallidest on kaltsiumoksalaat (CaOx), eriti monohüdraatvorm (COM), kõige patogeensem ja levinum kristalne komponent, mida leidub kivimoodustajatel (neerukividega patsiendid) [18]. Mehaaniliselt on COM-kristallidel kõige tugevam kleepuvusvõime ja kõige tsütotoksilisem toime neerutuubulite epiteelirakkudele [19, 20]. Kivi patogeneesi ajal on nii Randalli naastude mudelil kui ka intratuubulaarsel hüpoteesil COM-i kivide moodustumise protsesside ühised tunnused, sealhulgas COM-i kristalliseerumine, kasv, agregatsioon, pinna adhesiooniga kinnipidamine neerutorukeste rakkudel või neeruvaagnal, rakkudesse sisenemine ja invasioon neerude interstitium rakuvälise maatriksi (ECM) kaudu [21,22].

Viimasel ajal on paljud uuringud keskendunud ravimite avastamisele, kasutades ravimtaimi/puuvilju ja nende bioaktiivseid ühendeid eesmärgiga ennetada uute ja/või korduvate kivide moodustumist. Mitmed varasemad aruanded on näidanud, et mõnedel bioaktiivsetel ühenditel, eriti fenoolsetel ühenditel (polüfenool, flavonoid, flavoonglükosiid jne), mis on ekstraheeritud mitmetest ravimtaimedest/puuviljadest, on ennetav toime patogeensete mehhanismide vastu.neerudkivitõbi nii in vitro kui ka in vivo [23–25]. Nende kasulike ainete hulgas on mõned aruanded näidanud, et diosmiin võib loommudelites takistada CaOx kristallide ladestumist neerukoes [26, 27]. Kuid selle täpset moduleerivat rolli (inhibeerimine või edendamine) ja mehhanisme (etapid või kivide moodustumise protsessid) COM-i neerukivide moodustumisel ei uuritud. Käesolevas uuringus hinnati seega süstemaatiliselt selle mõjudiosmiin(2,5–160 nM) erinevatel etappidelneerudkivide moodustumise protsessid, sealhulgas kristalliseerumine, kristallide kasv, agregatsioon, kristallrakkude adhesioon, sisestamine neerutuubulite rakkudesse ja invasioon ECM-i kaudu.

Klõpsake selleksCistanche tubulosa annus neerufunktsiooni jaoks

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Diosmiini valmistamine

Diosmin(Tokyo Chemical Industry; Tokyo, Jaapan) lahustati 100% dimetüülsulfoksiidiga (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) ja tööalikvoodid valmistati lõppkontsentratsioonides 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ja 160 nM, et uurida selle mõju COM-kristallidele. Lisaks kasutati kõigis katsetes negatiivse kontrollina 100% DMSO-d.

2.2. Rakukultuur

Nefroni distaalsest tubulaarsest segmendist (ATCC; Manassas, VA) saadud MDCK neerutuubulite epiteeli rakuliin paljundati Eagle'i minimaalses essentsiaalses söötmes (MEM) (Gibco; Grand Island, NY), millele oli lisatud 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS). 60 U/ml penitsilliini G (Sigma-Aldrich) ja 60 ug/ml streptomütsiini (Sigma-Aldrich). Rakke hoiti niisutatud inkubaatoris 5% CO2-ga temperatuuril 37 °C.

2.3. COM kristallisatsiooni test

COM-i kristallimine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [28, 29]. Lühidalt, 24-süvendi plaadi (Corning Inc.; Corning, NY). võrdne kogus (4 ul) kristallisatsioonipuhvrit (tühikontroll), DMSO (negatiivne kontroll) võidiosmiin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 või 160 nM) segati CaCl2-ga. Lõpuks lisati seejärel 500 ul 1,0 mM Na2C2O4 kristalliseerimispuhvris, et muuta CaCl2 ja Na2C2O4 lõppkontsentratsioonid vastavalt 5 mM ja 0,5 mM. Segu inkubeeriti 25 °C juures 1 tund ja seejärel uuriti. Kristallkujutised jäädvustati juhuslikult vähemalt 15 suure võimsusega väljast (HPF) Nikon Eclipse Ti-S pööratud faasikontrastvalgusmikroskoobiga (Nikon; Tokyo, Jaapan). Kristallide suurust ja arvu mõõdeti iga proovi jaoks vähemalt 15 HPF-ist, kasutades NIS Element D tarkvara versiooni 4.11 (Nikon). Kristalli mass arvutati vähemalt 100 kristalli põhjal 15 HPF-is järgmise valemi abil: Kristalli mass (µm2/HPF)=Keskmine kristalli suurus igal väljal (µm2) × Kristallide arv igal väljal (/HPF) ( 1)

2.4. COM kristallide kasvu test

Kristallide kasvu test viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [30, 31].

Lühidalt, võrdne maht (500 ul) 10 mM CaCl2⋅2H2O ja 1,0 mM Na2C2O4 kristallimispuhvris segati (1:1) (maht/maht) igas { süvendis. {12}}kaevuplaat. Segu inkubeeriti temperatuuril 25 °C 1 tund, et võimaldada täielikku kristalliseerumist. Sel hetkel (T0) võrdne maht (4 ul) kristallisatsioonipuhvrit (tühikontroll), DMSO (negatiivne kontroll) võidiosmiin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 või 160 nM) lisati igasse süvendisse ja segu inkubeeriti veel 60 minutit (T60). T0 ja T60 ajal jäädvustati Nikon Eclipse Ti-S pööratud faasikontrastvalgusmikroskoobi all juhuslikult vähemalt 15 HPF-ist kristallkujutised. Kristallide suurust T0 ja T60 juures mõõdeti NIS Element D tarkvaraversiooni 4.11 (Nikon) abil, samas kui kristallide kasv (mis kujutab endast Δ kristalli suurus) arvutati vähemalt 100 kristalli põhjal 15 HPF-is järgmise valemi abil: Δ Kristalli suurus (µm2)=Kristalli suurus T60 juures − Kristalli suurus T0 juures (2)

2.5. COM kristallide agregatsiooni test

Kristallide agregatsiooni test viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [32, 33]. COM-kristallid genereeriti nii, nagu eespool mainitud kristallide kasvu testis, kuid suurema mahuga 50- ml koonilises tuubis (Corning Inc.) ja seejärel koguti tsentrifuugimisega 2000 g juures 5 minutit. Supernatant visati ära, samas kui COM-kristalle pesti kolm korda metanooliga. Pärast teist tsentrifuugimist 2000 g juures 5 minutit, metanool visati ära ja kristalle kuivatati õhu käes üle öö temperatuuril 25 °C. COM-kristallid (1000 µg kuivmass) resuspendeeriti 1 ml kristalliseerimispuhvris 6-süvendi plaadi igas süvendis (Corning Inc.). võrdne kogus (4 ul) kristallisatsioonipuhvrit (tühikontroll), DMSO (negatiivne kontroll) võidiosmiin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 või 160 nM) lisati igas süvendis COM-kristalli suspensioonile. Plaati loksutati pidevalt loksutamisinkubaatoris (Zhicheng; Shanghai, Hiina) kiirusel 150 pööret minutis ja temperatuuril 25 ◦C 1 tund. Seejärel uuriti ja pildistati Nikon Eclipse Ti-S pööratud faasikontrastvalgusmikroskoobiga COM-kristallide agregaadi moodustumist (defineeritud kui "kolme või enama üksteisega tihedalt ühendatud COM-kristalli koost" [32]). COM-kristallide agregaatide arv loendati vähemalt 15 juhuslikust HPF-ist süvendi kohta.

2.6. COM-i kristallrakkude adhesiooni test

Kristallrakkude adhesiooni test viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [34, 35]. Lühidalt, COM-kristallid genereeriti ülalmainitud viisil 50- ml koonilises tuubis ja seejärel koguti tsentrifuugimisega 2000 g juures 5 minutit. Supernatant visati ära, samas kui COM-kristalle pesti kolm korda metanooliga. Pärast teist tsentrifuugimist 2000 g juures 5 minutit, metanool visati ära ja kristalle kuivatati õhu käes üle öö temperatuuril 25 °C. Kristallid dekontamineeriti UV-valguskiirgusega 30 minutit enne rakkudega sekkumist.

MDCK rakud (tihedusega 2 × 105 rakku süvendi kohta) külvati ja kasvatati 6- süvendiplaadi (Corning Inc.) igas süvendis 48 tundi, et saada konfluentne monokiht. Seejärel värskendati söödet enne COM-kristallide lisamist (100 µg kuivmassi kristalle 1 ml söötme kohta). võrdne kogus (4 ul) kristallisatsioonipuhvrit (tühikontroll), DMSO (negatiivne kontroll) võidiosmiin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 või 160 nM) lisati igasse süvendisse. Rakke inkubeeriti veel niisutatud inkubaatoris 5% CO2-ga temperatuuril 37 °C 1 tund. Seejärel pesti rakke intensiivselt viis korda PBS-iga ja pildistati Nikon Eclipse Ti-S pööratud faasikontrastvalgusmikroskoobiga. Ülejäänud COM-kristallide arv, mis olid kleepunud neerutorurakkude pinnale, loendati vähemalt 15 juhuslikust väljast süvendi kohta.

Cistanche neerufunktsiooni jaoks

2.7. COM-i kristallide sisestamise test

Fluorestsentsmärgisega COM-kristallid genereeriti nii, nagu eelnevalt kirjeldatud [36, 37]. Kristalliseerimiseks kasutatud kemikaalide koostis/kontsentratsioonid olid samad, mis ülalpool mainitud tavaliste (märgistamata) kristallide puhul, kuid 0,1 µg/ml fluorestseiini isotiotsüanaat (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) lisati enne Na2C2O4-ga segamist CaCl2⋅2H2O lahusele. Järgmised etapid (kristalliseerimine ja koristamine) viidi läbi nagu eespool mainitud, kuid pimedas.

Kristallide sisestamise hindamiseks neerutuubulaarsetesse epiteelirakkudesse külvati MDCK rakud (tihedusega 2 × 105 rakku süvendi kohta) ja kasvatati 6- süvendiplaadi (Corning Inc.) igas süvendis 48 tundi, et saada. konfluentne monokiht. Raku monokihti inkubeeriti FITC-märgistatud COM-kristallidega (1000 µg kristalli/ml söödet) niisutatud inkubaatoris 5% CO2-ga temperatuuril 37 ◦C 1 tund. Seejärel pesti rakke PBS-ga ja inkubeeriti trüpsiin-EDTA lahusega, et eemaldada mitteinternaliseerunud (nii kleepuvad kui ka mittekleepuvad) kristallid. Internaliseeritud kristallidega rakkude protsent kvantifitseeriti kokku 10 000 omandatud sündmuse põhjal, kasutades voolutsütomeetrit (BD Accuri C6) (BD Biosciences; San Jose, CA). Tavaliste (märgistamata) COM-kristallidega inkubeeritud rakke kasutati positiivse fluorestsentssignaali müra ja läve eelhäälestamiseks. Seejärel loendati positiivsete fluorestsentssignaalidega rakud ja neid kasutati selliseks protsendi arvutamiseks.

2.8. COM-i kristallide invasioon ECM-testi kaudu

COM-kristallid valmistati ülalkirjeldatud viisil kristallide agregatsiooni ja kristallrakkude adhesioonianalüüside jaoks. Kristallide invasiooni test viidi läbi vastavalt eelnevalt kehtestatud protokollile [38, 39]. Lühidalt kokku 20 µg COM-kristalle, mis on kaetud kristallisatsioonipuhvriga (tühikontroll), DMSO-ga (negatiivne kontroll), albumiiniga (Sigma-Aldrich) (positiivne kontroll) võidiosmiin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 või 160 nM) lisati 200 ul MEM-i. Seejärel segati 200 ul 0,3 pM Lys-plasminogeeni (Fitzgerald Industries International; Acton, MA) PBS-is ja inkubeeriti kristallvalgu kompleksiga 37 °C juures 1 tund. Seondumata plasminogeen visati ära tsentrifuugimisega 2000 g juures 5 minutit ja pelletit pesti üks kord PBS-ga. Seejärel segati 100 ui 0,15 pM urokinaasi plasminogeeni aktivaatorit (uPA) (Fitzgerald Industries International) PBS-s kristall-valk-plasminogeeni/plasmiini kompleksiga. Seejärel lisati segu maatriksgeeli peale ECM-i migratsioonikambrisse ja inkubeeriti temperatuuril 37 °C. Pärast 24-tunnist inkubeerimist eemaldati migratsioonikambri ülemisse ossa jäänud lahus marli või pehme paberi abil. Seejärel pildistati maatriksgeeli sissetunginud COM-kristalle, kasutades diferentsiaalse interferentsi kontrasti (DIC) režiimi (Nikon H600L) valgusmikroskoobi. Kristallide invasiooni kaugust mõõdeti ja keskmistati vähemalt 15 väikese võimsusega väljast (LPF-st) samas kambris, kasutades NIS Element D tarkvara versiooni 4.11 (Nikon).

2.9. Statistiline analüüs

Kõik ülaltoodud katsed viidi läbi kolmes korduses (kolm sõltumatut katset) ja kvantitatiivsed andmed on esitatud kui keskmine ± SEM. Viidi läbi mitu võrdlust, kasutades ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA) Tukey post-hoc testiga. Muutujate vahelise seose määramiseks viidi läbi Pearsoni korrelatsioonitest. Kõik statistilised analüüsid viidi läbi, kasutades SPSS-i tarkvara (versioon 18) (IBM SPSS; Armonk, NY). P väärtust alla 0,05 peeti statistiliselt oluliseks.

3. Tulemused

3.1. Diosmiini mõju COM-i kristalliseerumisele

Kristalliseerimine on üks olulisi varaseid etappeneerudigat tüüpi kivide moodustumise protsessid. Pärast 1-h kristalliseerumist koos või ilmadiosmiinerinevatel kontsentratsioonidel (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 või 160 nM) mõõdeti COM-i kristallide suurus ja arv ning arvutati kristallmass. Kristalliseerimispuhver ja lahjendi DMSO olid vastavalt tühjaks ja negatiivseks kontrolliks. Andmed näitasid, et kõik disomini annused (2,5–160 nM) vähendasid oluliselt kristallide suurust, kuid suurendasid kristallide arvu annusest sõltuval viisil, võrreldes tühja ja negatiivse kontrolliga (joonis 1A–1C). Kooskõlas kristallide arvuga suurenes kristallmass annusest sõltuvalt (joonis 1D). Üldiselt näitavad need andmed, et diosmiin soodustab COM-i kristalliseerumist (neokristallid).

3.2. Diosmiini mõju COM-kristallide kasvule

Moduleeriv toimediosmiinCOM-is hinnati kristallide kasvu, mõõtes kristallide suuruse muutust (Δ kristalli suurus) pärast 60-minutilist täiendavat inkubeerimist pärast esialgse kristallisatsioonietapi lõppu, kui neokristalle ei olnud. Tulemused näitasid, et kõik disomiini annused (2,5–160 nM) vähendasid märkimisväärselt Δ kristalli suurust annusest sõltuval viisil võrreldes tühja ja negatiivse kontrolliga (joonis 2). Need leiud näitavad, et diosmiin pärsib COM-kristallide kasvu.

3.3. Diosmiini mõju COM-i kristallide agregatsioonile

Lisaks kristallide kasvule on teine ​​​​oluline samm selle käigus üksteisega tihedalt kleepuvate üksikute kristallide agregeerimineneerudkivide patogenees. Kristallide kõrge agregatsiooniaste võib lõppkokkuvõttes viia kivide suurenemiseni ja väikese neerutuubuli luumeni ummistumiseni. Võrreldes tühja ja negatiivse kontrolliga,diosmiin10–160 nM juures suurenes annusest sõltuv COM-kristalli agregaatide arv (joonis 3). Need tulemused näitavad, et diosmiin soodustab COM-i kristallide agregatsiooni.

Cistanche neerufunktsiooni jaoks

3.4. Diosmiini mõju COM-i kristallrakkude adhesioonile

Põhjustavate kristallide säilitamine on üks olulisemaid sammeneerudkivide moodustumist ja seda võib esile kutsuda kristallrakkude adhesioon, mis takistab kristallide väljutamist koos uriini väljavooluga. Seega hindasime moduleerivat aktiivsustdiosmiinCOM-i kristall-rakkude adhesiooni kohta. Andmed näitasid, et diosmiin kontsentratsioonis 5–160 nM vähendas annusest sõltuval viisil märkimisväärselt COM-kristallide kleepuvust neerutuubulite rakkudele võrreldes tühja ja negatiivse kontrolliga (joonis 4). Need andmed näitavad, et diosmiin inhibeerib COM-i kristallrakkude adhesiooni.

3.5. Diosmiini mõju COM-i kristallide sisestamisele neerutuubulite rakkudesse

Pärast adhesiooni võivad mõned COM-kristallid sisestada neerutuubulite rakkudesse ja põhjustada mitmeid järgnevaid rakulisi reaktsioone [37, 40]. Kristallide sisestamist hinnati FITC-märgistatud COM-kristallide abil ja kvantifitseeriti voolutsütomeetria abil. Tehnilise müra lahutamiseks ja fluorestsentsi intensiivsuse tagamiseks FITC signaalist kasutati tavalisi COM-kristalle (ilma märgistuseta). Võrreldes tühjade ja negatiivsete kontrollidega vähenes internaliseeritud kristallidega rakkude protsent oluliseltdiosmiin10–160 nM juures annusest sõltuval viisil (joonis 5). Leiud näitavad, et disomiin pärsib COM-i kristallide sisestamist neerutuubulite rakkudesse.

3.6. Diosmiini mõju COM-i kristallide invasioonile ECM-i kaudu

Kristallide invasioon ECM-i kaudu on patogeenne / hävitav protsessneerudkivide patogenees, mis võib vallandada erinevaid põletikulisi reaktsioone ja kaskaade, halvendades seeläbi haiguse mehhanisme. Uurisime seda nähtust, kasutades väljakujunenud protokolli, mis põhines kristallvalgu kompleksi plasminogeeni-plasmiini aktiivsusel [38, 39]. Tulemused näitasid, et kõik disomiini annused (2,5–160 nM) suurendasid annusest sõltuval viisil oluliselt COM-i kristallide invasiooni läbi ECM (joonis 6). Huvitaval kombeldiosmiin160 nM juures võib soodustada COM-kristallide invasiooni, mis on võrreldav albumiiniga, mis on COM-i kristallide invasiooni tuntud tugev promootor [41] (joonis 6). Need tulemused näitavad, et diosmiin soodustab tugevalt COM-i kristallide invasiooni ECM-i kaudu.

Joonis 1. MõjudiosmiinCOM kristallisatsiooni kohta. Kristallisatsioonitest viidi läbi võrdse koguse (4 ul) kristalliseerimispuhvriga (pimekontroll), DMSO-ga (negatiivne kontroll) või diosmiiniga (2,5–160 nM). (A): kristallide morfoloogia igas seisundis pärast 1-h kristalliseerumist. Algne suurendus oli kõigi paneelide puhul 400×. (B): Kristalli suurus. (C): Kristalli number. (D): Kristalli massi (vt valemit 1 jaotises "Materjalid ja meetodid") analüüsiti vähemalt 100 kristallist 15 HPF-is. Iga riba tähistab 3 sõltumatust katsest saadud andmete keskmist ± SEM. *=lk< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">

Joonis 2. MõjudiosmiinCOM-kristallide kasvu kohta. Kristallide kasvu test viidi läbi pärast kristalliseerumise lõppemist (uuskristallimise vältimiseks) võrdse koguse (4 ul) kristallimispuhvriga (pimekontroll), DMSO-ga (negatiivne kontroll) või diosmiiniga (2,5–16{4}} nM). (A): kristallide morfoloogia igas seisundis T0 ja T60. Algne suurendus oli kõigi paneelide puhul 400 ×. (B)-(J): kristallide suuruste histogrammid, mis on mõõdetud iga rühma üksikutelt kristallidelt T0 ja T60 juures. (K): Δ Kristallide suurust (vt valemit 2 jaotises "Materjalid ja meetodid") analüüsiti vähemalt 100 kristalli põhjal 15 HPF-is. Iga riba tähistab 3 sõltumatust katsest saadud andmete keskmist ± SEM. *= p < 0,05="" vs.="" tühi="" kontroll;="" #="p">< 0,05="" vs.="">

Joonis 3. MõjudiosmiinCOM-i kristallide agregatsiooni kohta. Kristallide agregatsiooni test viidi läbi võrdse mahu (4 ul) kristallisatsioonipuhvriga (pimekontroll), DMSO-ga (negatiivne kontroll) või diosmiiniga (2,5–160 nM). (A): agregeeritud COM-kristallide mikropildid (märgistatud punktiirringidega). Algne suurendus oli kõigi paneelide puhul 400 ×. (B): Kristallide agregaatide arv loendati vähemalt 15 juhusliku HPF-i põhjal igas süvendis. Iga riba tähistab 3 sõltumatust katsest saadud andmete keskmist ± SEM. *=lk< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">

Joonis 4. MõjudiosmiinCOM-i kristall-rakkude adhesiooni kohta. Kristallrakkude adhesiooni test viidi läbi võrdse koguse (4 ul) kristalliseerimispuhvriga (tühikontroll), DMSO-ga (negatiivne kontroll) või diosmiiniga (2,5–160 nM). (A): Ülejäänud kristallide mikropildid, mis kleepusid tihedalt raku monokihile pärast seondumata kristallide eemaldamist jõulise PBS-iga pesemisega. Kõigi paneelide algne suurendus oli 200 ×. (B): kleepunud kristallide arv loendati igas süvendis vähemalt 15 juhuslikult väljalt. Iga riba tähistab 3 sõltumatust katsest saadud andmete keskmist ± SEM. *= lk<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">

Joonis 5. MõjudiosmiinCOM-i kristallide sisestamisel neerutuubulite rakkudesse. Kristallide sisestamise test viidi läbi, kasutades FITC-märgistatud COM-kristalle (FITC-COM), samas kui tausta / müra lahutamiseks kasutati tavalisi (märgistamata) COM-kristalle. Analüüs viidi läbi võrdse koguse (4 ul) kristalliseerimispuhvriga (tühikontroll), DMSO-ga (negatiivne kontroll) või diosmiiniga (2,5–16{12}}nM). (A): rakkude suuruse (y-telg) ja FITC-fluorestsentsi intensiivsuse (x-telg) voolutsütomeetriline punktdiagrammi analüüs pärast mitteinternaliseeritud kristallide eemaldamist 0,1% trüpsiini/2,5 mM EDTA-ga. (B): Internaliseeritud FITC-märgistatud COM-kristallidega rakkude protsent. Iga riba tähistab 3 sõltumatust katsest saadud andmete keskmist ± SEM. *= lk<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">

Joonis 6. MõjudiosmiinCOM-i kristallide sissetungi kohta ECM-i kaudu. Kristallide invasioon ECM-testi kaudu viidi läbi, kasutades kristallisatsioonipuhvriga (tühikontroll), DMSO-ga (negatiivne kontroll), albumiini (positiivne kontroll) või diosmiiniga (2,5–160 nM) kaetud COM-kristalle. (A): mikropildid COM-kristallidest, mis tungisid või migreerusid läbi ECM-i migratsioonikambri. Kõigi paneelide algne suurendus oli 100 ×. (B): kristallide sissetungi kaugust mõõdeti igas kambris vähemalt 15 juhuslikust LPF-ist. Iga riba tähistab 3 sõltumatust katsest saadud andmete keskmist ± SEM. *= lk<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">

4. Arutelu

Neerukivitõbi on põhjustatud kivide moodustumisest neerude seesneerudja vaagnaelundite süsteem. Tavalised neerukivide moodustumise protsessid hõlmavad COM-i kristalliseerumist, kasvu, agregatsiooni, kinnipidamist kristallrakkude adhesiooni teel ja invasiooni läbi neerude interstitsiumi, mis on rikas ECM-iga [21, 22]. Selle haiguse ennetamiseks on tehtud mitmeid katseid, kasutades erinevaid ravimeid ja/või toidulisandeid. Paljud hiljutised tõendid on näidanud, et flavonoididel, flavoonglükosiididel ja muudel tsitrusviljadest ekstraheeritud ühenditel võib olla neerukivitõve ja muude häirete ennetav toime [23–25]. Nende seas,diosmiin, looduslik flavooglükosiidi ja hesperidiini derivaat, mida leidub peamiselt tsitrusviljades [1,2], on väidetavalt ennetav roll vigastuste ja kahjustuste vastu.neerudkude [13,42]. Lisaks on selle urolitiaasivastast rolli kirjeldatud mõnes varasemas loommudeleid kasutanud uuringus [26, 27]. Sellegipoolest jäid diosmiini kasulikud mõjud ja aluseks olevad mehhanismid neerukivide ennetamisel häguseks. Seega uurisime diosmiini moduleerivat aktiivsust COM-kristallidel. Süstemaatilised analüüsid viidi läbi KOMi erinevatel etappidelneerudkivide moodustumine, sealhulgas kristalliseerumine, kristallide kasv, agregatsioon, kristallrakkude adhesioon, sisestamine neerutuubulite rakkudesse ja invasioon ECM-i kaudu.

Pärast suukaudset manustamistdiosmiin, on selle plasmatase inimestel vahemikus {{0}},5 kuni 200 ng/ml (või 0,8–300 nM) [43,44]. Maksimaalne plasmakontsentratsioon (Cmax) on ligikaudu 50 ng/ml (või 85 nM) [43,44]. Seetõttu olid meie käesolevas uuringus kasutatud diosmiini annused (2, 5–160 nM) selle farmakokineetika jaoks farmakoloogiliselt olulises vahemikus. Kuna DMSO-d kasutati lahjendina diosmiini täielikuks lahustamiseks vastavalt soovitusele, kasutati DMSO-d selles uuringus negatiivse kontrollina lisaks pimeproovile tagamaks, et lahjendi enda poolt ei esineks mingeid mõjusid, mis võiksid segada andmete tõlgendamist. Kõigis analüüsides näitasid andmed, et DMSO-l ei täheldatud olulisi mõjusid ja kõik negatiivsest kontrollist saadud kvantitatiivsed andmed olid võrreldavad pimekatse omadega.

COM kristallisatsioonianalüüs näitas, et kõik kontsentratsiooniddiosmiin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ja 160 nM) võib vähendada COM-kristallide suurust, kuid teisest küljest suurendada kristallide arvu. Kuna kristallmass on nii kristallide suuruse kui ka arvu lõppsaadus ja see on COM-i kristalliseerumisastme kajastamiseks asjakohasem, hindasime seejärel, kas diosmiin mõjutas seda kristalliindeksit. Andmed näitasid, et kõigil diosmiini kontsentratsioonidel oli COM-i kristallmassi soodustav toime, mis on kooskõlas kristallide arvu andmetega. Pärast kristallimist võivad COM-kristallid järgmise etapi jaoks veelgi suurenedaneerudkivide moodustumine.

Erinevalt kristalliseerumisest avaldas diosmiin kõigil kontsentratsioonidel COM-kristallide kasvu pärssivat toimet annusest sõltuval viisil. Mõned varasemad uuringud on teatanud, et CaOx kristallide lahustuvust saab suurendada glükosüülimisega hüdroksüantrakinoonide derivaatide abil [45]. Lisaks võivad sellistes bioaktiivsetes ühendites sisalduvad suhkrud seostuda vaba kaltsiumiiooniga, mis võib olla tingitud hüdroksüülrühmadest molekulaarstruktuuris, pärssides seeläbi CaOx kristallide moodustumist [45, 46]. Diosmiin võib sellel mehhanismil põhineva COM kristallisatsiooni protsessis mõjutada ka solubiliseeritud kaltsiumi ja oksalaadi ioonide üleminekut COM-kristallilisteks osakesteks neerutuubulite vedelikus.

Sellegipoolest soodustas COM-i kristallide agregatsiooni 10–160 nMdiosmiin, mis viitab diosmiini võimele toimida linkeri või kleepuva molekulina üksikute kristallide värbamisel, et need omavahel seostuda, moodustades kristalliagregaadid. See sidumine põhjustab ka kleepuvate sildade edenemist üksikute kristallide vahel ja võib indutseerida COM-kristallide suure struktuuri moodustumist, mis aitab kergesti kaasa kivide ladestumiseleneerud[32].

COM-i kristallide kinnipidamine kristallide adhesiooni kaudu neerutuubulite rakkude pinnal on kindlaks tehtud kui veel üks oluline samm neerukivide moodustumisel [47]. Meie andmed näitasid, et diosmiin võib vähendada COM-kristallide kleepuvusvõimet seonduda MDCK neerutuubulite rakkude apikaalsete pindadega. Mõned varasemad uuringud on näidanud, et glükoosaminoglükaanid (polüsahhariidühendid), mis on kaetud CaOx kristallidega või ekspresseeruvad neerutuubulite rakkudes, võivad häirida CaOx kristallide kleepumist neerutuubulite rakkudele [48]. Lisaks on kristallretseptorite ekspressioon neerutuubulite rakkudel üks olulisemaid mehhanisme, mis määrab kristallrakkude adhesiooni [21]. Kuigi CaOx kristallid põhjustavad apikaalsete membraanide, eriti mikrovilli vigastusi, võivad mõned polüfenoolid, nagu epigallokatehhiingallaat (EGCG), takistada kristallrakkude adhesiooni ja rakukahjustusi [49]. Lisaks on varem teatatud, et erinevates taimeekstraktides sisalduv flavonoid suurendab uriini pH taset, mis põhjustab kristallrakkude adhesiooni pärssimist [50,51]. Võib-olla,diosmiinvõib ka selliseid COM-i poolt indutseeritud rakukahjustusi nõrgendada, vähendades seeläbi kristallrakkude adhesiooni.

On näidatud, et COM-i kristallide sisestamine toimub peamiselt endotsütoosi kaudu aktiini tsütoskeleti vahendatud makropinotsütoosi raja kaudu [40]. On teatatud, et flavonoidid, nagu kvertsetiin, mõjutavad makropinotsütoosiks vajalikku aktiini tsütoskeletti [52,53]. Meie leiud näitasid, et diosmiin vähendas oluliselt MDCK rakkude võimet sisestada COM-kristalle. Selline diosmiini inhibeeriv toime võib olla seotud aktiini tsütoskeleti kokkupaneku või organiseerimisega rakkude sees, mis mõjutab otseselt makropinotsütoosi rada [54,55].

Pärast internaliseerimist lagundasid COM-kristallid endolüsosoomid, mille tulemuseks oli vabade kaltsiumi- ja oksalaadiioonide suurenemine neerude interstitsiumis [37]. Selline kaltsiumi- ja oksalaadiioonide suurenemine võib viia COM-i neokristalliseerumiseni neerude interstitsiumis [56,57]. Lisaks võib interstitsiaalsete COM-kristallide olemasolu olla tingitud tiheda ristmiku ja paratsellulaarsete adhesioonibarjääride defektidest, mille tulemuseks on suurenenud paratsellulaarne läbilaskvus ja kristallide translokatsioon [58–60]. Need kristallid võivad seejärel ECM-i kaudu tungida neerude interstitsiumi ja seejärel vallandada mitmeid põletikulisi reaktsioone ja koekahjustusi [58–60]. Selles uuringus täheldasime, et kõik diosmiini kontsentratsioonid kutsusid esile COM-kristallide sissetungi läbi ECM-i migratsioonikambri. Diosmiin võib seostuda COM-i kristallpindadega ja suhelda plasminogeeni-plasmiini süsteemiga, mis ajendas kristallide migratsiooni ECM-i migratsioonikambris [38, 39].

Tistanche neerude jaoks

Sestdiosmiinindutseerisid nii pärssivat kui soodustavat mõju erinevatele COM-kivi moodustumise protsessidele, seetõttu määrasime nende seose Pearsoni korrelatsioonitesti abil. Korrelatsioonianalüüs näitas, et kristallide arv korreleerus pöördvõrdeliselt nii kristallide suuruse kui ka kristallide kasvuga (Δ Kristalli suurus) (joonis 7A ja B). Kristallide suurus korreleerus tugevalt kristallide kasvuga (joonis 7C), kuid pöördvõrdelises korrelatsioonis kristallimassiga (joonis 7D). Lõpuks korreleerus kristallmass tugevalt nii kristallide arvu kui ka kristallide agregatsiooniga (joonis 7E ja F). Korrelatsioonianalüüsi andmed näitavad, et kristallide arv ja kristallmass on kristalliseerumise kajastamiseks olulisemad kui kristalli suurus (joonised 7A, D ja E). Lisaks on neokristallide suurus kristallimise ajal seotud eelvormitud kristallide kasvuga (joonis 7C), samas kui kristalliseerumisaste (mida peegeldab kristallide arv ja kristallmass) on tihedalt seotud kristallide agregatsiooni astmega (joonis 7E ja F). Kuid need korrelatsioonid on kõige tõenäolisemalt spetsiifilised diosmiini efektide suhtes, samas kui teiste modulaatorite mõjudel võivad olla samad korrelatsioonid või mitte. Näiteks vähendab fibronektiin kristallmassi ja pärsib kristallide kasvu, kuid soodustab kristallide agregatsiooni [31]. Lisaks suurendab terve elujõuline Escherichia coli kristallide suurust ja massi, kuid ei mõjuta kristallide arvu [33]. Need andmed näitavad, et korrelatsioonid erinevate COM-kristallanalüüside vahel ei ole kõigi modulaatorite jaoks universaalsed.

Lõpuks oleme kokku võtnud erinevate analüüside tulemused ja integreerinud need patogeensete mehhanismideganeerudkivitõbi (vt skeeme joonisel 8). Korrelatsioonianalüüsi põhjal soodustab diosmiin kristalliseerumist (joonis 8A). Kristalliseerumise ja kristallide kasvu vaheldiosmiinhoiab hästi tasakaalu, soodustades kristalliseerumist, kuid teisest küljest pärsib kristallide kasvu (joonis 8B). Mis puudutab kõiki mõjusid ainult COM-kristallidele (arvestamata ka sekkuvaid rakke ja ECM-i), siis on diosmiini soodustav aktiivsus silmatorkavam kui selle inhibeeriv toime COM-kristallidele, kuna see soodustab nii kristalliseerumist kui ka kristallide agregatsiooni, kuid pärsib ainult kristallide kasvu ( joonis 8C). Kuigi kristalliseerumine suureneb, väheneb kristallide suurus ja see on seotud kasvu pärssimisega (joonis 7C). Need andmed on kooskõlas Kavanagh jt tulemustega. [61–63], mis näitab, et kristalliseerumise suurenemine viib kaltsiumi- ja oksalaadiioonide üleküllastumise vähenemiseni lahuses, vähendades seeläbi kasvu. Kuid kristallide kasv ei ole ainus tegur, mis määrabneerudkivi patogenees [64], eriti kui kristallmass ületab ja on seotud kristallide agregatsiooni suurenemisega (joonis 7F), mis võib suurendada võimalust, et kristallmaterjalid takerduvad väikestesse torukujulistesse segmentidesse (tuubuliseses hüpoteesis), suurendades seeläbi kivide moodustumise võimalus. Veelgi enam, eelmine uuring on näidanud, et andmed on kooskõlas meie leidudega, mis näitab, et kristallide arvu suurenemine on seotud kristallide agregatsiooni suurenemise ja kivide suurenemisega [63].

Joonis 7. Korrelatsioonide analüüs. (A)–(F): COM-kristallide arvu, kristallide suuruse, Δ kristalli suuruse, kristallmassi ja mitmete kristallide agregaatide vahelisi seoseid analüüsiti Pearsoni korrelatsioonitestiga..

Joonis 8. Skeemid, mis võtavad kokku moduleerivad efektiddiosmiinCOM-isneerudkivide moodustumise protsessid. (A): diosmiini mõju COM-i kristalliseerumisele. (B): diosmiini mõju COM-i kristalliseerumisele ja kristallide kasvule. (C): diosmiini mõju COM-i kristalliseerumisele, kasvule ja agregatsioonile. (D): diosmiini mõju kogu COM-i neerukivide moodustumise protsessidele.

Kui võtta arvesse koostoimeid neerutuubulite rakkude ja ECM-iga, saadakse üldine pilt kahesugusest mõjustdiosmiinCOM-il muutub neerukivide moodustumine palju selgemaks (joonis 8D). Diosmiin pärsib kristallrakkude adhesiooni, vähendades seeläbi kristallide sisenemist rakkudesse. Seda võib seletada sellega, et COM-kristallide väiksemal suurusel on väiksem kleepuvusvõime neerutuubulirakkudega võrreldes võrreldes suurematega, nagu on kirjeldatud meie hiljutises uuringus [34] ja teise rühma eelmises uuringus [65]. Väiksemate COM-kristallide väiksem kleepuvusvõime tuleneb nende väiksemast kleepuvast jõust rakupinnaga ja väiksemast nendega seotud COM-kristalliretseptorite arvust, mis on määratud vastavalt aatomjõumikroskoopia ja proteoomianalüüsiga [34]. Diosmiin pärsib ka kristallide sisestamist. Pange tähele, et internaliseerimisprotsess on kahe teraga mõõk, mis vajab hoolikat tõlgendamist. Internaliseerumine või endotsütoos ühes kaitsemehhanismis, mida rakud kasutasid kristallide eemaldamiseks endolüsosoomide poolt. Intaktsete kristallide lagunemine tekitab aga vabu kaltsiumi- ja oksalaadiioone, mis võivad liikuda rakusisesest sektsioonist neerude interstitsiumi, kus nad võivad tekitada neokristalle [56, 57]. Teisest küljest soodustab diosmiin kristallide sissetungi ECM-i kaudu, mis on üks neerukivide patogeneesi jaoks olulisi mehhanisme (eriti Randalli naastude mudelis) [58–60]. Üldiselt on joonisel 8D kokku võetud kõik diosmiini kahekordne moduleeriv toime COM-ileneerudkivide moodustumise protsessid. Tuleb märkida, et nende soodustavate ja pärssivate mõjude tasakaalu ei saa täpselt välja arvutada (erinevalt matemaatilisest võrrandist). Lisaks on veel mitmeid endogeenseid ja eksogeenseid tegureid, mis võivad samuti kivide moodustumise protsesse sekkuda. Lõpuks avaldab diosmiin ka mitmeid kaudseid mõjusid neerukivide moodustumisele, sealhulgas selle antioksüdantsed ja põletikuvastased omadused [5,6], mida tuleks arvesse võtta. Seetõttu on nende kahe moduleeriva mõju lõpptulemusdiosmiinCOM-isneerudkivide moodustumine vajab täiendavat in vivo uurimist ja suure kohordi prospektiivset uuringut.

5. Kokkuvõtted

Kokkuvõttes kirjeldame siin diosmiini kahekordset mõju COM-kristallide modulatsioonile annusest sõltuval viisil. Kuigi see pärsib COM-i kristallide kasvu, kristallrakkude adhesiooni ja sisestamist neerutuubulite rakkudesse,diosmiinsoodustab COM-i kristalliseerumist, agregatsiooni ja invasiooni läbi ECM-i. Seetõttu on selle urolitiaasivastane roll kaheldav ja selle kasutamisel neerukivitõve korral tuleb olla ettevaatlik.

CRediT autorluse panuse avaldus

Supaporn Khamchun: kontseptualiseerimine, metoodika, tarkvara, valideerimine, formaalne analüüs, uurimine, andmete kureerimine, kirjutamine – algne mustand, visualiseerimine, Sunisa Yoodee: kontseptualiseerimine, metoodika, tarkvara, valideerimine, formaalne analüüs, uurimine, andmete kureerimine, kirjutamine – algne mustand, Visualiseerimine, Thongboonkerdi külastamine: kontseptualiseerimine, metoodika, tarkvara, valideerimine, ressursid, kirjutamine – ülevaatus ja redigeerimine, järelevalve, projektihaldus, rahastamise hankimine.

Huvide konflikti avaldus

Autorid kinnitavad, et EI OLE huvide konflikti.

Tänuavaldused

Oleme Kittiya Suwannakud tehnilise abi eest tänulikud. Seda tööd toetasid riikliku kõrghariduse teadusuuringute ja innovatsioonipoliitika nõukogu (NXPO) PMU-B ja Tai teadusfondi (IRN60W0004) kaudu. VT-d toetab ka meditsiiniteaduskonna Siriraji haigla Chalermphrakiat Grant.

Viited

[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Diosmin– isoleerimismeetodid, määramine taimses materjalis ja ravimvormides ning kliiniline kasutamine, Nat. Prod. Commun. 8 (2013) 545–550.

[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Loodusliku tervisele kasuliku ühendi diosmiini ainevahetus ja farmakoloogiline tegevus, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.

[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: mõju hindamine elukvaliteedile kroonilise venoosse puudulikkuse korral, Angiology 57 (2006) 131–138.

[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Mikroniseeritud puhastatud flavonoidfraktsioon: ülevaade selle kasutamisest kroonilise venoosse puudulikkuse, venoossete haavandite ja hemorroidide korral, Drugs 63 (2003) 71–100.

[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Diosmiini põletikuvastane, antioksüdant ja apoptootiline toime äädikhappest põhjustatud haavandilise koliidi korral, Hum. Exp. Toksikool. 37 (2018) 78–86.

[6] M. Berkoz, Diosmin pärsib põletikueelseid vahendajaid lipopolüsahhariididest indutseeritud RAW264.7 makrofaagides NF-kappaB ja MAPK signaaliradade kaudu, Gen. Physiol. Biophys. 38 (2019) 315–324.

[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin indutseerivad apoptoosi STAT-3 signaaliülekande moduleerimise kaudu 7,12-dimetüülbens(a)antratseeni poolt põhjustatud kahjuri põsekoti kartsinogeneesis, Biomed. Pharm. 83 (2016) 1064–1070.

[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, Diosmiiniga indutseeritud vananemine, apoptoos ja autofagia erineva p53 staatuse ja ERK aktiivsusega rinnavähirakkudes, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117–130.

[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Taaskasutatava ravimi diosmiini kombinatsioon amoksitsilliini-klavulaanhappega põhjustab mükobakterite kasvu sünergilist inhibeerimist, Sci. Vabariik 9 (2019) 6800.

[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, tsitrusviljade flavonoidi diosmiini antihüperglükeemiline toime indutseeritakse endogeense beeta-endorfiini kaudu I tüüpi diabeetilistel rottidel, Clin. Exp. Pharm. Physiol. 44 (2017) 549–555.

[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Diosmineeltöötlus parandab südamefunktsiooni ja pärsib oksüdatiivset stressi roti südames pärast isheemiat/reperfusiooni, Eur. J. Pharm. 736 (2014) 131–137.

[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin kaitseb roti võrkkesta isheemia/reperfusioonikahjustuse eest, J. Ocul. Pharm. Seal. 28 (2012) 459–466.

[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Hesperidiini ja diosmiini kaitsev toime akrüülamiidist põhjustatud maksa, neerude, ja aju oksüdatiivsed kahjustused rottidel, Environ. Sci. Saasta. Res. Int. 26 (2019) 35151–35162.

[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, AD reegel, Tegeliku koormuse kindlaksmääramineneerudkivitõbi, Nat. Rev. Nephrol. 16 (2020) 736–746.

[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, neerukivitõbi, Prim. Care 47 (2020) 661–671.

[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Neerukivid, Ann. Clin. Biochem, 56 (2019), 15–27.

[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Kivi koostis ja vaskulaarsed kaltsifikatsioonid neerukivitõvega patsientidel, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.

[18] G. Schubert, Kivianalüüs, Urol. Res. 34 (2006) 146–150.

[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Response of renal tubular cells to diferentsity type and doses of differential type and doses of the differential type and doses of the differential type and doses of the differential type and doses of the differential type and doses of diferents of the differential type and doses of diferents of the calciumoksalaadi kristalls: Proteomics 17 (2017). ), 1700192.

[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Valguvõrgu analüüs ja kaltsiumoksalaadi kristallidest põhjustatud tsütotoksilisuse funktsionaalsed uuringud neerutuubulite epiteelirakkudes, Proteomics 18 (2018), 1800008.

[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nefrolitiaas: neerukivide moodustumise molekulaarne mehhanism ja modulaatorite kriitiline roll, Biomed. Res. Int. 2013 (2013), 292953.

[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Kivide moodustumise mehhanismid, Clin. Rev Bone Miner. Metab. 9 (2011) 187–197.

[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Flavonoidide ja flavonoidirikaste taimeekstraktide kaitsev roll urolitiaasi vastu: ülevaade, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.

[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Dieettaimed haiguste ennetamiseks ja raviksneerudkivid: prekliinilised ja kliinilised tõendid ning molekulaarsed mehhanismid, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 765.

[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, Polüfenoolide mehaaniline ülevaade kaltsiumoksalaadi urolitiaasi leevendamisel, Biomed. Pharm. 106 (2018) 1292–1299.

[26] V. V. Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Diosmiini (tsitrusviljade flavonoidi) kaitsvate mõjude hindamine keemia-indutseeritud urolitiaasi korral eksperimentaalsetel rottidel, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513–1521.

[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Diosminvähendab kaltsiumoksalaadi ladestumist ja kudede degeneratsiooni nefrolitiaasi korral rottidel: stereoloogiline uuring, korealane J. Urol. 54 (2013) 252–257.

[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Kaltsiumoksalaadi kristallide tüüpe ja morfoloogiaid määravad tegurid: molaarsed kontsentratsioonid, puhverdamine, pH, segamine ja temperatuur, Clin. Chim. Acta 367 (2006) 120–131.

[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Kaltsiumoksalaatmonohüdraadi kristallidest põhjustatud tsütotoksilisuse proteoomne analüüs distaalsetes neerutuubulirakkudes, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.

[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Escherichia coli pikenemistegur Tu neerukiviga patsientide uriinist eraldatud, soodustab kaltsiumoksalaadi kristallide kasvu ja agregatsiooni, Sci. Vabariik 7 (2017) 2953.

[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Fibronektiini moduleerivad toimed kaltsiumoksalaadi kristalliseerumisele, kasvule, agregatsioonile, adhesioonile neerutuubulite rakkudele ja invasioonile läbi ekstratsellulaarse maatriksi, J. Biol. Inorg. Chem. 24 (2019) 235–246.

[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Agregatsiooniindeksite määratlemine ja süstemaatiline analüüs kaltsiumoksalaadi kristallide agregatsiooniastme hindamiseks, Front. Chem. 5 (2017) 113.

[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum vastutab elujõulise Escherichia coli mõju edendamise eest kaltsiumoksalaadi kristalliseerumisele, kristallide kasvule ja kristallide agregatsioonile, Front. Microbiol 10 (2019) 2507.

[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Erineva suurusega kaltsiumoksalaatmonohüdraadi kristallide diferentsiaalselt seotud valgud ja adhesioonivõimed, Int. J. Biol. Macromol. 163 (2020) 2210–2223.

[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Surface kuumašoki valk 90 toimib potentsiaalse retseptorina kaltsiumoksalaadi kristallidele neerutorukeste epiteelirakkude apikaalsel membraanil, J. Biol. Inorg. Chem. 21 (2016) 463–474.

[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Kaltsiumoksalaadi kristallide mitteradioaktiivne märgistamine kristall-rakkude interaktsiooni ja internaliseerumise uurimiseks, Anal. Methods 2 (2010) 1536–1541.

[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Kaltsiumoksalaatmonohüdraadi kristallid, mis on sisestatud neerutuubulite rakkudesse, lagunevad ja lahustuvad endolüsosoomide poolt, Chem. Biol. Suhelda. 246 (2016) 30–35.

[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Uudne test valkude soodustavate mõjude hindamiseks kaltsiumoksalaadi kristallide invasioonile rakuvälise maatriksi kaudu, mis põhineb plasminogeeni/plasmiini aktiivsusel, Talanta 101 (2012) 240–245.

[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Kaltsiumoksalaadi kristallid suurendasid enolaasi-1 sekretsiooni neerutorukeste rakkudest, mis seejärel suurendas kristallide ja monotsüütide invasiooni neerude vaheseinte kaudu, Sci. Vabariik 6 (2016) 24064.

[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Macropinocytosis on peamine mehhanism kaltsiumoksalaadi kristallide endotsütoosiks neerutuubulirakkudeks, Cell Biochem. Biophys. 67 (2013) 1171–1179.

[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: andmebaasneerudkivi moduleerivad valgud eksperimentaalsete tõenditega, Sci. Vabariik 10 (2020) 15109.

[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, The Effects of Diosmin on aflatoxin-induced maksa- ja neerukahjustus, Environ. Sci. Saasta. Res. Int. 24 (2017) 27931–27941.

[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Kahe ravimi võrdlev biosaadavusdiosmiinravimvormid pärast suukaudset manustamist tervetele vabatahtlikele, Molecules 23 (2018) 2174.

[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Flavanoonglükosiidide farmakokineetika pärast värskelt pressitud apelsinimahla üksikannuste allaneelamist versus kaubanduslikult töödeldud apelsinimahl tervetel inimestel, J. Agric . Food Chem. 62 (2014) 12576–12584.

[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Hüdroksüantrakinooni glükosiididerivaatide süntees võimega lahustada ja pidurdada kaltsiumoksalaadi kristallide teket. Potentsiaalsed ühendid neerukiviteraapias, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 1001–1007.

[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Uuring müoinositoolheksafosfaadil põhinevast kreemist düstroofse kaltsinoosi cutis'e vältimiseks, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022–1025.

[47] V. Thongboonkerd, Proteomics of Crystal-cell Interactions: a model for neeru stone research, Cells 8 (2019) 1076.

[48] ​​CF Verkoelen, Kristallide peetus neerukivitõve korral: glükoosaminoglükaanhüaluronaani oluline roll? J. Am. Soc. Nephrol. 17 (2006) 1673–1687.

[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Kaltsiumoksalaadi kristallide poolt indutseeritud mikrovillakahjustus neerutuubulite epiteelirakkudes ja epigallokatehhiin-3-gallaadi kaitsev roll, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.

[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Desmodium styracifolium kogu flavonoidid nõrgendab hüdroksü- L-proliinist põhjustatud kaltsiumoksalaadi urolitiaas rottidel, Urolithiasis 46 (2018) 231–241.

[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Uriini pH mõjude süstemaatiline hindamine kaltsiumoksalaadi kristalliseerumisele, kristallrakkude adhesioonile ja internaliseerumisele neerutuubulirakkudesse, Sci. Rep. 7 (2017) 1798.

[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Inhibitive Effect on phagocytosis of Candida albicans induced by phagocytosis of Candida albicans induced by phagocytosis of Candida albicans induced by phagocytosis of Candida albicans induced by phagocytosis of Candida albicans induced by phagocytosis of Candida albicans induced by phagocytosis of Candida albicans induced by phagocytosis of Candida albicans induced by quercetin via actin cytoskeleton interference, S. Cui, J. Qian, P. Bo, J. Tradit. Lõug. Med. 33 (2013) 804–809.

[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, kvertsetiin inhibeerib LPS-i poolt indutseeritud makrofaagide migratsiooni, pärssides iNOS/FAK/paksilliini rada ja moduleerides tsütoskeleti, rakuadhesid . Migr. 13 (2019) 1.–12.

[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, Macropinocytosis-mediated membraani taaskasutus juhib närviharjade migratsiooni, edastades F- aktiini lamellipoodiumile, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 117 (2020) 27400–27411.

[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, F-aktiini siduv RapGEF GflB on vajalik efektiivseks makropinotsütoosiks in Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.

[56] A. Khan, Levimus, patofüsioloogilised mehhanismid ja urolitiaasi mõjutavad tegurid, Int. Urol. Nephrol. 50 (2018) 799–806.

[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Inimese neerukivide moodustumise mehhanismid, Urolithiasis 43 (Suppl 1) (2015) 19–32.

[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, mitokondriaalne düsfunktsioon janeerudkivitõbi, Front. Physiol. 11 (2020), 566506.

[59] SR Khan, Kivide moodustumise "fikseeritud osakestega" mudeli histoloogilised aspektid: loomauuringud, Urolithiasis 45 (2017) 75–87.

[60] VY Bird, SR Khan, Kuidas tekivad kivid? Kas kivide moodustumise teooriate ühendamine on võimalik? Arch. Esp. Urol. 70 (2017) 12–27.

[61] JP Kavanagh, Kaltsiumoksalaadi kristalliseerumise uurimise meetodid ja nende rakendamine urolitiaasi uurimisel, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, arutelu 704-5.

[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Kaltsiumoksalaadi kristallisatsioonikineetika inimese ja tehisuriini erinevatel kontsentratsioonidel, konstantse kaltsiumi ja oksalaadi suhtega, Urol. Res. 27 (1999) 231–237.

[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, kristalluuria ja agregatsioon: kivide suurendamise peamised koostisosad, Urol. Res. 36 (2008) 11–15.

[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Neeru pöördprojekteerimine: kaltsiumoksalaadi monohüdraadi kristalliseerumise modelleerimine nefronis, Med. Biol. Eng. Arvuta. 48 (2010) 649–659.

[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, Intrakristallilise ja pinnaga seotud osteopontiini mõju kaltsiumoksalaadi dihüdraadi kristallide kinnitumisele Madin-Darby koera neeru (MDCK) rakkudele ultrafiltreeritud inimese uriinis, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.