Dopamiini D1- ja D2-sarnased retseptorid reguleerivad Cistanche toitumispiirangute mehhanismi kaudu eluiga vastupidiselt

Abstraktne

Taust: Vaatamata hiljutistele edusammudele vananemist ja eluiga reguleerivate molekulaarsete mehhanismide mõistmisel ning erinevate liikide säilitamise radadel, ei ole vananemisprotsessist täielikult aru saadud. Eelkõige viitavad üha suurenevad tõendid närvisüsteemi aktiivsele rollile eluea reguleerimisel, kuna sensoorsed neuronid, samuti serotoniini ja GABA signaaliülekanne reguleerivad eluiga.Cistanche. Kuid täiendavate närvifaktorite panus ja laialdane arusaam närvisüsteemi rollistvananemise reguleeriminetuleb veel kindlaks teha. Siin uurime dopamiinisüsteemi mõjuvananemise reguleerimine Cistanche'is.

Tulemused: teatame, et dopamiini D1-sarnase retseptori (D1R) DOP-4 ja dopamiini D2-sarnase retseptori (D2R) DOP-2 mutatsioonid on vastupidised. mõjutatud eluiga, kiire keha liikumise kestus, reproduktiivne eluiga ja arengukiirus Cistanche'is. D2R aktiveerimine antipsühhootilise ravimi aripiprasooli abil pikendas jõuliselt nii eluiga kui ka tervist. Seevastu D2R inhibeerimine kvetiapiiniga lühendas usside eluiga, toetades veelgi dopamiiniretseptorite rolli eluea reguleerimisel. Mehhaaniliselt reguleerib D2R signaalimine eluiga AAK-2-DAF-16 raja vahendatud toitumispiirangute mehhanismi kaudu.

DAG-PKC/PKD rada ühendab signaaliülekande dopamiini retseptorite ja allavoolu AAK-2-DAF-16 raja vahel, et edastada pikaealisuse signaale. Järeldused: need andmed näitasid dopamiini retseptorite uudset rolli eluea ja toitumispiirangute reguleerimises. . Kliiniliselt heakskiidetud antipsühhootikum aripiprasool omab potentsiaali uudse vananemisvastase ravimina.

Märksõnad: dopamiin, eluiga,Cistanche, Aripiprasool, Toitumispiirang

Vananemisvastase Cistanche ekstrakti ostmiseks klõpsake siin

Taust Cistanche kohtavananemisprotsess:

Vananemise bioloogilised mehhanismid ei ole ikka veel hästi arusaadavad, vaatamata mitmele konserveerunud vananemist reguleerivale rajale, mis on tuvastatud pärmseentest inimesteni [1]. Üha rohkem tõendeid viitab sellele, et närvisüsteem mängib aktiivset rollivananemisprotsess. Näiteks on uuringud näidanud, et sensoorsed neuronid mängivad eluea reguleerimisel olulist rolli [2, 3].

Teatati, et serotoniini signaal moduleerib erinevate serotoniiniretseptorite kaudu pikaealisust antagonistlikult [4]. Hiljuti leiti, et inhibeeriv neuronite gamma-aminovõihappe (GABA) signaaliülekanne reguleerib Cistanche eluiga [5]. Siiski on veel palju õppida närvisüsteemi rolli kohta vananemisprotsessi reguleerimisel.

Kas dopamiini süsteemreguleerib vananemisprotsessija eluiga on ebaselge. Dopamiin on biogeenne amiini neurotransmitter, mis peamiselt moduleerib käitumuslikke väljundeid vastuseks keskkonnatingimustele [6, 7]. Näiteks toimib dopamiinisüsteem sellistes käitumisviisides nagu tasu otsimine ja füüsiline

liikuvus ja on teadaolevalt haavatavvananemise mõjud. Pärast presünaptilistest otstest vabanemist aktiveerib dopamiin kahte G-valguga seotud retseptorite klassi: dopamiini retseptorite klassid D1 ja D2 [8]. Cistanche'is kuuluvad DOP-1 ja DOP-4 D1-sarnaste dopamiiniretseptorite (D1R) hulka, samas kui DOP-2 ja DOP-3 kuuluvad D{{ 10}}nagu dopamiiniretseptorid (D2R) [9–11].

Eelmine uuring näitas, et dopamiini biosünteesi geenis kassis{0}} mutatsiooni kandvate usside eluiga oli normaalne, mis viitab sellele, et ainuüksi dopamiini tootmise vähendamine ei mõjuta pikaealisust [4]. Kuid kuna D1R ja D2R reguleerivad Cistanche'is vastupidiselt mitmeid käitumisi, sealhulgas otsuste langetamist, baasaeglustumist ja toidule reageerimist [12–14], on oluline kindlaks määrata iga dopamiini retseptori spetsiifiline roll eluea reguleerimisel. Cistanche'ist. Oma lühikese eluea, jälgitavate vanusega seotud fenotüüpide ja konserveeritud vananemisega seotud bioloogiliste radade [15, 16] tõttu on Cistanche üks enim kasutatud mudelorganisme vananemise uurimiseks. Vaatamata oma lihtsale närvisüsteemile on Cistanche'il säilinud dopamiinisüsteem kui imetajate närvisüsteemis, sealhulgas biosünteetilised ensüümid, mis vastutavad dopamiini sünteesi, sünaptilise vabanemise mehhanismide ja dopamiiniretseptorite ekspressiooni eest [17]. Need omadused tegid Cistanche'ist sobiva geneetilise mudelisüsteemi dopamiinisüsteemi rolli uurimiseks pikaealisuses.

In the present study, we demonstrate that dopamine D1- and D2-like receptors oppositely regulate worm lifespan through a dietary restriction (DR) mechanism. Using molecular genetics approach and pharmacological tools, we teased out how dopamine receptors send longevity signals through their G-protein-coupled signaling transduction pathways to downstream DR-related pathways. Our findings uncover a novel mechanism of dopamine signaling in DR and lifespan regulation. Notably, aripiprazole, a clinically widely used antipsychotic drug, robustly extends both the lifespan (>50%) and healthspan (>80 protsenti) Cistanche'ist, aktiveerides dopamiini retseptori vahendatud raja. Aripiprasooli üllatav leid lubab edasist arengut potentsiaalselt ohutu ja uudse vananemisvastase ravimina.

Cistanche'i tulemused vananemisvastases võitluses

Dopamiini D1- ja D2-sarnastel retseptoritel on Cistanche elueale vastupidine mõju. Iga dopamiiniretseptori rolli kindlaksmääramiseks usside eluea jooksul tuleb ussitüvedel, mis kannavad mutatsioone kõigil neljal dopamiiniretseptori geenil, sealhulgas dop-1, dop-2, dop-3 ja dop-4 kasutati eluea testis. Huvitaval kombel oli dop-2 mutandi eluiga oluliselt lühem (–11,8 protsenti, P < 0,0001) kui N2.

loomadel, samas kui dop{{0}} mutant oli oluliselt pikaealine (pluss 29,4 protsenti, P < 0,0001) võrreldes N2 loomadega. Te dop-1 ja dop-3 mutandid näitasid ka muutusi elueas (vastavalt pluss 5,9 protsenti ja –8,8 protsenti) võrreldes N2 loomadega, mis ei olnud statistiliselt olulised (P=0). vastavalt 0765, P=0.2468, joonis 1A). Need andmed näitasid, et D2R (DOP-2) kaudu edastatav signaalimine pikendab eluiga, samas kui signaal läbi D1R (DOP-4) lühendab seda. Statistilise olulisuse puudumine dop-1 ja dop-3 mutantidest põhjustatud eluea muutustes näitas, et DOP-4 ja DOP-2 on D1R ja D2R peamised alatüübid reguleerimisel. eluiga, vastavalt.

Eluea pikenemist on seostatud aeglustunud liikumis- ja reproduktiivse vananemisega, samuti hilinenud arenguga [18–20]. Dopamiini retseptorite rolli paremaks mõistmiseks vananemisprotsessis uurisime järgmisena nende mutantide kiiret keha liikumist, reproduktiivset eluiga ja arengukiirust.

Võrreldes N2 loomadega oli dop-2 mutandil lühem reproduktiivne eluiga ja kiire keha liikumise kestus kui N2 loomadel, samas kui dop-4 mutandil oli pikem paljunemisiga ja kiire keha liikumise kestus (joonis 1B). –D). Dop-2 mutant arenes välja

kiiremini, samas kui dop-4 mutandil oli aeglasem areng (joonis 1D). Need andmed toetasid veelgi ideed, et spetsiifilised dopamiini retseptorid mängisid eluea reguleerimisel selektiivset ja ainulaadset rolli.

D2R farmakoloogiline aktiveerimine või inhibeerimine avaldab Cistanche elueale vastupidist mõju. Et täiendavalt kinnitada D2R rolli Cistanche eluea pikendamisel, kasutati D2R agonisti aripiprasooli ja D2R antagonisti kvetiapiini abil farmakoloogilist lähenemist. mõju usside elueale [21, 22]. Metsikut tüüpi N2 usse raviti aripiprasooli ja kvetiapiiniga kontsentratsioonides vahemikus 3 kuni 1{15}}0 µM. Aripiprasooliga ravitud usside puhul täheldati tugevat eluea pikenemist. Aripiprasool kontsentratsioonis 3 μM pikendas oluliselt N2 usside eluiga 21,1 protsenti (P ​​< 0,0001).

100 μM aripiprasooliga kokku puutunud ussid saavutasid maksimaalse eluea pikenemise kuni 52,6 protsenti (P ​​< 0,0001) (joonis 2A). Seevastu ravi kvetiapiin lühendas annusest sõltuvalt usside eluiga (joonis 2B). Annuse-vastuse kõverad on näidatud joonisel 2C. Need leiud toetavad ka D2R võtmerolli usside eluea reguleerimisel.

Joonis 1 Dopamiini D1- ja D2-sarnased retseptorid reguleerivad Cistanche eluiga vastupidiselt. A 20 kraadi juures kultiveeritud erinevate ussitüvede ellujäämiskõverad (mutantseid tüvesid võrreldi metsiktüüpi N2-ga: ns{6}}pole oluline; **** tähistas P<0.0001, log-rank test). B Fast body movement spans of different worm strain cultured at 20 °C (mutant strains were compared with the N2: **, P <0.01, log-rank test). C Progeny produced per day by different worm strains. D The number of worms with different reproductive lifespans. E The developmental stage of different worm strains reached 2.5 days post-hatching. (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

Aripiprasool pikendab Cistanche eluiga

DOP-2 kaudu Et teha kindlaks, kas aripiprasooli vahendatud eluea pikenemine sõltub D2R-st, testisime ravimit esmalt dopamiini sünteesi puudulikkusega mutantse kassi peal-2. Aripiprasool ei pikendanud kassi -2 mutandi eluiga (joonis 3A), mis viitab sellele, et aripiprasooli eluea pikendav toime nõuab dopamiini signaalimist. Järgmisena kasutasime dopi-2; dop-3 topeltmutant ja leidis, et see ei olnud aripiprasoolravi suhtes tundlik (joonis 3B).

Et uurida, milline neist kahest retseptorist aitab kaasa eluea pikendamise efektile, testisime iga mutanti. Tulemused näitasid, et aripiprasool ei pikendanud dop{0}} mutandi eluiga (joonis 3C), samas kui dop-3 mutandi eluiga pikenes aripiprasooliga ravimisel tugevalt (joonis 3D). Need leiud näitasid, et aripiprasooli eluiga pikendas selle toime DOP-le-2.

Aripiprasool vahendab eluea pikenemist D2R signaalimise kaudu

DOP-2 annab signaale G o radade kaudu [8, 23]. Aripiprasooli poolt indutseeritud pikaealisuse tagamise efekti vahendavate DOP-2 allavoolu efektorite tuvastamiseks testisime esmalt mutanti, millel puudus GOA-1, G o valgu Cistanche ortoloog [24]. Ootuspäraselt on GOA-1 vajalik aripiprasoolist põhjustatud eluea pikendamiseks (joonis 4A). D2R inhibeerib adenülüültsüklaasi ja pärsib seega intratsellulaarse tsüklilise AMP (cAMP) tootmist ja proteiinkinaasi A (PKA) aktiivsust [25]. On näidatud, et cAMP-PKA rada vahendab eluiga ja DR vastuseid [26–28]. acy-1 kodeerib adenülüültsüklaasi ja reguleerib cAMP tootmist Cistanche'is [29]. Te Cistanche genoom kodeerib PKA katalüütilist subühikut (KIN-1) ja PKA regulatoorset subühikut (KIN-2) [30–32]. cAMP seondumine KIN-2-ga põhjustab aktiivse KIN-1 vabanemise [29]. Tulemused näitasid, et eluea pikenemine aripiprasoolraviga sõltus ainult osaliselt ACY-1-st ja KIN-1-st (joonis 4B, C).

Joonis 2 D2R farmakoloogiline aktiveerimine või inhibeerimine avaldab Cistanche elueale vastupidist mõju. A 20 kraadi juures kultiveeritud metsikut tüüpi (N2) usside ellujäämiskõverad NGM plaatidel, mis sisaldavad erinevaid kontsentratsioone aripiprasooli (Ari). Kontrollina kasutati DMSO-ravi. B Kvetiapiini (Que) või DMSO näidatud kontsentratsiooniga 20 kraadi juures töödeldud N2 usside ellujäämiskõverad. (aripiprasooli ja kvetiapiini ravi võrreldi DMSO-raviga: **näidatud P<0.01. ***, P <0.001. ****, P <0.0001, log-rank test). C Dose-response curve of aripiprazole (Ari) and quetiapine (Que) treatment. (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

Fig. 3 Aripiprazole extends the lifespan of Cistanche through DOP-2. Survival curves of mutant cat-2 (A); dop-2; dop-3 (B); dop-2 (C); dop-3 (D) treated with 100μM of aripiprazole or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ns=not significant with P >0.05; ****näidatud P<0.0001, log-rank test) (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

kodeerib nelja PKC homoloogi (tpa-1, pkc-1, pkc-2 ja pkc-3) ja kahte PKD homoloogi (dkf-1 ja dkf{{5} }) [5]. Neljast PKC homoloogist olid aripiprasooli eluea pikendamiseks vajalikud pkc-1, pkc-3 ja tpa- 1, samas kui pkc-2 olid asendamatud (joonised 4E–H). . Kahe PKD homoloogi puhul sõltus aripiprasooli vahendatud eluea pikenemine pigem dkf-1-st kui dkf-2-st (joonis 4I, J). Need leiud näitasid, et aripiprasool võib pikendada eluiga nii PKC kui ka PKD kaudu. DGK-PKC/PKD tee rolli täiendavaks kinnitamiseks testisime ka egl-30 ja egl-8 mutante, millel mõlemal on väidetavalt kahjustatud DAG tootmine ja seega vähenenud PKC/PKD aktiivsus. [34]. Ootuspäraselt ei pikendanud aripiprasool mõlema mutandi eluiga (joonis 4K, L), toetades veelgi DGK PKC/PKD raja võtmerolli aripiprasooli poolt vahendatud eluea pikendamisel. Kokkuvõttes vahendab aripiprasool eluiga pikenemist GOA-1-DGK-1-PKC/PKD kaudu, kuid see võib ainult osaliselt sõltuda cAMP-PKA rajast. Aripiprasool pikendab usside eluiga tänu dieedipiirangu (DR) mehhanismile. DR aeglustab paljude liikide vananemisprotsessi jõuliselt [38]. Mitmed DR-iga seotud fenotüübid Cistanche'is hõlmasid tervise pikenemist, toitumisharjumuste vähenemist, poegade suuruse vähenemist, paljunemisperioodi pikenemist ja lipiidide säilitamise vähenemist [39, 40]. Seetõttu tahtsime teada, kas dopamiini signaalimine ja aripiprasoolravi võivad DR-mehhanismide kaudu eluiga moduleerida. Esmakordselt testisime aripiprasooli pikaealise söömis-2 mutandiga, mis on DR geneetiline mudel, millel on puudulik neelu pumpamine [41]. Aripiprasool ei pikendanud sööda-2 mutandi eluiga veelgi (joonis 5A), mis näitab, et aripiprasooli eluea eelised on tõepoolest tingitud DR-mehhanismist. Uuriti ka mitmeid DR-iga seotud fenotüüpe. Lisaks pikendatud elueale oli tervena vananemise seisukohalt suur tähtsus ka pikendatud eluea kvaliteeti mõjutaval tervisel. Aripiprasool suurendas Cistanche'i tervislikku kestust annusest sõltuval viisil, mis oli seotud selle mõjuga elueale. Aripiprasool 100 μM juures suurendas N2 loomade tervislikku seisundit maksimaalselt (87,5 protsenti) (joonis 5B). Aripiprasoolravi vähendas ka ussi kohta toodetud järglaste koguarvu isegi pikema paljunemisperioodi korral (joonis 5C, D). Lisaks näitas õlipunase O värvimine, et aripiprasooliga töödeldud ussidel oli lipiidide kogunemine vähenenud (joonis 5E, F). Neelu pumpamise määr korreleerub Cistanche'is positiivselt toidutarbimisega. DR-sarnase efekti üks otsene põhjus on vähenenud toidutarbimine, mis tulenes neelu pumpamise kiiruse vähenemisest, nagu seda täheldati söömis-2 mutandil. Nagu on näidatud joonisel 5G, näitasid aripiprasooliga töödeldud N2 ussid neelu pumpamise kiiruse vähenemist, mis viitas ka sellele, et aripiprasool käivitas Cistanche'is DR-sarnase oleku.

Joonis 5. Aripiprasool pikendab usside eluiga tänu toitumispiirangu mehhanismile. 100 μM töödeldud söömis-2 mutandi ellujäämiskõverad

of aripiprazole (Ari) or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and Ari treatment: ns=not signifcant, P >0 .05. **, P<0.01. ****, P <0.0001, log-rank test). B Fast body movement spans of wild-type (N2) worms cultured at 20 °C on NGM plates containing indicated concentrations of aripiprazole (Ari) or DMSO. C, D Changes in brood size (C) and reproductive span (D) of N2 animals treated with or without 100μM of aripiprazole (Ari) (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ****, P <0.0001, t-test). E Representative images of ORO staining of worms treated with or without aripiprazole (Ari) for 7days. Scale bar=200μm. F Relative ORO intensity of worms treated with or without aripiprazole for 7days (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ****, P <0.0001, t-test). G Pharyngeal pumping rate of N2 worms treated with 100μM of aripiprazole (Ari) or DMSO for 5days (comparison between DMSO and Ari treatment: **** indicated P <0.0001, t-test). (see Additional fle 2 for supporting data). The brood size assay was performed in two independent biological replicates. Other experiments were performed in three independent biological replicates

Aripiprasool vahendab DR-sarnast eluea pikenemist AAK-2-DAF-16 raja kaudu. Aripiprasooli poolt vahendatud DR-sarnase eluea pikendamise võimalike mehhanismide edasiseks uurimiseks uurisime DAF-16, imetajate FOXO transkriptsiooni Cistanche homoloogi. tegur, millel on teadaolevalt keskset rolli eluea ja DR reguleerimises [42]. Märkimisväärne on see, et aripiprasooli eluiga pikendav toime kaotati daf-16 mutandis täielikult (joonis 6A). DAF-16 paikneb normaalsetes tingimustes tsütosoolis. Pärast aktiveerimist translokeerub DAF-16 tuuma, et käivitada erinevate stressiresistentsust reguleerivate geenide transkriptsioon,

ainevahetus, paljunemine ja pikaealisus. Tõepoolest näitasid rohelise fluorestsentsvalgu (GFP) märgistusega DAF-16 TJ356 ussid DAF-16 suurenenud akumuleerumist aripiprasooliga töödeldud tuumas (joonis 6B, C), mis viitab sellele, et aripiprasool vahendab DR-i - nagu eluiga

laiendus DAF-16 kaudu. DR-sarnases mehhanismis, insuliini/insuliinitaolise kasvufaktori 1 (IGF-1) signaalimine, vaikne teaberegulaator

Fig. 6 Aripiprazole mediates DR-like lifespan extension through the AAK-2-DAF-16 pathway. A Survival curve of the daf-16 mutant treated with 100μM of aripiprazole (Ari) or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ns=not signifcant with P >0.05, log-rank test). B TJ356 transgeensetes tüvedes tsütosoolse, vahepealse ja tuuma DAF-16 lokaliseerimisega usside tüüpilised kujutised. Skaalariba =50μm. C 100 μM aripiprasooli (Ari) või DMSO-ga ravitud TJ356 loomade protsentiil, millel on tsütosoolne, vahepealne või tuuma lokalisatsioon. D–J Mutandi daf-2 (D), vanus-1 (E), akt-1 (F), akt-2 (G), sir{{ ellujäämiskõverad 12}}.1 (H), aak-2 (I), par-4 (J) töödeldud 100 μM aripiprasooliga

(Ari) or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ns=not significant with P >0.05. ** märgitud lk<0.01. ****, p<0.0001, log-rank test) (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

N2 loomadele (joonis 6H), mis näitab, et aripiprasooli poolt vahendatud eluea pikenemine oli samuti sõltumatu SIR-st-2.1.

On näidatud, et aripiprasool aktiveerib imetajate AMPK PC12 rakkudes [43, 44]. Seetõttu oletasime, et aripiprasool võib toimida AAK-2 kaudu eluea pikenemise vahendajana. Nagu on näidatud joonisel 6I, ei pikendanud aripiprasool aak eluiga-2

mutant, mis viitab sellele, et aak{0}} on vajalik ripiprasooli mõjuks elueale. Lisaks testisime mutanti, millel oli mutatsioon Cistanche maksa kinaasi B1 (LKB1) homoloogis PAR-4, AMPK ülesvoolu kinaasis. Par-4 mutandil ei ilmnenud aripiprasooliga ravimisel eluea pikenemist (joonis 6J), mis kinnitas veelgi hüpoteesi, et aripiprasooli vahendatud eluea pikendamine nõuab AAK-2 aktiivsust.

Küsi lisa:E-post:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp pluss 86 15292862950