In vitro ja in vivo testidega hinnatud samblikuekstraktide depigmentatsioonipotentsiaali 1. osa
Apr 11, 2023
ABSTRAKTNE
Melaniin on inimese naha peamine pigment, millel on peamine roll ultraviolettkiirguse eest kaitsmisel. Melaniini tootmise muutumine võib põhjustada hüperpigmentatsioonihaigusi, millel on nii esteetilised kui ka tervisega seotud tagajärjed. Seega peetakse melanogeneesi supressoreid kasulikeks vahenditeks meditsiinilises ja kosmeetilises ravis. Suur huvi on suunatud looduslikele allikatele, mille eesmärk on leida ohutuid ja kvantitatiivselt kättesaadavaid depigmenteerivaid aineid. Arvatakse, et samblikud on seda tüüpi ühendite võimalikud allikad, kuna paljude fenoolmolekulide esinemine viitab võimalikule mõjule melaniini sünteesis osalevatele fenolaasi ensüümidele, nagu türosinaas. Selles töös kasutasime nelja samblikuliiki Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale ja Letharia vulpina (L.) Hue ning Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy, et saada ekstrakte kasvava polaarsusega lahustites, st. kloroform, kloroform-metanool, metanool ja vesi. Rakuvabad türosinaasi inhibeerimise katsed näitasid suurimat inhibeerimist L. vulpina metanooliekstrakti, millele järgnes C. islandica kloroform-metanool. Depigmenteerimistegevuse võrreldavaid tulemusi täheldati in vitro ja in vivo süsteemide, näiteks MeWo melanoomirakkude ja sebrakala vastsete abil. Meie uuring annab esimesed tõendid samblike ekstraktide depigmenteeriva toime kohta, alates türosinaasi inhibeerimisest kuni raku- ja in vivo mudeliteni, mis viitab sellele, et L. vulpina ja C. islandica ekstraktid väärivad edasist uurimist nahka valgendavate toodete väljatöötamiseks.
Asjakohaste uuringute kohaseltcistancheon tavaline ravimtaim, mida tuntakse kui "imerohi, mis pikendab eluiga". Selle põhikomponent ontsistanosiid, millel on erinevad mõjud naguantioksüdant, põletikuvastaneja immuunfunktsiooni edendamine. Mehhanism cistanche janaha valgendaminepeitub cistanche antioksüdantses toimesglükosiidid. Inimese nahas sisalduv melaniini toodetakse türosiini oksüdeerumisel, mida katalüüsibtürosinaas, ja oksüdatsioonireaktsioon nõuab hapniku osalemist, seega muutuvad hapnikuvabad radikaalid kehas oluliseks melaniini tootmist mõjutavaks teguriks. Tistanche sisaldab tsistanosiidi, mis on antioksüdant ja võib vähendada vabade radikaalide teket organismis, seegamelaniini tootmise pärssimine.
Valgendamiseks klõpsake valikul Cistanche Tubulosa toidulisand
Lisateabe saamiseks:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
ÕppeainedTaimeteadus, dermatoloogia
MärksõnadTürosinaas, samblike sekundaarsed metaboliidid, sebrakala, melanogenees, letharia vulpina, Cetraria islandica
SISSEJUHATUS
Selgroogsetel teostavad melaniini sünteesi spetsiaalsed rakud, mida nimetatakse melanotsüütideks, lüsosoomitaolistes organellides, mida nimetatakse melanosoomideks. Melaniseerumist kontrollivad erinevad protsessid, sealhulgas keskkonna (nt UV-kiirgus) ja endogeensed (nt -MSH) tegurid, melanokortiini -1 retseptori (MC1R) stimuleerimine, signaaliülekanne cAMP ja MAPK radade kaudu, mikroftalmia aktiveerimine. seotud transkriptsioonifaktoriga (MITF) ning melanosoomieelse valgu (Pmel), türosinaasi (TYR) ja türosinaasiga seotud valkude (TYRP1) ekspressiooniga (D'Mello et al., 2016; Cheli et al., 2010).
Türosinaas (EC1.14.18.1) on melaniini sünteesi võtmeensüüm ja seda on laialdaselt uuritud melaniseerumist moduleerivate ainete sihtmärgina. See on looduses laialt levinud multifunktsionaalne vaske sisaldav ensüüm, mis vastutab loomade melaniseerumise ning taimede ja mikroorganismide pruunistumise eest (Kondo & Hearing, 2011). Ensüüm katalüüsib kahte erinevat melaniini moodustumise reaktsiooni: türosiini hüdroksüülimist mükofenolaadi toimel ja 3,4-dihüdroksüfenüülalaniini (L-DOPA) oksüdatsiooni o-dopakinooniks difenoolide toimel. Need reaktiivsed o-kinoonid läbivad mitteensümaatilise polümerisatsiooni, moodustades melaniini.
Kuigi melaniin inimese nahas on UV-kiirguse põhjustatud kahjustuste eest kaitsmiseks hädavajalik pigment, põhjustab liigne melaniini tootmine hüperpigmentatsioonihäireid, nagu melasma, epheliidid ja lentigiinid (Mukherjee et al., 2018). Need seisundid kujutavad endast probleemi paljudele inimestele ja sellest tulenevalt on depigmenteerivate ainete otsimine äratanud suurt huvi meditsiini- ja farmaatsiavaldkonnas (Solano, 2014). Seetõttu on tehtud märkimisväärseid teadusuuringuid, et leida uusi looduslikke aktiivseid tooteid, mis on rikkad ohutute ja kvantitatiivselt kättesaadavate pigmentatsiooni inhibiitorite poolest (Li et al., 2013; Lo et al., 2013; Wang et al., 2011). Peamine strateegia on sihtida türosinaasi, suurendades huvi looduslike toodete vastu, mida kasutatakse türosinaasi inhibiitoritena (Leyden et al., 2011). Kirjanduses on teatatud paljudest looduslikest allikatest pärinevatest türosinaasi inhibiitoritest nende võimaliku kasutamise kohta pigmenteerunud nahahaiguste raviks (Mukherjee et al., 2018; Parvez et al., 2007). Paljude nende ühendite inhibeeriv toime on seotud nende fenoolse struktuuriga, mis tagab kõrge antioksüdantse toime. Erinevad tõendid näitavad, et samblikke tasub seda tüüpi ühendite võimalike allikatena uurida (Brandão et al., 2017; Higuchi jt, 1993; Honda et al., 2016; Lopes, Coelho & Honda, 2018).
Samblikud on sümbiootilised ühendused heterotroofse seene (mükobiont) ja ühe või mitme fotosünteesipartneri (fotobiontide) vahel (Nash III, 2006). Sümbioosi tulemusena toodab mükobiont mitmeid sekundaarseid metaboliite (nimetatakse samblike aineteks), millest enamik on neile organismidele ainulaadsed (Ranković & Kosanić, 2015). Need metaboliidid võivad aidata kaitsta biootiliste ja abiootiliste tegurite eest, nagu taimtoidulised loomad või UV-kiirgus (Phinney, Solhaug & Gauslaa, 2018). Enamik neist on fenoolsed ühendid, mis on saadud peamiselt atsetaat-polümalonaadi rajast ja millel on eeldatavasti mitu bioloogilist toimet. Sellest tulenevalt kasutatakse samblikke traditsioonilises meditsiinis kogu maailmas erinevatel eesmärkidel (Crawford, 2015; Devkota et al., 2017), samas kui erinevaid samblike aineid on kasutatud ravimtaimedes ja farmaatsiarakendustes (Einarsdóttir et al., 2010; Gül¸). cin et al., 2002; Ranković & Kosanić, 2015). Erinevate omaduste hulgas viitab nende ühendite fenoolne olemus mõjule fenolaasi ensüümide nagu türosinaas aktiivsusele (Honda et al., 2016). Samblikud on head looduslike antioksüdantide allikad, millest osa on tunnistatud türosinaasi inhibiitoriteks (Behera, Adawadkar & Makhija, 2004). Mõned patendid väidavad ka türosinaasivastast tegevust, mis on seotud samblikuekstraktide või samblikuühenditega (Takayama et al., 2010), kuid need on pikka aega tähelepanuta jäetud ja tähelepanuta jäetud peamiselt raskuste tõttu hankida samblike aineid koguses ja puhtuses, mis on piisavad struktuuri selgitamiseks ja farmakoloogiline testimine (Boustie, Tomasi & Grube, 2011; Muggia, Schmitt & Grube, 2009).
Selle uuringu eesmärk oli uurida samblike ainete bioloogilist mõju erinevatele pigmentatsioonimudelitele, nii rakuvabadele kui ka rakulistele, sealhulgas in vivo sebrakala katsetele. Lisaks andsime vihjeid võimaluse kohta kasutada samblikke depigmenteerivate ühendite ekstraheerimiseks ning farmatseutiliste ja kosmeetiliste depigmenteerivate toodete valmistamiseks. Piiratud teadmiste tõttu samblike mõju kohta melaniseerumisele teostasime esmalt sõeluuringu erinevate liikide kohta, mis on tuntud oma laia leviku ja arvukuse poolest, st. Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale, Letharia vulpina (L.) Hue ja Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy. Igast liigist saime neljast ekstraktist koosneva seeria, kasutades kasvava polaarsusega lahusteid, alates puhtast kloroformist kuni veeni. Esimese uuringuna testiti kõiki ekstrakte rakuvabades türosinaasi inhibeerimise katsetes. Märkimisväärse annusest sõltuva inhibeeriva toimega ekstrakte kasutati melaniini in vitro ja in vivo mudelitel, kasutades vastavalt melaniini tootvate melanoomirakkude (MeWo) kultuure ja arenevaid sebrakala embrüoid. Kasutasime sebrakala, kuna see on hiljuti loodud melanogeensete regulatoorsete ühendite fenotüübipõhise skriinimise in vivo mudelina (Lin et al., 2011). Eelkõige on sebrakala muutunud oluliseks selgroogsete mudeliks ravimite mõjude hindamisel, kuna sellel on ainulaadsed omadused, sealhulgas hoolduse ja ravimi manustamise lihtsus, lühike paljunemistsükkel, väline viljastamine ja areng, mis võimaldab manipuleerida arengukeskkonnaga ja läbipaistva optilise mõõtmise abil. keha sein.
MATERJALID JA MEETODID
Kemikaalid
Kõik reaktiivid osteti firmalt Sigma-Aldrich (Milano, Itaalia), kui pole märgitud teisiti.
Samblike liigid ja ekstrakti valmistamine
F. caperata ja P. perlatumi thalli koguti Ida-Liguria (Loode-Itaalia) metsaalalt, L. vulpina Valtournenche metsapiirkonnast (Valle d'Aosta kirdeosa, Itaalia) ja C. islandica osteti Kubjast. Ürditalu (Tallinn, Eesti). Itaalia seaduste kohaselt pole samblike kogumiseks luba vaja. Üks meist (PG) tuvastas samblike materjalid mikroskoobi analüüsi abil identifitseerimisvõtmete ja punkttestide abil. Seejärel puhastati samblikumaterjal prahist, jäeti üleöö toatemperatuuril kuivama ja hoiti kuni kasutamiseni toatemperatuuril paberkottides.
Kuivatatud sambliku talli ekstraheeriti toatemperatuuril (umbes 23 ◦C) nelja lahusti polaarsusega kloroformist vette: kloroform, kloroform-metanool (9:1), metanool ja vesi (14,4 g F. caperata 70 ml-s mõlemas). lahusti, 10,4 g P. perlatum 60 ml-s, 13,3 g L. vulpina 75 ml-s ja 100,6 g C. islandica 500 ml-s). Ekstraheerimine viidi läbi 5 päeva ja iga lahusti puhul 3 korda, sageli segades. Seejärel supernatant filtreeriti ja aurustati kuivaks kuivatatud ekstraktide saamiseks alandatud rõhul rotatsioonisüsteemis (Rotavapor Heidolph, Schwabach, Saksamaa). Samblike ekstrakti saagised on esitatud tabelis 1.
Türosinaasi inhibeerimise test
Samblikuekstraktid lahustati dimetüülsulfoksiidis (DMSO) lõppkontsentratsioonini 10 mg/ml. Ekstrakti põhilahused lahjendati seejärel vees, et saada testlahuste seeria lõppkontsentratsioonidega 10, 50, 100, 250, 350 ja 500 µg/ml. Reaktsioonisegu komponendid lisati igasse 96-süvendiga plaatide süvendisse järgmises järjekorras: 70 µL fosfaatpuhvrit, 60 µL ekstraktilahuseid (vesi kontrollideks), 10 µL seene türosinaasi (Sigma-Aldrich, T3824, 25 kU, 125 U/ml fosfaatpuhvris, pH 6,8) ja 70 µL L-türosiini (0,3 mg/ml vees). Positiivse kontrollina kasutati samblikuekstraktide asemel kojichapet kontsentratsioonides 0,5 kuni 500 µg/ml. Kõikide tingimuste jaoks lisati ka tühjad proovid ilma ensüümideta. Seejärel inkubeeriti plaate temperatuuril 30 °C 60 minutit ja neeldumist loeti 505 nm juures mikroplaadilugejas (Spectra Max 340PC). Inhibeeriva aktiivsuse protsent (I protsent) arvutati valemi järgi
kus Aex/en=proovisegu neeldumine ekstrakti ja ensüümiga; Aex=proovisegu neeldumine ekstraktiga ja ilma ensüümita; Aen=proovisegu neeldumine ensüümiga ja ilma ekstraktita; Abk=proovisegu neeldumine ilma ensüümi ja ekstraktita (tühi).
TLC bioautograafiline analüüs
Tavaline TLC kromatograafiline profiil viidi läbi 20 × 20 cm plaatidel (Merck silikageelil 60 F254), järgides kirjanduse protokolle (Culberson & Kristinsson, 1970; White & James, 1985). Lühidalt, L. vulpina metanooliekstrakti ja C. islandica kloroform-metanooli ekstrakti proovid lahustati uuesti nende ekstraheerimislahustites ja seejärel kanti kapillaartoru abil TLC plaadile. TLC profiil viidi läbi, kasutades liikuva faasina tolueeni:äädikhapet (200:30 ml) (lahusti C). Pärast lahusti frondi saavutamist jäeti plaat toatemperatuuril kuivama. Kuivatatud plaate uuriti ja pildistati algul nähtavas valguses (päevavalguses), et tuvastada pigmente värviliste laikudena, ja seejärel fluorestsentsvalguses, kasutades 254 ja 350 nm ergastust.
Türosinaasi inhibeeriva aktiivsuse esinemise visualiseerimiseks igas punktis pihustati TLC plaate L-türosiini lahusega (umbes 2,5 × 10-5 mmol/cm2) ja seejärel türosinaasi lahusega (umbes 3,6 U/cm2). Türosinaasi inhibeeriva toimega laigud paistsid tumedal taustal valged (Wangthong et al., 2007).
Rakukultuuri, rakkude elujõulisuse ja melaniini testid
MeWo inimese melanoomi rakuliini (kat. HTB-65, ATCC, Manassas, VA, USA) kasutati rakkude elujõulisuse analüüsiks, nagu on kirjeldanud Pastorino jt (2017), ja melaniini analüüsiks, nagu on kirjeldanud: Cornara jt (2018).
Sebrafishi depigmentatsiooni test
Täiskasvanud sebrakala (Danio rerio) saadi kaubanduslikult edasimüüjalt ja neid hoiti tsirkulatsioonisüsteemis, mille veejuhtivus oli 500–530 /cm temperatuuril 27 ◦C, pH 7,0–7,5 konstantse 14/10 valguse all. tume fotoperiood. Loomade veterinaarhooldus viidi läbi vastavalt Itaalia seadustele (D.to L.Vo 26/2014) ning katsed kiitsid heaks Institutsional Ethics Review Body (Genova ülikool) ja Itaalia tervishoiuministeerium (luba 720/). 2015-PR). Täiskasvanud sebrakala kudemine viidi läbi standardsete meetoditega. Eelkõige saadi sünkroniseeritud embrüod loomulikust kudemisest, mis kutsuti esile hommikul valguse sisselülitamisega. Embrüod paigutati 6-süvendiplaatidele, mis sisaldasid 2 ml embrüosöödet ja 15 embrüot süvendi kohta. Ekstrakti põhilahused lahjendati soovitud kontsentratsioonini embrüosöötmega vahetult enne kasutamist (L. vulpina metanooliekstrakt: 6–45 µg/ml; C. islandica kloroform-metanooli ekstrakt: 5–65 µg/ml). Igasse süvendisse lisati lahjendatud ekstraktid ja inkubeeriti 8–56 hj (tundi pärast viljastamist), mille tulemuseks oli 48-tunnine kokkupuude. Positiivse kontrollina kasutati 10 mM arbutiini. Söödet vahetati iga 24 tunni järel, et tagada katseühendite ühtlane jaotumine. Embrüod võimsusega 56 hj dekoorioneeriti tangidega, anesteseeriti trikaiinmetaansulfonaadi lahuses (Sigma Aldrich) ja seejärel pildistati stereomikroskoobi all (Leica M205C). Mõju pigmentatsioonile hinnati ImageJ tarkvara v. 1.74 abil. Sebrakala pigmentatsiooni ala hindamiseks kasutati pikslimõõtmise analüsaatori funktsiooni.
Statistiline analüüs
Türosinaasi inhibeerimise, MTT ja sebrakala pigmentatsiooni andmete põhjal saadud annuse-vastuse kõveraid analüüsiti logistilise regressioonimudeliga, saades IC50 ja IC05 väärtused, mis eeldati vastavalt mediaan- ja lävitasemetena. Statistilised võrdlused viidi läbi R 3.0.1 (R Core Team, 2013) keskkonnaga, kasutades ANOVA testi, t Studenti Bonferroni korrektsiooni ja Dunnetti teste mitmekordseks võrdluseks.
TULEMUSED
Mõju türosinaasi aktiivsusele
Samblikuekstraktid näitasid seene türosinaasi aktiivsust moduleerivate mõjude kompleksi, mida hinnati in vitro rakuvaba testiga. Mõned ekstraktid kutsusid esile türosinaasi aktivatsiooni, eriti F. caperata metanooli, kloroformi ja L. vulpina veeekstraktid, teised näitasid kahefaasilist käitumist, samas kui mõned olid inhibeerivad (joonis 1 ja tabel 2). Eelkõige näitasid kloroform-metanooli (joonis 1B) ja metanooli ekstraktid (joonis 1C) tugevamat türosinaasi inhibeerimist koos annusest sõltuva toimega. Tugevaim inhibeeriv toime registreeriti L. vulpina metanooliekstraktil (joonis 1C), millele järgnes C. islandica kloroform-metanooliekstrakt (joonis 1B). Nende ekstraktide inhibeerivad toimed olid ainsad, mis võimaldasid hinnata IC50 väärtusi 95% CI-ga (tabel 2). Positiivse kontrollina oli nendes katsetes kojichappe poolt indutseeritud türosinaasi inhibeerimine IC50-ga 13,9 µg/ml (95-protsendiline usaldusvahemik: 12,4–15,7).
Lisateabe saamiseks: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
