Iseloomulikud teemaksutaolised retseptorid geeniekspressioon ja gliaalne reaktsioon loodusliku skreipi erinevates ajupiirkondades 1. osa

Abstraktne:

Prioonhaigused on kroonilised ja surmaga lõppevad neurodegeneratiivsed haigused, mida iseloomustab haigusspetsiifilise prioonvalgu (PrPSc) akumuleerumine, spongioossed muutused, neuronite kadu ja glioos.

Prioonitõbi, tuntud ka kui templitõbi, vahasöömise haigus jne, on prioonide põhjustatud äge viirusnakkus. Haigus levib peamiselt prioone sisaldava kuumtöötlemata toidu söömisel. Pärast prioonidega nakatumist võib see põhjustada ajupõletikku ja närvisüsteemi kahjustusi ning ilmneda sellised sümptomid nagu peavalu, oksendamine ja palavik.

Sellise olukorraga kokku puutudes ei saa me aga kaotada usaldust oma mälu vastu, kuna esineb prioonhaigust. Enamik nakatunud inimesi saab pärast ravi taastuda ja taastada oma mälu.

Loomulikult võime ennetavast vaatenurgast proovida süüa rohkem kuumtöödeldud toitu, et vältida prioonnakkust. Samas tuleks sümptomite tundmisel ka võimalikult kiiresti arsti poole pöörduda, et vältida haiguse ägenemist.

Igapäevaelus saame mälu parandamiseks proovida mõnda lihtsat mälutreeningut, näiteks lugemist, nimekirjade koostamist, sündmuste ja teabe korraldamist jne. Need treeningud ei nõua palju aega ja energiat, kuid on väga olulised terve aju ja tõhusa mälufunktsiooni säilitamiseks.

Lühidalt öeldes tuleks selliste haigustega nagu prioonhaigusega kokku puutudes suhtuda sellele positiivselt, otsida professionaalset arstiabi ja ennetusmeetmeid ning pöörata tähelepanu igapäevastele mäluharjutustele, et tagada oma füüsiline tervis ja tõhus töö. On näha, et me peame parandama mälu ja Cistanche võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche on traditsiooniline Hiina ravimmaterjal, millel on palju ainulaadseid toimeid, millest üks on mälu parandamine. Cistanche toime tuleneb selles sisalduvatest erinevatest toimeainetest, sealhulgas parkhape, polüsahhariidid, flavonoidglükosiidid jne. Need koostisosad võivad aju tervist mitmel viisil edendada.

Klõpsake teada, kuidas ajufunktsiooni parandada

Kasvavad tõendid näitavad, et neuroinflammatoorsed reaktsioonid on priondhaiguste põhikomponent ja aitavad kaasa neurodegeneratsioonile.

Teemaksutaolisi retseptoreid (TLR) on pakutud kesknärvisüsteemis vallandatud kaasasündinud immuunvastuste olulisteks vahendajateks teiste inimese neurodegeneratiivsete haiguste, sealhulgas Alzheimeri tõve, Parkinsoni tõve ja amüotroofse lateraalskleroosi korral.

Siiski on vähe teada TLR-ide rollist prioonhaigustes ja nende osalust loodusliku skreipi neuropatoloogias ei ole uuritud. Hindasime lammaste TLR-ide geeniekspressiooni neljas anatoomiliselt erinevas ajupiirkonnas looduslikel skreipiga nakatunud lammastel ja hindasime võimalikke seoseid geeniekspressiooni ja prioonhaiguse patoloogiliste tunnuste vahel.

Me täheldasime olulisi muutusi TLR-i ekspressioonis skreipiga nakatunud lammastel, mis on korrelatsioonis spongioosi, PrPSc ladestumise ja glioosi astmega igas uuritud piirkonnas.

Märkimisväärselt oli TLR4 ainus geen, mis oli kõigis piirkondades ülesreguleeritud, sõltumata neuropatoloogia tõsidusest. Hipokampuses täheldasime leebemat neuropatoloogiat, mis oli seotud erineva TLR-i geeniekspressiooniprofiiliga ja omapärase mikrogliia morfoloogia, mida nimetatakse rodmikrogliaks, olemasolu, mida siin esmakordselt kirjeldatakse skreipiga nakatunud lammaste ajus.

Nende tunnuste samaaegsus viitab hipokampuse osalisele neuroprotektsioonile. Lõpuks näitas looduslikult nakatunud lammaste ja liiga suurte hiiremudelite (tg338 hiired) leidude võrdlemine TLRgeeni ekspressiooni erinevaid mustreid.

Märksõnad: prioon; skreipi; teemaksutaolised retseptorid; neuropõletik; mikrogliia; astrotsüüdid.

1. Sissejuhatus

Transmissiivsed spongioossed entsefalopaatiad (TSE) ehk prioonhaigused on rühm looteväliseid neurodegeneratiivseid haigusi, mille hulka kuuluvad Creutzfeldt-Jakobi tõbi (CJD) inimestel, skreipi lammastel ja kitsedel, veiste spongioosne entsefalopaatia (BSE) veistel ja krooniline kurnatushaigus hirvedel. CWD).

Neid TSE-sid iseloomustab peremeesorganismi kodeeritud prioonvalgu (PrPC) muundumine nakkuslikuks isovormiks PrPSc, mis akumuleerub eelkõige närvisüsteemis ja lümforetikulaarsüsteemis (LRS), ning põletikuline immuunreaktsioon kesknärvisüsteemis (KNS) [1]. ,2].Prioonhaigusi, nagu skreipi, võib loomulikult saada PrPSc suukaudsel kokkupuutel.

Pärast soolebarjääri ületamist ja esmase replikatsiooni läbimist lümfoidsetes kudedes jõuab PrPSc kesknärvisüsteemi neuroinvasioonina tuntud protsessi kaudu. Nakkus levib seedetraktis asuvatest kohtadest vaguse ja splanchniaalsete närvide kaudu vastavalt ajutüvesse ja seljaajusse [3, 4].

Kesknärvisüsteemi jõudes levib PrPSc kaudaalsetest torostaalsetest piirkondadest, st rostraalse ajutüve kaudu väikeaju, vaheaju ja eesmise ajukooreni [5]. PrPSc anatoomiliselt stereotüüpne akumuleerumine viitab sellele, et selle levikut vahendab erinevate ajupiirkondade neuronaalne ühenduvus ja/või selektiivne haavatavus.

Peremeesfaktorid, nagu PrPSc genotüüp, tõug ja vanus nakatumise ajal, aitavad kaasa PrPSc ladestumise ulatusele ja spongioossete kahjustuste levikule.

Kuid peremees-priooni interaktsioonide molekulaarne alus, mis määrab PrPSc selektiivse sihtimise konkreetsetele ajupiirkondadele, jääb teadmata ja on prioonitüve nähtuse üks intrigeerivamaid aspekte.

Algselt eeldati, et immuunsüsteem ei reageeri PrPSc-le loomuliku tolerantsuse tõttu, kuid aja jooksul tehtud uuringud näitasid mikrogliia ja astrotsüütide kiiret aktiveerumist ja proliferatsiooni juba enne kliiniliste nähtude ja neuronite degeneratsiooni ilmnemist [6–8].

See mikrogliia ja astrotsüütide varane aktiveerimine ja proliferatsioon näib mängivat prioonihäirete patogeneesis keskset rolli, kuigi nende aktiveerimisega seotud molekulaarsed mehhanismid ning nii reaktiivsete astrotsüütide kui ka mikrogliia täpne roll haiguse patogeneesis on ebaselged [9, 10].

Lisaks on laialdaselt aktsepteeritud, et mikrogliia ja astrogliia jaotus ja fenotüüp varieeruvad ajupiirkondade ja liikide lõikes [11–14], omistades igale piirkonnale olemuslikud omadused, mis mõjutavad haavatavust neurodegeneratsiooni suhtes [10, 15, 16].

See nähtus on eriti ilmne prekliinilises staadiumis, mille jooksul nii mikroglia kui ka astroglia reageerivad priooninfektsioonile piirkonnaspetsiifilisel viisil.

Kuid haiguse progresseerumisel hakkab domineerima sagedamini esinev neuropõletikuline reaktsioon, mis lahjendab enamikku piirkondlikest tunnustest [17,18]. Viimastel aastatel on teatatud Toll-like retseptorite (TLR) rollist mikrogliia ja astroglia reaktsioonivõimes. mitmete neurodegeneratiivsete häirete puhul, rõhutades nende mõju nende haiguste progresseerumisele [19–21].

Andmeid TLRsini prioonhaiguste rolli kohta on aga vähe. Inprioonpatoloogiat on kirjeldatud TLR-ide osaliselt kaitsvat rolli. Täpsemalt on teatatud, et TLR2 [22] ja TLR4 [23] kadumine kiirendab prioonide patogeneesi, samas kui TLR9 stimulatsioon aeglustab haiguse progresseerumist hiiremudelites [24, 25].

Praeguseks on enamik prioonhaiguste TLR-ide uuringuid läbi viidud in vitro või hiiremudelite abil [8, 22, 26–29] ning nende roll looduslikult nakatunud loomadel ja inimestel on endiselt ebakindel. Meile teadaolevalt viidi üks uuring läbi vastsündinud talledega, kellele oli suukaudselt nakatatud skreipi (st kasutades looduslikku, kuid mitte looduslikult nakatunud peremeesorganismi) ja teatati TLR2 ja TLR4 üleekspressioonist veres kliinilise haiguse staadiumis [30].

Kaks uuringut on teatanud muutunud TLR geeniekspressioonist inimestel, kellel on sporaadiline CJD (sCJD) [31,32]. Immuunvastusega seotud geenide düsregulatsioon hõlmas TLR4 ja TLR7 mRNA üleekspressiooni sCJD MM1 patsientide väikeajus ja eesmises ajukoores ning TLR7 sCJD VV2 patsientide väikeajus.

Veelgi enam, Areskeviciuteet al. [32] hõlmas TLR4 40 parima ülesvoolu regulaatori hulka, mis prognooside kohaselt näitavad sCJD ja kontrollaju proovide diferentsiaalset ekspressiooni. Uurisime, kuidas looduslik skreipiinfektsioon mõjutab lammaste TLR-ide ja mõnede tsütokiinide transkriptsioonitaset neljas erineva prioonitundlikkusega ajupiirkonnas. varasemad tulemused [18].

Kvantitatiivne PCR (qPCR) analüüs näitas muutusi geeniekspressioonis skreipiga nakatunud rühmas võrreldes kontrollrühmaga ja ajupiirkonnast sõltuvat vastust.

Huvitaval kombel näitas hipokampus kõige erilisema kahjustuse profiili spetsiifilise reaktiivse mikrogliia morfoloogia ja TLR-i transkriptsioonimustriga. Arvestades eksperimentaalsete andmete nappust TLR-i geeniekspressiooni kohta lamba PrP-d üleekspresseerivatel hiirtel, tegime katseid ka tg338-hiirtega, kellele oli intratserebraalselt nakatatud tg338.

Meie tulemused näitavad mõningaid sarnasusi varasemate metsikut tüüpi hiirte uuringutega, kuid olulisi erinevusi loodusliku skreipi leidude osas.

2. Tulemused

2.1. Looduslikult nakatunud lammaste skreipi neuropatoloogia

Esmalt kinnitasime skreipi neuropatoloogiat sellesse uuringusse kaasatud looduslikult nakatunud lammastel, nagu eelnevalt kirjeldatud [33–36]. Spongioosi, PrPSc ladestumist ja reaktiivset gliiat uuriti nakatunud ja kontrolllamba aju neljas piirkonnas: medullaoblongata (Mo), talamuses (Th), hipokampuses (Hc) ja eesmises ajukoores (Fc).

Kõik looduslikult nakatunud loomad olid haiguse kliinilises staadiumis. Kliiniliste nähtude sageduse ja raskusastme põhjal oli kliiniline seisund lammaste puhul siiski erinev, ulatudes algusest kuni kaugelearenenud kliiniliste staadiumideni (tabel 1).

Joonisel 1 on kujutatud tüüpilised mikrofotod PrPSc, GFAP ja Iba1 vakuolatsiooni ja immunovärvimise hindamiseks, mis on tehtud nakatunud ja kontrollloomade igas valitud piirkonnas.

Nagu oodatud, ei tuvastatud kontrolllammaste koelõikudes vakuolatsiooni ega PrPSc ladestumise tõendeid. Seevastu skreipiga nakatunud lammastel ilmnesid kõik neuroanatoomilised alad spongioos, PrPSc ladestumine ja reaktiivne glia (p < 0,05).

Vakuolatsiooni, PrPSc ladestumise ja glioosi intensiivsus vähenes medulla piklikust otsmikukooreni. Huvitav on see, et vaatamata talamuse ja hipokampuse lähedusele täheldati olulisi erinevusi kõigi patoloogiliste markerite skoorides.

Suurim spongioosi määr täheldati medulla piklikus ja teetalamuses, erinevalt hipokampuses ja eesmises ajukoores leitud väga hajutatud vakuolatsioonist.

Intraneuronaalne vakuolatsioon oli medulla piklike tuumades rikkalik, nagu on näidatud vaguse närvi dorsaalses motoorses tuumas, samas kui neuropiil-spongioos domineeris talamuses ja otsmikukoores (joonis 1A). Hipokampuse neuropiilis leiti väga vähe vakuoole.

Joonis 1. Spongioosi, PrPSc ladestumise, mikroglioosi ja astroglioosi esinduslik neuropatoloogia ja immunohistokeemiline hinnang kontroll- ja skreipiga nakatunud lammaste kesknärvisüsteemis pikliku medulla (Mo), talamuses (Th), hipokampuses (Hc) ja eesmise ajukoores (Fc) .

Graafikud kujutavad iga analüüsitud parameetri poolkvantitatiivseid hindamisväärtusi. (A) Hematoksüliini-eosiini värvimine näitas skreipiga nakatunud lammaste kesknärvisüsteemi spongioosi muutusi ja spongiooskontrolli lammaste puudumist. (B) PrPSc tuvastamine L42 antikehaga skreipiga nakatunud lamba ajupiirkondades.

Kontrollrühmas tuvastati immunomärgistamine. (C) Ioniseeritud kaltsiumi siduva adaptermolekuli-1(Iba1) immunovärvimine näitas skreipiga nakatunud lammaste mikrogliia reaktsioonivõimet võrreldes kontrolllammastega.

(D) Gliaalse fibrillaarse happelise valgu (GFAP) immunovärvimine, mis näitab kontrolllammastega võrreldes suurenenud reaktiivset astrogliosiiniga skreipiga nakatunud lammast. (E) Spongioosi, PrPSc ladestumise, Iba1 ja GFAP intensiivsuse statistilised võrdlused ajupiirkondade vahel.

Hinded ulatuvad 0 (negatiivne) kuni 5 (maksimaalne intensiivsus). Olulised erinevused spongioos, PrPSc, Iba1 ja GFAP määrati kindlaks Studenti t-testi või Mann-Whitney U testi abil normaalselt ja mittenormaalselt jaotunud andmete jaoks.

Statistilised erinevused ajupiirkondade vahel määrati, kasutades vastavalt ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA) või Kruskal-Wallise testi normaalselt ja mittenormaalselt jaotunud andmete jaoks. * p < 0.05, ** p < 0,01. Skaalariba=200 µm.

Kõigil skreipiga nakatunud lammastel esines neljas analüüsitud kesknärvisüsteemi piirkonnas laialdaselt levinud PrPSc akumuleerumine, välja arvatud kolm lammast, kellel ilmnesid algavad kliinilised nähud ja mis olid PrPSc-negatiivsed immunohistokeemia (IHC) ja Western blot (WB) leidude põhjal frontaalkoores (tabel 1).

PrPSc immuunvärvimise intensiivsus näitas kaudaalset kuni rostralaalset vähenemist, mis on sarnane spongioosi puhul täheldatule, maksimaalse intensiivsusega medullaoblongata ja talamuses, kahes suurima vakuolatsiooniastmega piirkonnas ning madalama intensiivsusega hipokampuses ja eesmises ajukoores (joonis 1B).

Hipokampuses näitas PrPScimmunovärvimine fookuskaugust ja ebaühtlast jaotumist, erinevalt homogeensest hajutatud punktikujulisest mustrist, mida täheldati eesmise ajukoore osades.

Nagu eelnevalt kirjeldatud [36], täheldasime nelja põhimorfoloogilist PrPSc ladestumise mustrit: kaks intratsellulaarset mustrit, mis hõlmasid intraneuronaalset ja intragliaalset (sealhulgas intra-astrotsüütilist ja intramikrogliaalset) ladestumist, ja kahte rakumembraani / rakuvälist mustrit, mis hõlmasid neuropiiliga seotud ja gliiarakkude seotud sadestumine (joonis S1).

Kõigis ajupiirkondades domineerisid intraneuronaalsed ja neuropiiliga seotud mustrid. Tähelepanuväärselt vähenesid sügavtrüki- ja gliiamustrid eesmises ajukoores ja hipokampuses drastiliselt või isegi puuduvad, võrreldes medulla oblongata ja talamusega. Paralleelselt IHC-ga analüüsisime WB proteaasiresistentsete prioonide (PrPres) olemasolu.

Skreipiga nakatunud lammaste ajuproovid näitasid klassikalist kolmeribalist PrPres-mustrit, mis on seotud klassikalise skreipiga, kusjuures glükosüülitud fragmendi molekulmass oli ligikaudu 19 kDa (joonis 2).

Vaatamata teatavale varieeruvuse astmele suurenes PrPres signaal kliiniliste tunnuste raskusastmega kõigis ajupiirkondades ja oli rikkalikum kaudaalsetes ajupiirkondades.

PrPres'i WB oli positiivne piklikus medulla ja talamuses kõigil skreipiga nakatunud lammastel. Seevastu hipokampuse ja eesmise ajukoore proovid ei olnud PrPres suhtes positiivsed kõigil nakatunud loomadel.

Kuigi IHC oli PrPres suhtes positiivne kõigi nakatunud lammaste hipokampuses, oli WB 4/13 negatiivsed. Frontaalkoores olid 3/13 lammastest IHC poolt PrPres-negatiivsed ja WB poolt 4/13 lammastest PrPres-negatiivsed.

Lisaks vakuolatsioonile ja PrPSc ladestumisele on gliiarakkude aktiveerimist laialdaselt dokumenteeritud kui valgu valesti voltimise haiguste patogeneesi varajast sündmust.

Reaktiivse glia iseloomustamiseks allutati kõik ajupiirkonnad IHC-le, kasutades GFAP-vastaseid antikehi astrotsüütide tuvastamiseks ja anti-Iba1 antikehi mikrogliia tuvastamiseks.

Iba1 immunovärvimine, mis tuvastab nii puhkeolekus kui ka aktiveeritud mikroglia [37], suurenes märkimisväärselt skreipiga nakatunud lammaste ja kontrolllammaste kõigis ajupiirkondades ja tõi esile märkimisväärsed erinevused nakatunud loomade ajupiirkondade mikrogliia morfoloogias (joonis 1C).

Mikrogliiarakkude aktivatsioonistaatus määratakse kindlaks kolme peamise morfoloogia põhjal: hargnenud, hüpertroofiline ja ameboidne [38, 39]. "Jälgivas" või suhteliselt passiivses olekus mikrogliia rakkudel on hargnenud morfoloogia, mida iseloomustab väike rakukeha, millel on palju peeneid protsesse, nagu on täheldatud meie kontrollloomadel.

Aktiivset olekut iseloomustab ameboidne morfoloogia, mida tavaliselt seostatakse fagotsüütilise olekuga [38] ja mis koosneb sfäärilistest hargnemata rakukehadest. Hüpertroofilist morfoloogiat iseloomustavad suurema rakukeha ja lühemate, paksemate protsessidega mikrogliia ning see on seotud põletikuliste vahendajate tootmise ja vabanemisega [40,41].

Ameboidne morfoloogia oli kõige rikkalikum skreipiga nakatunud lammaste medulla oblongata puhul. Talamuses täheldati ameboidset morfoloogiat, kuid see ei domineerinud: mitmesugused suured ja õhukesed protsessid segunesid hõredate paksude protsessidega, mis tulenevad piklikutest rakukehadest, mis vastavad hüpertroofilisele mikrogliiale.

Proliferatiivse mikrogliia morfoloogia eesmises ajukoores ja hipokampuses erines märgatavalt medulla oblongata ja talamuse omast. Mõlemas piirkonnas domineeris hüpertroofiline mikroglia ja ameboidne mikroglia praktiliselt puudus.

Tähelepanuväärselt näitas hipokampuse Cornu Ammonis 3 (CA3) piirkond suurimaid erinevusi mikrogliia morfoloogias, näidates mikrogliia mustrit, mida tuntakse varda mikrogliaadina, mida ei täheldatud üheski teises ajupiirkonnas.

Need märkimisväärsed erinevused, mida täheldati hipokampuse hindamisel, ajendasid meid läbi viima alamväljade CA1, 3, 4 ja stratum lacunose-molecular (SLM) üksikasjalikku uurimist.

Joonis 2. PrPres-i Western blot tuvastamine kontroll- ja loodusliku skreipiga nakatunud lammaste kesknärvisüsteemis. Piisavaks võrdlemiseks laaditi võrdsed valgukogused ja immunoblotid viidi läbi SHA31 monoklonaalse antikehaga, et analüüsida (A) medulla oblongata (B) proove. ) taalamus, (C) hipokampus ja (D) skreipiga nakatunud lammaste eesmine ajukoor, millel on algavad kliinilised tunnused (proovid 1–5) ja kaugelearenenud kliinilised tunnused (proovid 6–13). Rida 14 näitab negatiivset kontrolli ja rida 15 nakatamata lamba aju homogenaadi proovi, mida ei ole pK seeditud.

GFAP-i immunovärvimine näitas märgatavat astroglioosi skreipiga nakatunud lammastel võrreldes kontroll-lammastega (joonis 1D). Morfoloogiliselt näitasid nakatunud lammaste astrotsüüdid järjekindlalt hüpertroofseid rakukehasid ja -protsesse, kinnitades reaktiivse astroglioosi olemasolu, samas kui kontrolllammastel oli mitteaktiveeritud oleku tüüpiline tähtkuju morfoloogia.

Medulla piklikus ja talamuses oli GFAP-i immuunvärvimine intensiivsem, kattuvate protsesside tõttu tekkisid astrotsüütide võrgud. Hipokampuses ja eesmises ajukoores olid astrotsüüdid jaotunud ühtlaselt, kusjuures esinesid isoleeritud hüpertroofsed tähekehad.

For more information:1950477648nn@gmail.com