Dendrimer-tesaglitasari konjugaat kutsub esile mikrogliia fenotüübi muutuse ja suurendab amüloidse fagotsütoosi† 3. osa

D-Tesa suurendas patogeensete valkude eemaldamise eest vastutavate ensüümide ekspressiooni

Insuliini lagundav ensüüm (Ide) ja maatriksi metalloproteaas 9 (MMP9) on ensüümid, mida eritavad mikrogliia, mis lagundavad rakuvälist -amüloidi ja -sünukleiini.71,72 Ravi D-Tesaga suurendas oluliselt Ide 3 ekspressiooni.{8}} korda (p <) 0.001), mille suundumus on MMP9 ekspressiooni suurenemise suunas (1.8-kordne kasv, p=0.057) võrreldes ainult LPS-iga töödeldud kontrollidega (joonised 6A ja B).

Viimastel aastatel on üha enam uuringuid näidanud, et insuliini lagundavate ensüümide ja mälu vahel on tihe seos. See avastus annab meile väärtuslikke vihjeid mälu kujunemise ja säilitamise mehhanismi edasiseks uurimiseks.

Insuliini lagundav ensüüm on oluline ensüüm, mille põhiülesanne on insuliini lagundamine, et säilitada veresuhkru tasakaalu. Hiljutised uuringud on aga näidanud, et insuliini lagundav ensüüm ei mängi mitte ainult metaboolset rolli, vaid mõjutab otseselt ka aju neuronite kasvu ja paranemist ning mängib olulist rolli mälu säilitamisel.

Paljud uuringud on näidanud, et mida kõrgem on insuliini lagundava ensüümi tase, seda parem on mälu. Seda seetõttu, et insuliini lagundavad ensüümid võivad soodustada neuronite kasvu ja paranemist, parandades seeläbi aju õppimis- ja mäluvõimet. Lisaks võivad insuliini lagundavad ensüümid soodustada ka neuronite vahelist ühendust, suurendades seeläbi seost ja mälu säilitamist.

Insuliini lagundavate ensüümide olulist rolli mälus on kliinilises meditsiinis laialdaselt kasutatud. Teadlased on leidnud, et insuliini lagundavate ensüümide sissehingamisel ei parane mitte ainult mälu, vaid ka kognitiivsed võimed ja depressioonisümptomid.

Lühidalt öeldes on seos insuliini lagundavate ensüümide ja mälu vahel väga oluline valdkond, mis annab meile väärtuslikke vihjeid mälu bioloogilise mehhanismi uurimiseks. Tulevased uuringud uurivad veelgi insuliini lagundavate ensüümide funktsiooni ja rolli, aitavad meil paremini mõista mälu kujunemise ja säilitamise mehhanismi ning loovad parema aluse inimaju õppimis- ja mäluvõime parandamiseks. On näha, et me peame parandama mälu ja Cistanche võib oluliselt parandada mälu, kuna Cistanche suudab reguleerida ka neurotransmitterite tasakaalu, näiteks tõsta atsetüülkoliini ja kasvufaktorite taset, mis on mälu ja õppimise jaoks väga olulised. Lisaks võib Cistanche parandada verevoolu ja soodustada hapniku kohaletoimetamist, mis tagab aju piisava toitumise ja energia, parandades seeläbi aju elujõudu ja vastupidavust.

Klõpsake nuppu Tea, kuidas oma mälu parandada

Vaba Tesa suurendas märkimisväärselt Ide ekspressiooni 2-korda (p=0,011) ja mitteoluliselt suurendas MMP92- korda (p=0,35) (joonis 6A) ja B). M2 mikrogliia neurodegeneratiivsete haiguste korral võib eemaldada -amüloidi, -sünukleiini ja muud patogeensed valgud ensümaatilise lagunemise või fagotsütoosi kaudu ning D-Tesa reguleerib üles nendes protsessides osalevaid valke (st Ide ja MMP9).71–73

Ideeekspressioon on AD ja PD patoloogias alareguleeritud ning teadaolevalt reguleerivad seda PPAR agonistid, mis on kooskõlas meie tulemustega.

71,72 Funktsionaalselt on näidatud, et ainult 2--kordne Ide taseme tõus vähendab in vivo amüloidi akumulatsiooni ja neuronite surma.74,75 Seetõttu on D-Tesa poolt täheldatud Ide 3-kordne suurenemine ja Ide 2-kordne suurendamine freeTesa poolt võib olla in vivo terapeutiliselt tõhus.

D-Tesa suurendab -amüloidi fagotsütoosi

CD36 on mikrogliia püüdurretseptor, mis hõlbustab fagotsütoosi ja -amüloidi lagunemist.73 Selle alareguleerimine AD-s põhjustab -amüloidi eemaldamise vähenemist, kuid seda reguleerib üles PPAR aktiveerimine.

Nii D-Tesa kui ka vaba Tesa suurendasid märkimisväärselt CD36 ekspressioonitaset võrreldes ainult LPS-iga eksponeeritud rakkudega (p < 0.0001 vs. p < 0,005 D-Tesa ja vaba Tesa puhul vastavalt), kuid D-Tesa oli palju tõhusam kui vaba Tesa (6-kordne kasv vs. 28-kordne kasv D-Tesa ja vaba Tesa puhul, p < 0,0005) (joonis 6C) ).

Meie tulemused on kooskõlas varasemate pioglitasooniga (teine ​​PPAR-i agonist) tehtud uuringutega, mis näitasid, et -amüloidi suurenenud mikrogliia fagotsütoos toimub PPAR-ist ja CD{1}}sõltuva mehhanismi kaudu.73

Et uurida, kas CD36 ülesreguleerimine D-Tesat-ravist on korrelatsioonis nende rakkude suurenenud fagotsüütilise võimega, viisime läbi -amüloidi funktsionaalse fagotsütoosi testi. 73

Lühidalt, pärast rakkude töötlemist, nagu me tegime eelmistes in vitro testides, rakendasime rakkudele kaheks tunniks fluorestsentsmärgistatud -amüloidi1–42, pesti rakke ja seejärel teostasime voolutsütomeetria, et uurida -amüloidi rakkude omastamise ulatust. D-Tesa suurendas nii -amüloidi fagotsütoosinud rakkude protsenti kui ka sisemise amüloidi keskmist kogust raku kohta (joonis 7A ja B).

Seevastu vaba Tesa ei parandanud -amüloidi fagotsütoosi. D-Tesa parem mõju võrreldes Tesaga on tõenäoliselt tingitud dendrimeeri konjugatsiooni võimaldatud paranenud rakusisesest sisemisest.

See on kooskõlas varasemate töödega, mis näitasid, et üle 95% fluorestsentsmärgistatud G4-PAMAM-OH-ga töödeldud BV2 rakkudest olid dendrimeeri sisestanud 30 minuti jooksul ja jätkasid dendrimeeri internaliseerimist vähemalt 24 tundi.76

Samamoodi näitas väikese molekuli minotsükliini konjugeerimine fluorestseeruvalt märgistatud G4-PAMAM-OH-ga, et 99% BV2 rakkudest oli fluorestseeruvalt märgistatud dendrimer-ravimi konjugaadi 3 tunni jooksul internaliseerinud.26 Samuti näitasid nad, et konjugaadi tase vähendas lämmastikoksiidi taset paremini. vabaks ravimiks pärast BV2 rakkude töötlemist LPS-iga, mis on kooskõlas meie tulemustega.

D-Tesafagotsütoosiga töödeldud rakud 1.9- korda rohkem -amüloidi kui LPS-iga töödeldud kontrollrakud (p < 0,001), mis on võrreldav 25-kordse suurenemisega - amüloidfagotsütoos roti primaarsete mikrogliiarakkude poolt, mida on töödeldud pioglitasooniga, teatas Yamanaka jt.73 Eelmises uuringus kirjeldatud amüloidfagotsütoosi veidi suurem ulatus võib tuleneda sellest, et nad ei ravinud oma rakke koos LPS-ga nagu meie, või sellest, et primaarne mikroglia ekspresseerib PPAR-i kõrgem tase kui selles uuringus kasutatud BV2 rakud.77

Sellisena võib D-Tesa annus, mis on väiksem kui meie uuringus tehtud in vitro katsete põhjal hinnatud, olla tõhus in vivo uuringutes ja inimestel, kuna teadaolevalt ekspresseerivad BV2 rakud PPAR-i madalamal tasemel kui primaarne mikroglia.77

Mikrogliia on seostatud paljude neurodegeneratiivsete haigustega ja BBB on takistanud paljudel ravimitel, mis võivad muuta mikrogliia fenotüübi põletikueelsest, neurotoksilisest M1 fenotüübist põletikuvastaseks, neuroprotektiivseks M2 fenotüübiks, jõudmast ajus terapeutilisele tasemele.5,6, 14,15

Näiteks uuriti kahte PPAR agonisti, pioglitasooni ja rosiglitasooni, mõlemat Alzheimeri tõve III faasi kliinilistes uuringutes, kuna need olid võimelised muutma mikrogliia fenotüüpi, kuid tõenäoliselt ebaõnnestusid need halva transpordi tõttu läbi BBB.13,14 Seega on kliiniline huvi muutumatu. mikrogliia fenotüüp neurodegeneratiivsete haiguste korral.

Selline lähenemine nõuab ravivastuse esilekutsumiseks piisaval tasemel ravimi manustamist mikrogliiale. Selle eesmärgi saavutamiseks on näidatud, et G4-OH-PAMAM dendrimeerid viivad paljudes loommudelites pärast süsteemset süstimist ravimeid mikrogliiasse ja seetõttu hinnatakse neid praegu kliinilistes uuringutes ccTLD (NCT03500627) ja raske COVID-i raviks. -19 seotud põletik (NCT04458298).18–28

Et kombineerida mikrogliia fenotüübi muutmise kasulikke mõjusid võimega toimetada ravimeid mikrogliiasse, konjugeerisime tesaglitasari (PPAR/kahekordne agonist) G4-OH-PAMAMdendrimeeriga (joonis 1–3). Näitasime, et D-Tesa on võimeline muutma M1 mikrogliia fenotüüpi M2 fenotüübi suunas (joonised 4 ja 5), ​​mille tulemuseks on kahjulike reaktiivsete hapnikuliikide sekretsiooni vähenemine.

Lisaks näitasime, et D-Tesaga töödeldud mikroglia suurendab nende ensüümide ekspressiooni, mis lagundavad patoloogilisi valke, nagu -sünukleiin ja -amüloid, ning suurendavad funktsionaalses testis -amüloidi fagotsütoosi (joonised 6 ja 7).

Kuigi me ei esita andmeid, mis näitaksid D-Tesa võimet BBB-st mööda minna ja akumuleeruda mikrogliiasse, oleme varem näidanud, et sarnase ravimikoormuse, suuruse ja zeta potentsiaaliga G4-OH-PAMAM ravimikonjugaadid on võimelised läbima pärast intravenoosset manustamist vähenenud veresoonkond ja akumuleeruv mikroglia.26,36,52

Need tulemused toetavad D-Tesa edasiarendamist mitmete neuroloogiliste haiguste raviks. Kuigi me keskendume käesolevas artiklis Alzheimeri tõve ja Parkinsoni tõvedele, on D-Tesa potentsiaal mitmete neuroloogiliste häirete kliiniliseks tõlkimiseks. Mikroglia sarnase rolli tõttu hulgi neurodegeneratiivsete haiguste patoloogias uuriti ka PPAR agonisti pioglitasooni või uuritakse praegu Parkinsoni tõve,78 ALS,79 adrenomüeloneuropaatia (NCT03864523), hulgiskleroosi (NCT) ja hematoomide (NCT) II faasi kliinilistes uuringutes. Lahendus intratserebraalse hemorraagia korral (NCT00827892).

Kui ka need kliinilised uuringud ebaõnnestuvad pioglitasooni halva kohaletoimetamise tõttu läbi BBB, võib D-Tesa ületada selle tarnetakistuse ja ravida nende haigustega patsiente.

Teised rühmad on kasutanud nanoosakesi, et parandada PPAR agonistide kohaletoimetamist makrofaagidesse, kuid nad ei ole püüdnud neid agoniste mikrogliiasse toimetada. Osinski jt näitasid, et meeste leptiini puudulikkusega rasvumuse mudelis võtsid Tesa-laetud liposoomid peamiselt vistseraalse valge rasva makrofaagid.

Lisaks näitasid nad, et Tesaga laetud liposoomid ei muutnud M1 markeri Mcp-1 ekspressiooni, kuid suurendasid M2 markeri Arg1 ekspressiooni, samas kui ravi vaba Tesaga vähendas M1 makrofaagide koguarvu ja Mcp{{6 ekspressiooni. }}, ja ei suurendanud Arg1 ekspressiooni.

Nakashiro jt. kasutas polü(piim-ko-glükoolhape) (PLGA) nanoosakesi pioglitasooni (PPAR agonist) toimetamiseks makrofaagidesse ateroskleroosi kontekstis.81

In vivo näitasid nad, et PLGA-pioglitasoon vähendas immuunrakkude taset veres. LPS-i ja interferooniga ravitud esmased luuüdist pärinevad makrofaagid leidsid, et PLGA-pioglitasoon suurendas IL-4 ja IL-10 (M2 markerid) ega vähendanud IL-6 ega TNF taset.

Nende leiud on sarnased meie omadega; M2 markerid suurenesid nanoosakeste-PPAR agonistiga töötlemisel, samas kui IL-6 ja TNF-tasemed ei langenud. Di Mascolo et al. kasutas rosiglitasooni (teine ​​PPAR agonist) kohaletoimetamiseks PLGA-polüvinüülalkoholi nanoosakesi.82

In vitro näitasid nad, et nende nanoosakeste-ravimikompleksid vähendasid iNOS-i, TNF- ja IL-1 ekspressiooni luuüdist pärinevates makrofaagides. Nad eeltöötlesid oma rakke nanoosakeste ravimiga enne LPS-iga stimuleerimist, meie aga enne D-Tesaga töötlemist LPS-iga, mis võib olla põhjus, miks me ei täheldanud TNF- ja IL-i -1 vähenemist, kuigi me täheldasime ka iNOS-i ekspressiooni vähenemine.

Järeldus

Praegu puudub paljude neurodegeneratiivsete haiguste jaoks patoloogiat muutev ravi ning kuna elanikkond kasvab jätkuvalt, kasvab nende haiguste levimus ja ravikulud jätkuvalt, mis rõhutab tungivat vajadust lahenduse väljatöötamise järele. Hiljuti on põletikueelsed M1 mikroglia kriitilised mitmete neurodegeneratiivsete haiguste patoloogias.

Seejärel on võime toimetada ravimit läbi hematoentsefaalbarjääri, mis võib indutseerida mikrogliia fenotüübi nihet M1-le M2-le, terapeutiliselt potentsiaalselt kombineeritud haigusi, eriti Alzheimeri ja Parkinsoni tõbe.

D-Tesa loodi M1 kuni M2 indutseeriva ravimi viimiseks mikrogliiasse pärast süsteemset manustamist, et vähendada neurotoksiliste ainete mikrogliia sekretsiooni, indutseerides samal ajal põletikuvastase seisundi, mis suurendab patogeensete valkude lagunemist ja fagotsütoosi ajus. Sünteesisime edukalt D-Tesa, kasutades ülitõhusat klikikeemia lähenemisviisi.

Ravim kinnitub dendrimeri külge estersideme kaudu, mis on lüsosomaalsetes tingimustes rakusiseselt lõhustuv, kusjuures ligikaudu 60% Tesast vabaneb esimese 48 tunni jooksul lüsosomaalsetes tingimustes.

Näidati, et D-Tesa ületas Tesa in vitro M1-M2a/M2b/M2c-fenotüübi nihke, mille tulemuseks oli lämmastikoksiidi eritumise vähenemine, sünukleiini ja amüloidi lagundavate ensüümide ekspressiooni suurenemine ning amüloidi fagotsütoosi suurenemine.

Seega ühendab D-Tesa dendrimeri kasulikud tarneomadused Tesa M1-M2-lülitusomadustega. Mikrogliia ühise rolli ja M1-M2 fenotüübi nihke esilekutsumise ühise terapeutilise kasu tõttu on D-Tesa potentsiaal ravida paljusid neuroloogilisi häireid, kui seda manustatakse haiguse progresseerumise õiges staadiumis.

Autorite kaastööd

LD, AS, KL, RS, SK ja RMK kontseptualiseerisid katsed. LD, AS ja RS viisid läbi dendrimeeri ja ravimi konjugaadi sünteesi ja iseloomustamise. LD, KL ja JJ viisid läbi rakukatsed. LD ja K. L. tegi statistika. LD ja AS kirjutasid käsikirja ning kõik autorid toimetasid käsikirja.

Huvide konfliktid

RMK ja SK on kaasleiutajad hüdroksüülotsaga dendrimeeri kasutamisel neuroloogiliste haiguste korral mikrogliiale sihipäraseks manustamiseks, samuti patendid, mis on seotud käesolevas artiklis kirjeldatud dendrimeeritehnoloogiaga.

Nad on Ashvattha Therapeuticsi, Orpheris Inc. ja RiniSight Inc. kaasasutajad, mis on platvormi kliinilist arendust juhtivad ettevõtted. SK ja RMK on AshvatthaTherapeutics Inc juhatuse liikmed. RS töötab praegu ettevõttes AshvatthaTherapeutics ja omab ettevõtte aktsiaid; töö R. S. esines selle paberi jaoks enne Ashvatthaga liitumist. Huvide konflikti haldab JohnsHopkinsi ülikool.

Tänuavaldused

Soovime tänada Elizabeth Smith Khouryt in vitro katsete kasulike arutelude eest. Seda projekti rahastas JohnsHopkinsi ja NICHD (grandi number HD076901) (RMK) Patz Distinguished Professorship Foundation. Täname Wilmeri põhitoetust nägemisuuringute, mikroskoobi ja põhimooduli jaoks (toetuse number EY001865) Sony voolutsütomeetrile juurdepääsu eest.

Täname Servier Medical Artsi oma pildikogu (http://smart.servier.com/) kasutamise eest, mis on litsentsitud Creative Common Attribution 3 alusel.0 GenericLicense, mida muudeti, et muuta graafiline abstraktne.

Viited

1 CL Gooch, E. Pracht ja AR Borenstein, The burden ofneurological disease in the United States: A summaryreport and call to action, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf ja K. Zhong, Alzheimeri tõve ravimite väljatöötamise torujuhe: vähe kandidaate, sagedased ebaõnnestumised, Alzheimeri res. Seal., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng ja J.-S. Kang, Alzheimeri tõve hüpoteeside ja kliiniliste uuringute ajalugu ja käik, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto ja S. Pritzkow, Valkude väärvoltimine, agregatsioon ja konformatsioonitüved neurodegeneratiivsetes haigustes, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry ja C. Holmes, Microglial priming in neurodegenerative disease, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang ja W. Le, Differential Roles of M1 and M2Microglia in Neurodegenerative Diseases, Mol. Neurobiol., 2016, 53, 1181–1194.

7 MW Salter ja B. Stevens, Microglia tõusevad ajuhaiguste keskseteks osapoolteks, Nat. Med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann et al., The TREM2-APOE Pathway Drives the Transscriptional Phenotype of Dysfunctional Microglia in Neurodegenerative Diseases, Immunity, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao et al., Pioglitasooni antidepressandilaadsed toimed kroonilise kerge stressiga hiiremudelis on seotud PPAR-vahendatud mikrogliia aktivatsioonifenotüüpide muutumisega, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen et al., Mikrogliia polariseerimine M2-fenotüübile peroksisoomi proliferaatoriga aktiveeritud retseptori gamma-sõltuval viisil nõrgendab hiirte traumaatilisest ajukahjustusest põhjustatud aksonaalset vigastust, J. Neurotrauma, 2018, 30–2330.

11 W. Cai et al., Peroksisoomi proliferaatoriga aktiveeritud retseptor (PPAR): kesknärvisüsteemi vigastuste ja parandamise peaväravavaht, Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal et al., Glitasooni kasutamine seotud Parkinsoni tõve riski vähenemisega, Mov. Disord., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com