DNA-st sõltuv proteiinkinaasi katalüütiline alaühik (DNA-PKcs) soodustab kroonilise neeruhaiguse progresseerumist isastel hiirtel Ⅱ

TAF7 DNA-PKcs-vahendatud fosforüülimine süvendab neerufibroosi

Võimalike molekulaarsete mehhanismide edasiseks lahkamiseks, mille abil DNA PKcs reguleerivadkroonilise neeruhaiguse areng, viidi läbi fosfoproteoomika, et paljastada DNA-PKcs võimalikud substraadid. Nagu on näidatud joonisel fig 5a, olid enamus erinevalt fosforüülitud valkudest tuumavalgud. Thefosforüülimise tasemednendest valkudest oli ainult 6 valkuoluliselt vähenenud neerukudedesDNA-PKcs-/- hiirtel võrreldes WT hiirtega, nagu on näidatud vulkaani graafikutel (joonis 5a). DNA-PKcs-/- hiirte ja WT-kontrollide vahelise erinevalt fosforüülitud valkude soojuskaardi analüüs näitas, et Slc4a1, Ampd2, Hbb-b1, Gas2, Ank1 ja TAF7 näidatud saitide fosforüülimise tasemed langesid pärast DNA-PK väljalülitamist märkimisväärselt (joonis 1). 5a). Nende valkude subtsellulaarse lokaliseerimise analüüsi ja hävitamise abil leidsime, et DNA-PKcs vahendab neerufibroosi, võib-olla TAF7 fosforüülimise kaudu, mis on TFIID alaühik. Koimmunosadestamise uuringud näitasid võimalikku otsest koostoimet DNA-PKcs ja TAF7 vahel (joonis 5b). DNA-PKcs ja TAF7 vahelist valgu-valgu dokkimist analüüsiti veebipõhise andmebaasi ClusPro39,40 kaudu. Dokkimistulemused näitasid võimalikku otsest interaktsiooni DNA-PKcs ja TAF7 vahel ning TAF7 213-saidi seriin on üks lähimaid saite, mis võib-olla seostub DNA-PKcs-ga (täiendav joonis 6a). Viidi läbi in vitro kinaasi test, et analüüsida, kas TAF7 fosforüüliti otse DNA-PKcs-ga. Kinaasi testi saadusi analüüsiti massispektromeetria abil. Tulemused näitasid, et inimese TAF7 saidid S213, T137, Y24 ja S171 fosforüüliti DNA-PKcs abil (täiendav joonis 6b). Lisaks näitasid meie tulemused positiivset seost inimese p-DNA-PKcs ja TAF7 valgutasemete vahelCKD neerkudesid p DNA-PKcs immunofluorestsents-koosvärvimise teel TAF7-ga (joonis 5c).

KLÕPSA SIIA, ET TEADA TEADA TAIMSETE VALMISTEGA NEERUSTE KASUTAMINE

Eelmises uuringus leiti, et TAF7 arvutatud molekulmass on umbes 40 kDa, kuid fosforüülitud TAF7 on umbes 55 kDa41. Western blot ja immunohistokeemilise värvimise tulemused näitasid, et UUO indutseeris oluliselt TAF7 taset WT kontrollide neerukudedes (joonis 5d ja täiendav joonis 6d). DNA-PKcs knockout inhibeeris TAF7 fosforüülimist nii algtaseme kui ka UUO mudelites võrreldes WT kontrollidega (joonis 5d). TAF7 fosforüülimist UUO hiirtel kinnitas ka Phos-tag SDS-PAGE42 (täiendav joonis 6c). Sarnaseid tulemusi täheldati ka UIR mudeli puhul (joonis 5e). Ravi DNA-PKcs inhibiitoriga NU7441 inhibeeris ka hiirtel UIR poolt indutseeritud TAF7 ülesreguleeritud fosforüülimist (joonis 5f). Lisaks näitasid Western blot meetodil analüüsitud TAF7 valgutasemed, et nii DNA-PKcs katkes HK-2 rakkudes (joonis 5g) kui ka töötlemine NU7441-ga HK2 (joonis 5h) või NRF-49F rakkudes. (joonis 5i) inhibeeris TGF 1 poolt indutseeritud TAF7 ülesreguleeritud fosforüülimist in vitro.

Kuna DNA-PKcs osaleb TAF7 fosforüülimises neerufibroosi korral, uurisime, kas TAF7 puudulikkus võib mõjutada neeruepiteelirakkude dediferentseerumist või TGF 1 poolt indutseeritud interstitsiaalsete fibroblastide aktivatsiooni ja proliferatsiooni. TAF7 knockout mPTC rakud ja NRK{{5 }}F-rakud genereeriti CRISPR/Cas9 abil ja TAF7 knockout-rakkude edukat ehitamist kinnitas Western blot (täiendav joonis 6e). Meie tulemused näitasid, et TAF7 knockout parandas neerude epiteelirakkude dediferentseerumist, nagu näitab madal FN ja kollageeni I produktsiooni tase pärast kokkupuudet TGF 1-ga (joonis 5j, l). Samamoodi tuhmistas TAF7 väljatõrjumine TGF 1 poolt indutseeritud NRF-49F-rakkude profibrootilise fenotüübi, mida näitab FN (joonis 5k), kollageeni I (joonis 5m), -SMA (joonis 5n) madal tootmine. ), samuti madalad EdU värvimise tasemed (joonis 5o) TAF7-/- rakkudes. Et teha kindlaks, kas TAF7 üleekspressioon neeruepiteelirakkudes on piisav profibrootilise fenotüübi juhtimiseks, transfekteeriti HK-2 rakud või NRK49F rakud inimese TAF7 või selle mutandi üleekspressiooniplasmiididega. Western blot tulemused näitasid, et HK-2 või NRF49F rakkude profibrootilist fenotüüpi võimendas tõepoolest TAF7 või selle mutantide üleekspressioon (täiendav joonis 6h, j). Kuid TAF7 profibrootilised toimed blokeeriti peaaegu täielikult DNA-PKcs väljalangemisega HK-2 rakkudes (täiendav joonis 6i). Lisaks uurisime, kas TAF7 puudulikkus võib mõjutada DNA-PKcs profibrootilist toimet. Huvitaval kombel pärssis TAF7 defitsiit DNA-PKcs üleekspressiooni profibrootilist toimet (täiendav joonis 6f) ja blokeeris NU7441 profibrootilise toime mPTC rakkudes (täiendav joonis 6g). Hiljuti Wang S et al. leitud tsütoplasmaatilist DNA-PKcs-d suurendati ja interakteerusid Fis1-ga ning fosforüüliti selle TQ-motiivis Thr34 juures, mis suurendas Fis1 afiinsust Drp1 suhtes ja kutsus esile mitokondriaalse fragmentatsiooni AKI43-s. Meie uuringus näitasid tuuma ekstraheerimise valgu analüüsi tulemused, et DNA-PKcs oli peamiselt lokaliseeritud ja suurenenud UUO hiirte neerude tuumas, mis erines AKI mudelist (täiendav joonis 6k). Ja Fis1 mahalöömine soodustas TGF 1-ga nakatatud neerutuubulite epiteelirakkude profibrootilist vastust, mis viitab sellele, et Fis1 ei vahendanud DNA-PKcs profibrootilist rolli kroonilise neeruhaiguse korral (täiendav joonis 6l). Kokkuvõttes näitasid need andmed, et TAF7 DNA-PK vahendatud fosforüülimine süvendab neerufibroosi.

TAF7 soodustab mTORC1 aktiveerimist, reguleerides RAPTORi ekspressiooni üles

TAF7 profibrootilise toime mehhanismide uurimiseks viidi läbi RNA-Seq, et analüüsida transkriptoomilisi muutusi NC ja TAF−/− mPTC rakkudes, mida oli töödeldud TGF 1-ga või ilma. RNA-Seq tulemused näitasid, et TAF7 knockout parandas TGF-i {{5} } indutseeritud fibroosiga seotud geeniekspressioon mPTC-des (täiendav joonis 7a, b). KEGG raja rikastamise analüüs näitas, et mTOR signaalirada oli TAF-/- ja NC mPTC rakkude vahel ilma TGF 1-ga töötlemata (joonis 6a). Geenikomplekti rikastamise analüüs (GSEA) näitas pärast TGF 1-ga töötlemist mTOR signaaliraja olulist ülesreguleerimist, mis vähenes oluliselt pärast TAF7 väljalülitamist mPTC rakkudes võrreldes NC kontrollrakkudega (joonis 6a). mTOR signaalimise soojuskaardi analüüs näitas, et mTORC144,45 positiivne regulaator RPTOR (RAPTOR) suurenes töötlemisel TGF 1-ga, mida inhibeeris TAF7 väljatõrjumine mPTC rakkudes (joonis 6b).

RPTOR valgu tase ja mTOR fosforüülimine tõusid mõlemad pärast töötlemist TGF 1-ga mPTC rakkudes märkimisväärselt, analüüsides Western blot analüüsiga. Siiski vähendas TAF7 defitsiit RPTOR valgu taset ja TGF 1 poolt indutseeritud mTOR fosforüülimist mPTC rakkudes võrreldes NC kontrollidega (joonis 6c). MTOR-i ja selle valgupartnerite, sealhulgas Raptori, Rictori ja Mlst8 MRNA tasemeid analüüsiti qRT-PCR abil ning tulemused näitasid, et ravi TGF 1-ga reguleeris üles Rptori, Rictori ja Mlst8 mRNA tasemeid, kuid mitte mTOR-i. TAF7 puudulikkus vähendas oluliselt Raptori mRNA taset nii TGF 1-ga kui ka ilma ravita mPTC rakkudes võrreldes NC kontrollrakkudega, kuid mitte Rictori, Mlst8 või mTOR-ga (täiendav joonis 7c). Samamoodi vähendas DNA-PKcs puudulikkus või inhibeerimine oluliselt mRNA tasetRaptoriini neerukudedUUO hiirtel ja UIR hiirtel (täiendav joonis 7d, e). Lisaks konstrueerisime TAF7, TAF7- S213D ja TAF7-S213A kaks erinevat jäägist 213 seriini saidi mutanti, et analüüsida TAF7 seriini 213 fosforüülimist TGF 1 poolt indutseeritud inimese Raptori transkriptsioonilisel aktiveerimisel. HK-2 lahtrid. Lutsiferaasi testi tulemused näitasid, et kõigi nende TAF7 mutantide üleekspressioon suurendas inimese Raptori transkriptsioonilist aktivatsiooni, kuigi TAF7- S213A rühma suhteline lutsiferaasi aktiivsus oli madalam kui TAF7-WT ja TAF{ omast. {15}}S213D rühmad (joonis 6d). Lisaks näitasid ChIP testi tulemused, et TAF7 võib seostuda otse Rptori promootoriga (joonis 6e). Need tulemused näitasid, et TAF7 vahendab TGF 1 poolt indutseeritud RPTOR-i transkriptsioonilist aktivatsiooni, võib-olla mitte ainult jäägi 213 fosforüülimise kaudu. Lisaks näitasid meie tulemused, et RPTOR-i valgu tase ja mTOR-i fosforüülimine olid mõlemad.suurenenud neerukudedesUUO ja UIR hiirtel ning need vähenesid oluliselt pärast DNA-PKcs väljalangemist nii algtaseme kui ka mudelhiirtel (joonis 6f–i). Sarnaseid tulemusi täheldati ka vastusena DNA-PKcs knockout HK-2 rakkudele ja NU7441 ravile NRF-49F rakkudes (joonis 6j, k). Lisaks näitasid Western blot'i tulemused, et RPTOR-i valgu tase ja mTOR-i fosforüülimine tõusid pärast DNA-PKcs või TAF7 üleekspressiooni (täiendav joonis 7f, g). Lisaks pärssis RPTOR-i katkestamine märkimisväärselt TGF 1 poolt indutseeritud mTOR-i fosforüülimist (täiendav joonis 7h). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et TAF7 DNA-PKcs-vahendatud fosforüülimine soodustab mTORC1 aktivatsiooni, reguleerides RPTOR ekspressiooni üles.

Joonis 6|TAF7 DNA-PKcs-vahendatud fosforüülimine soodustab mTORC1 aktivatsiooni, suurendades RPTOR ekspressiooni. RNA-seq, mis näitab, et mTOR-i signaalimine (tähistatud punase kirjaga) oli TAF7-/- ja NC-rühmade vahel kõige erinevamalt väljendatud signaalitegur. GSEA näitas, et mTOR signaaliülekanne oli NC + TGF 1 rühmas ülesreguleeritud ja TAF7−/− + TGF 1 rühmas (n=2), TGF 1 (5 ng/ml) 24 tunni jooksul pärsitud. b Kuumakaardi pilt, mis näitab, et Rptor (tähistatud punase kirjaga) vähenes TAF7−/− rühmades võrreldes NC rühmadega, kas TGF 1-ga (5 ng/ml) või ilma selleta 24 tunni jooksul (n=2 igast). Grupp). c RPTOR, mTOR ja fosforüülitud mTOR valgu taset analüüsiti Western blot meetodil TAF7−/− ja NC mPTC-des, mida töödeldi TGF 1-ga (5 ng/ml) 24 tundi. Tulbad tähistavad kvantifitseerimise tulemusi (keskmine ± SD, n=3 sõltumatut katset). d Lutsiferaasi reporteri test HK-2 rakkudes TGF 1-ga (5 ng/ml) 24 tundi. Tulbad tähistavad 3 sõltumatu katse tulemusi (keskmine ± SD). ChIP test viidi läbi, et analüüsida TAF7 seondumist Raptori promootoriga. Tulbad tähistavad kvantifitseerimise tulemusi (keskmine ± SD, n=3 sõltumatut katset). f RPTOR, mTOR ja fosforüülitud mTOR valgu taset analüüsiti Western blot meetodil.neerukudedDNA PKcs−/− ja WT kontrollhiirtest, kellele tehti UUO (7. päev) või UIR (21. päev) (g), NU7441 (40 mg/kg) ja vehiikliga töödeldud hiirtest, kellele tehti UUO (h) või UIR (i), DNA PKcs−/− või NC HK-2 rakkudes (j), NU7441 (0,1 μM) või vehiikuliga töödeldud NRK-49F rakkudes (k), mida on töödeldud TGF 1-ga (5 ng) /ml) 24 tundi. Tulbad tähistavad kvantifitseerimise tulemusi (keskmine ± SD, n=6 hiirt igas rühmas ja n=3 sõltumatut katset rakumudelite jaoks). P-väärtuste määramiseks d, e. c, f–k p-väärtuste määramiseks kasutati kahesuunalisi ANOVA-sid, millele järgnes Šídáki mitmekordse võrdluse test. Lähteandmed esitatakse lähteandmete failina.

DNA-PK inhibeerimine korrigeerib metaboolset ümberprogrammeerimist in vivo ja in vitro

Mitmete varasemate uuringute 9,46 kohaselt soodustab mTORC1 ebanormaalne aktiveerimine neerufibroosi progresseerumist, vahendades metaboolset ümberprogrammeerimistfibrootilised neerud. Seega uurisime, kas DNA-PK või TAF7 inhibeerimine korrigeerib fibrootiliste neerude metaboolset ümberprogrammeerimist. Tuginedes TGF 1--ga töödeldud NC ja TAF−/− mPTC rakkude transkriptoomiliste muutuste RNA-Seq analüüsile, näitas KEGG raja rikastamise analüüs, et metaboolse signaaliülekande rada oli üks kõige erinevamalt ekspresseeritud radu TGF {{4} vahel. }töödeldud TAF-/- ja NC mPTC rakud (joonis 7a). Lisaks näitas GSEA oksüdatiivse fosforüülimise ja rasvhapete oksüdatsiooni (FAO) raja olulist ülesreguleerimist pärast töötlemist TGF 1-ga TAF7 knockout mPTC rakkudes võrreldes NC kontrollrakkudega (joonis 7a). Glükolüüsi rada vähenes oluliselt, kui TAF7 kaotati mPTC-des võrreldes NC-kontrolliga (joonis 7a). Need tulemused näitasid, et TAF7 puudulikkus korrigeerib TGF 1-indutseeritud metaboolset ümberprogrammeerimist PTC rakkudes.

Et mõista DNA-PKcs rolli metaboolse ümberprogrammeerimise reguleerimisel fibrootilistes neerudes. Esiteks analüüsiti Western blot ja qRT-PCR abil rasvhapete oksüdatsioonis osalevate võtmeensüümide (CPT1, CPT2, ACOX1 ja ACOX2) valgu ja mRNA tasemeid. Tulemused näitasid, et nende ensüümide ekspressioon vähenes oluliselt WT hiirte neerudes UUO või UIR tingimustes, kuid nende ekspressioon taastus oluliselt DNA-PKcs knockout hiirtel (joonised 7b, c ja täiendav joonis 8). Teiseks, mitokondriaalne morfoloogia ja funktsioon on vajalikud oksüdatiivseks fosforüülimiseks ning elektronmikroskoopia näitas UUO poolt indutseeritud WT hiirte neerutuubulite rakkudes mitokondrite ilmset killustumist, mis paranes oluliselt DNA-PKcs-/- hiirte neerutuubulite rakkudes (joonis fig. 7f). Need tulemused näitasid, et UUO poolt WT hiirtel indutseeritud ebanormaalset oksüdatiivset fosforüülimist ja rasvhapete metabolismi parandab DNA-PKcs knockout.

Glükolüüs on neerufibroosi tunnuseks ja soodustab neerufibroosi teket. Heksokinaasi 2 (HK2) ja laktaatdehüdrogenaas A (LDHA) valgu taset, mis on glükolüüsi kiirust piiravad ensüümid, analüüsiti Western blot meetodil. Tulemused näitasid, et HK2 ja LDHA tasemed olid UUO hiirte ja UIR hiirte neerukudedes oluliselt ülesreguleeritud, mis näitab suurenenud glükolüütilist aktiivsust fibrootilistes neerudes. Seevastu glükolüüs inhibeeriti oluliselt DNA-PKcs-defitsiidiga hiirte neerukudedes võrreldes WT hiirtega nii UUO kui ka UIR mudelites, mida näitavad madalamad HK2 ja LDHA tasemed (joonis 7d, e). TGF-i 1-töödeldud DNA-PKcs-/-HK-2 rakkudes ja NU7441--ga töödeldud NRK-49F-rakkudes glükolüütilise aktiivsuse analüüsimiseks viidi läbi rakuvälise hapestumise määra (ECAR) testid. in vitro. Nii DNA-PKcs-de väljalülitamine kui ka ravi NU7441-ga vähendasid oluliselt ECAR-i, mis oli TGF-ga töödeldud rakkudes kontrollrakkudega võrreldes ülesreguleeritud (joonis 7g–h). TAF7-/- väljatõrjumine vähendas oluliselt ka ECAR-i ülesreguleerimist TGF 1 poolt indutseeritud mPTC-des (joonis 7i). Lisaks vähenes ka ekstratsellulaarse laktaadi tase DNA-PKcs−/− ja NU7441--ga töödeldud rakkude söötmes (joonis 7j, k).

Et mõista, kuidas metaboolne ümberprogrammeerimine DNA-PKcs-/- hiirtel paranes, kasutasime UUO operatsiooni järgsete metaboliitide muutuste analüüsimiseks metaboolse profiili koostamist (joonis 8a). UUO indutseeris glükoosi metabolismi halvenemist WT hiirte neerudes, mida tõendab glükoosi metaboliitide, nagu püruvaadi, alareguleerimine WT UUO neerudes, mis taastati DNA-PKcs väljatõrjumisega (joonis 8a). Lisaks täheldati ka laktaadi suurenenud akumuleerumist UUO-le allutatud WT hiirte neerudes, mis näitab metaboolset nihet oksüdatiivselt fosforüülimiselt suurenenud glükolüüsile neerurakkudes. Kuid DNA-PKcs-/- hiirte vigastatud neerudes oli glükolüüs oluliselt pärsitud (joonis 8a). Lisaks täheldati WT UUO hiirte neerudes karnitiiniga konjugeeritud pika ahelaga rasvhapete, sealhulgas lauroüülkarnitiini (joonis 8a) ja müristoüülkarnitiini (joonis 8a) akumuleerumist, mis viitab rasvhapete metabolismi defektidele. Seevastu DNA-PKcs knockout parandas suures osas kõik need UUO põhjustatud kõrvalekalded. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et DNA PK või TAF7 inhibeerimine korrigeerib vigastusest või TGF 1-st põhjustatud metaboolset ümberprogrammeerimist in vivo ja in vitro.

Arutelu

Epiteeli dediferentseerumine ning müofibroblastide aktiveerimine ja proliferatsioon, mis on kõik alguse saanud rakukahjustusest, soodustavad CKD2 progresseerumist. Kuigi DNA kahjustuse reaktsioon (DDR) korreleerub sageli neeru epiteeli kahjustusega47, on vähe teada selle võimalikust rollist epiteeli dediferentseerumisel ja müofibroblastide aktiveerimisel progresseeruva kroonilise neeruhaiguse korral. Selles uuringus näitasid meie tulemused, et DNA-st sõltuva proteiinkinaasi katalüütilise subühiku DNA PKcs ekspressioon suurenes fibrootilistes neerudes ja soodustas CKD arengut. Kuigi DNA-PKcs-d aktiveerivad DNA kaheahelalised katkestused (DSB-d) 24, 25 või ROS26, näitasid meie tulemused, et DNA-PKcs-i ekspressiooni aktiveeris ka TGF 1-SMAD signaalimine, samas kui DNA-PKcs-i väljatõrjumine inhibeeris SMAD2/SMAD3 . Need tulemused viitavad uuele võimalikule rajale, mis vahendab TGF 1-SMAD signaali aktiveerimist fibroosi korral.

Järgmisena genereerisime globaalsed prkdc geeni-knockout hiired. Meie tulemused näitasid, et DNA-PKcs kustutamine nõrgendas neerutuubulite kahjustusi ja neerude interstitsiaalse fibroosi progresseerumist nii UUO kui ka UIR hiiremudelites. Me ei saa järeldada, et DNA-PK soodustab lümfotsüütidest sõltumatut neerufibroosi, kuna DNA-PKcs-/- hiirte kõige silmatorkavam fenotüüp on lümfotsüütide puudulikkus 27, 48. Lümfotsüütide puudulikkuse võimaliku mõju välistamiseks konstrueerisime CRISPR / cas9 knock-in hiirte abil in vivo spetsiifilise DNA-PKcs knockoutiga proksimaalse neerutuubulaarse epiteeliraku. Meie tulemused näitasid, et DNA-PKcs neerutuubulite spetsiifiline deletsioon takistas ka neeru interstitsiaalse fibroosi progresseerumist UUO-s. Lisaks näitasid meie tulemused ka, et DNA-PKcs puudulikkus säilitas tubulaarse epiteelirakkude fenotüübi ja reguleeris interstitsiaalset fibroblastide aktivatsiooni in vitro . Need tulemused näitavad, et DNA-PKcs vahendab epiteeli dediferentseerumist ja müofibroblastide aktivatsiooni, tõenäoliselt ilma otsese seoseta lümfotsüütide puudulikkusega. Lisaks uurisime väga spetsiifilise DNA-PKcs inhibiitori NU7441 antifibrootilist toimet ja tulemused näitasid, et ravi NU7441-ga nõrgendas märkimisväärselt neerude interstitsiaalse fibroosi progresseerumist nii UUO kui ka UIR hiiremudelites. NU7441 on DNA-PK osaline inhibiitor füsioloogilistes annustes. Eelmine uuring näitas, et ravi NU7441-ga ei mõjutanud oluliselt B-rakkude funktsiooni täiskasvanud hiirtel33. Lisaks kinnitasime NU7441 spetsiifilist toimet DNA-PKcs-le, töödeldes DNA-PKcs knockout hiiri NU7441-ga UUO hiiremudelis. Need tulemused viitavad NU7441 potentsiaalsele transformatsioonile kroonilise neeruhaiguse kliiniliseks raviks, kuigi on vaja täiendavaid uuringuid.

Meie tulemused näitasid, et DNA-PKcs puudulikkus ei süvendanud DSB-sid in vivo ja in vitro, mis viitab sellele, et DNA-PKcs vahendab neerukahjustust ja neerude interstitsiaalset fibroosi, tõenäoliselt mitte tänu oma rollile DDR-is. Fosfoproteoomika analüüs näitas, et DNA-PKcs-/- hiirte neerukudedes vähenes TAF7 fosforüülimine. TAF7 puudulikkus pärssis TGF 1 poolt indutseeritud neeruepiteelirakkude ja fibroblastide profibrootilist fenotüüpi. TAF7 profibrootilised toimed blokeeris peaaegu täielikult DNA-PKcs puudulikkus neeruepiteelirakkudes. Meie tulemused näitavad, et TAF7 on DNA-PKcs kinaasi aktiivsuse substraat ja et TAF7 DNA-PKcs-vahendatud fosforüülimine süvendab neerufibroosi.

RNA-Seq tulemused näitasid, et TAF7 soodustab mTORC1 aktivatsiooni, reguleerides üles Raptori ekspressiooni, mis on mTORC149,50 positiivne regulaator. Fosfoproteoomi tulemused näitasid, et TAF7 fosforüülimine seriinil -213 oli DNA-PKcs-/- hiirte neerudes oluliselt vähenenud, võrreldes WT kontrollidega. Massispektromeetria analüüs näitas, et inimese TAF7 S213, T137, Y24 ja S171 saidid fosforüüliti DNA-PKcs-ga in vitro. Lisaks suurendas erinevate TAF7 mutantide, sealhulgas TAF7-WT, TAF7-S213D ja TAF7-S213A transfektsioon inimese Rptori transkriptsioonilist aktivatsiooni HK-2 rakkudes. Need tulemused näitavad, et TAF7 vahendab TGF 1 poolt indutseeritud Rptori transkriptsioonilist aktivatsiooni, tõenäoliselt mitte ainult selle 213- saidi fosforüülimise kaudu. TAF7 ei ole põhiline transkriptsioonifaktor, kuid interakteerub teiste TAF-idega, nagu TAF141,51, ja reguleerib transkriptsioonifaktorite ensümaatilisi aktiivsusi, mis võib selgitada, miks TAF7 üleekspressioon üksi ei aktiveerinud inimese RPTOR-i transkriptsiooni HK-s{28} } rakke ilma TGF 1-ga töötlemata. TAF7 mitmeid seriinijääke saab fosforüülida, et aktiveerida või inhibeerida transkriptsiooni41. Näiteks leiti eelmises uuringus, et TAF7 fosforüülimine seriinil 264 häiris TAF7 seondumist TAF1-ga, mille tulemuseks oli tsükliin D141 transkriptsiooniline ülesreguleerimine. Lisaks TAF{37}}sõltuvale transkriptsioonile reguleerib TAF7 ka TAF1-sõltumatut transkriptsiooni51. Selles uuringus näitasid ChIP testi tulemused, et TAF7 võib seostuda otse Rptori promootoriga, mis viitab sellele, et TAF7 võib Rptori ekspressiooni algatamiseks teha koostööd teiste transkriptsioonifaktoritega. Kuigi TAF{43}}vahendatud Rptori transkriptsioonilise ülesreguleerimise mehhanismid vajavad edasist uurimist, näitavad meie tulemused, et DNA-PKcs vahendab TAF7 fosforüülimist, et soodustada mTORC1 aktivatsiooni, reguleerides Rptori ekspressiooni üles.

Mitmed varasemad uuringud on teatanud, et mTORC1 signaaliülekanne aktiveeritakse fibrootiliste neerude dediferentseerunud epiteelirakkudes ja müofibroblastides 9, 52. Kuigi on teatatud, et DNA-PK fosforüülib ja aktiveerib ka AKT / mTOR signaaliülekande kasvajarakkudes vastusena DNA katkestele53, pole täpne mehhanism teada. Meie tulemused näitasid, et TAF7 DNA-PKcs-vahendatud fosforüülimine soodustab mTORC1 aktivatsiooni, reguleerides Rap tori ekspressiooni üles, pakkudes võimalikku mehhanismi mTORC1 aktiveerimiseks fibrootilistes neerudes. MTORC1 krooniline aktiveerimine soodustab paljude haiguste, sealhulgas CKD9, 54 metaboolset ümberprogrammeerimist. Hiljutised uuringud on toonud esile, et nii neerutorukujulised rakud kui ka fibroblastid muudavad metaboolseid fenotüüpe vastuseks CKD9, 10, 13-le. Üleminek rasvhapete oksüdatiivsetelt radadelt ja oksüdatiivselt fosforüülimiselt glükolüüsile on metaboolse ümberprogrammeerimise peamine omadus9, 10. Kuna mTOR mängib metaboolse homöostaasi säilitamisel keskset rolli, avaldab mTOR inhibeerimine kõrvaltoimeid. Lisaks on TGF-i signaaliülekande pikaajaline pärssimine seotud ka vastuvõetamatute kõrvaltoimetega57. Selles uuringus leidsime, et DNA-PKcs aktiivsus oli normaalsetes neerudes peaaegu tuvastamatu, erinevalt selle tugevast suurenemisest kroonilise neeruhaiguse korral. Seega korrigeerib DNA-PKcs inhibeerimine fibrootiliste neerude metaboolset ümberprogrammeerimist.

Joonis 8|DNA-PK kustutamine korrigeerib metaboolset ümberprogrammeerimist. Iga rühma neerukudede metaboolne analüüs, nagu näidatud. Kuumakaardi pilt, mis näitab metaboliitide suhtelist taset glükolüüsirajas, rasvhapete metabolismis ja Krebsi tsüklis igas rühmas (n=4). Tulbad tähistavad iga rühma neerudes esinevate tüüpiliste metaboliitide statistilist analüüsi (keskmine ± SD, iga rühma n=4 hiirt). P-väärtuste määramiseks kasutati ühesuunalist ANOVA-d, millele järgnes Tukey mitmekordse võrdluse test. b Töömudel (mall loodi saidiga BioRender.com), mis illustreerib, milles DNA-PKcs vahendab Raptor/mTORC1 signaaliülekande aktiveerimist TAF7 fosforüülimise kaudu ja soodustab metaboolset ümberprogrammeerimist vigastatud epiteelirakkudes ja müofibroblastides.

Viited

1. Romagnani, P. et al. Krooniline neeruhaigus. Nat. Rev. Dis. Primers 3, 17088 (2017).

2. Humphreys, BD Neerufibroosi mehhanismid. Annu. Rev. Physiol. 80, 309–326 (2018).

3. Nath, KA Tubulointerstitium progresseeruva neeruhaiguse korral. Kidney Int. 54, 992-994 (1998).

4. Zhou, D. & Liu, Y. Neerufibroosist 2015. aastal: Neerufibroosi mehhanismide mõistmine. Nat. Rev Nephrol. 12, 68–70 (2016).

5. Wynn, TA & Ramalingam, TR Fibroosi mehhanismid: fibrootilise haiguse terapeutiline tõlge. Nat. Med. 18, 1028–1040 (2012).

6. Meng, XM, Nikolic-Paterson, DJ & Lan, HY TGF-beeta: fibroosi peamine regulaator. Nat. Rev Nephrol. 12, 325–338 (2016).

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

25% EHHINAKOSIIDI JA 9% AKTEOSIIDI NEERUTELE LOODUSLIKU ORGAANILISE KISTAŠAEKSTRAKTI SAAMISEKS KLIKI SIIA