Kalatööstuse jääkidest saadud ekstraktide kosmeetiline potentsiaal: sardiinijäätmed ja tursa raamid, 1. osa

Abstraktne: Kalatööstus tekitab suures koguses jäätmeid (20–75 protsenti (w/w) kogu püütud kala massist). Bioaktiivsete ühendite kogumine jääkidest ja nende lisamine kosmeetikatoodetesse on paljulubav turuvõimalus ja võib aidata kaasa sektori jätkusuutlikule väärtustamisele. Selles töös iseloomustati sardiini (Sardina pilchardus) jäätmetest ja tursa (Gadus morhua) raamidest kõrgsurvetehnoloogiate (ülikriitiline CO2 ja subkriitiline vesi) abil saadud valgurikkaid ekstrakte nende kosmeetilise potentsiaali osas. Antioksüdantset, põletikuvastast ja antibakteriaalset toimet hinnati keemilise (ORAC test), ensümaatilise (elastaasi ja türosinaasi inhibeerimine), antimikroobse tundlikkuse (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus ja Cutibacterium acnes) ja rakupõhise (keratinotsüütides)-Haays analüüsi abil. . Sardiiniekstraktidel oli kõrgeim antibakteriaalne toime ja kõrgematel ekstraheerimistemperatuuridel (250 ◦C) ja ilma rasvatustamiseta saadud lõigul olid madalaimad minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) väärtused (1,17; 4,6; {{24} },59 mg/ml vastavalt K. pneumoniae, S. aureus ja C. acnes puhul). Madalamal temperatuuril (90 ◦C) ekstraheeritud tursaproovid olid kõige tõhusamad põletikuvastased ained (kontsentratsioon 0,75 mg/ml vähendas IL-8 ja IL-6 taset vastavalt 58% ja 47% võrra. , võrreldes positiivse kontrolliga). Treoniini, valiini, leutsiini, arginiini ja valgu kogusisaldus ekstraktides tõsteti esile, et need korreleerusid tugevalt teatatud bioaktiivsusega (R2 on suurem või võrdne 0,7). Need tulemused toetavad kalatööstuse jäätmete ekstraktide potentsiaalset kasutamist bioaktiivsete aktiivsusega kosmeetikatoodetes.

Tistanche glükosiid võib samuti suurendada SOD aktiivsust südame- ja maksakudedes ning oluliselt vähendada lipofustsiini ja MDA sisaldust igas koes, eemaldades tõhusalt erinevaid reaktiivseid hapnikuradikaale (OH-, H2O₂ jne) ja kaitstes tekitatud DNA kahjustuste eest. OH-radikaalide poolt. Tsistanche fenüületanoidglükosiididel on tugev vabade radikaalide eemaldamisvõime, suurem redutseerimisvõime kui C-vitamiinil, nad parandavad SOD aktiivsust sperma suspensioonis, vähendavad MDA sisaldust ja omavad teatud kaitset sperma membraani funktsioonile. Tsistanche polüsahhariidid võivad suurendada SOD ja GSH-Px aktiivsust D-galaktoosi poolt põhjustatud eksperimentaalselt vananevate hiirte erütrotsüütides ja kopsukudedes, samuti vähendada MDA ja kollageeni sisaldust kopsudes ja plasmas ning suurendada elastiini sisaldust. hea puhastav toime DPPH-le, pikendab hüpoksia aega vananevatel hiirtel, parandab SOD aktiivsust seerumis ja aeglustab eksperimentaalselt vananevatel hiirtel kopsude füsioloogilist degeneratsiooni Raku morfoloogilise degeneratsiooniga on katsed näidanud, et Cistanche'il on hea antioksüdantne võime ja sellel on potentsiaal olla ravim naha vananemishaiguste ennetamiseks ja raviks. Samal ajal on Cistanche ehhinakosiidil märkimisväärne võime eemaldada DPPH vabu radikaale ja see suudab eemaldada reaktiivseid hapniku liike ja takistada vabade radikaalide poolt indutseeritud kollageeni lagunemist, samuti on sellel hea parandav toime tümiini vabade radikaalide anioonide kahjustustele.

Klõpsake valikul Cistanche Tubulosa Supplement

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Märksõnad: kalajäätmete voogude väärtustamine; antioksüdantne aktiivsus; põletikuvastane toime; antimikroobne toime; vananemisvastane; hüperpigmentatsiooni vastane; kosmeetikatooted

1. Sissejuhatus

Pideva uuenduste otsimisega, eriti aktiivsete koostisosade osas, kasvab kosmeetikatööstus ja on näidanud kavatsust asendada naftast saadud komponendid, liikudes edasi looduslike ühendite poole [1]. Looduslike toimeainete antioksüdantsed omadused võivad aidata ennetada mitmeid oksüdatiivsest stressist ja vananemisest põhjustatud nahaprobleeme [2,3]. Naha vananemist võivad esile kutsuda nii sisemised (nagu põletik või telomeeride lühenemine) kui ka välised (keskkonnategurid) [4]. Naha vananemine põhjustab küpse kollageeni kadu ja rakuvälise maatriksi (ECM) muutusi, mis kahjustab barjäärifunktsiooni, mille tulemuseks on kuiv välimus ja vastuvõtlikkus väliste agressorite suhtes, mis suurendab nahahaiguste riski [5]. Seda protsessi võivad kiirendada mitmed ensüümid, nagu elastaasid, maatriksmetalloproteinaasid (MMP-d) ja hüaluronidaasid, mis võivad indutseerida ECM-i lagunemist [6], või isegi tsessiivsete reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) akumuleerumine, mis võib kahjustada normaalset raku funktsiooni. [7]. Keskkonnategurid, nagu kokkupuude UV-kiirgusega, põhjustavad suures koguses ROS-i teket, mis kutsub esile samasugused molekulaarsed ja rakulised reaktsioonid nagu sisemine vananemine, kuid võimendatud mõjuga. Oluline on see, et ROS võib intensiivistada naha vananemise või naha pigmentatsiooniprotsessidega seotud ensüümide aktiivsust [8,9] ja seega on antioksüdantide n olemasolul kosmeetikas oluline roll.

2018. aastal oli FAO hinnangul maailma kalatarbimine 20,5 kg pita kohta [10], mis toob kaasa suures koguses kõrvalsaadusi, peamiselt nahka ja luid. Tekkivad jäägid vastavad 20–75 protsendile (w/w) kogu püütud kala massist, mis võib põhjustada keskkonnaprobleeme [11,12]. Need jäägid sisaldavad siiski märkimisväärses koguses lipiide, valke ja mineraalaineid ning neid tuleks piisavalt väärtustada. Viimastel aastatel on kalatööstuses tekkinud jäätmete ekstraktidel ilmnenud sellised aktiivsed omadused nagu antihüpertensiivne, antioksüdatiivne, antimikroobne, neuroprotektiivne, antihüperglükeemiline, vananemisvastane ja põletikuvastane [13–19]. Atlandi tursk (Gadus rhea) ja sardiin (Sardina pilchardus) on ühed enim tarbitavad kalad Portugalis ning selle jääkidest pärinevad traktid on näidanud paljulubavat toitainepotentsiaali, nagu antioksüdantne, antiproliferatiivne või põletikuvastane toime [11,20–22]. Kuna aga kalatööstuse jäätmete kasutamine ja väärtustamine on alles varajases staadiumis, on palju ruumi, et uurida võimalusi, kuidas tööstus saaks muuta need jäätmed väärtuslikeks turubiotoodeteks, sealhulgas kosmeetikatoodeteks.

Eelmises töös uurisime kõrgsurvetehnoloogiate (ülikriitiline CO2 ja subkriitiline vesi) kasutamist, et eraldada sardiinijäätmetest ja tursakarjadest bioaktiivsed fraktsioonid, millel on paljutõotav kasu tervisele [11, 22]. Sardiinijäätmete puhul näitasime, et rakendades esimest etappi superkriitilise süsinikuga (ScCO2) (lipiidide fraktsiooni eemaldamiseks), millele järgnes ekstraheerimine subkriitilise veega (SW), oli võimalik saada kõrge antioksüdantse potentsiaaliga ja antiproliferatiivse toimega valgu hüdrolüsaate. kolorektaalse vähi rakud [22]. Alakriitilist vee ekstraheerimist/hüdrolüüsi rakendasime ka tursa raamidest valkude, peptiidide ja aminohapetega rikastatud ekstraktide saamiseks ning näitasime, et madalamad töötlemistemperatuurid (90 ◦C) soodustavad põletikuvastase potentsiaaliga ühendite ekstraheerimist inimese sooleepiteeli rakus. mudel [11]. Enamik tursa raamiekstraktides sisalduvatest valkudest on kollageen ja kollageeni fragmendid. Teised ühendid hõlmavad väikeses koguses lipiide, tuhka ja mõningaid suhkruid. Sardiiniekstraktid olid rikkad peptiidide ja aminohapete poolest ning sisaldasid ka lipiide, tuhka ja suhkruid. Kuna kalast pärinevad valgud ja peptiidid võivad muutuda kosmeetikatööstuse jaoks oluliseks ressursiks, on käesoleva uuringu eesmärk täiendavalt hinnata nende kalatöötlemisjäätmetest ja kõrvalsaadustest saadud ekstraktide aktiivset potentsiaali, mis on tingitud nende kosmetseutilise potentsiaali hindamisest [23]. . Sel eesmärgil rakendati mitmesuguseid keemilisi, ensümaatilisi ja rakupõhiseid analüüse, et uurida ekstraheeritud proovide antioksüdante, vananemisvastaseid, hüperpigmentatsioonivastaseid, põletikuvastaseid ja antimikroobseid toimeid. Samuti viidi läbi korrelatsiooniuuringud, et tuvastada peamised kosmeetilise potentsiaaliga bioaktiivsed koostisosad.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Reaktiivid

3,4-dihüdroksü-l-fenüülalaniin (L-DOPA), seente türosinaas, sea pankrease elastaas (PPE) tüüp III, N-suktsinüül-Ala-Ala-Ala-p-nitroaniliid (AAAPVN), Tris ({ {11}}amino- 2-hüdroksümetüülpropaan-1, 3-diool), 2,20 -asobis(2-metüülpropaanamidiin)divesinikkloriid (AAPH) ja 20 ,70 -diklorofluorestseiindiatsetaati (DCFH-DA) osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaltsiumisisaldusega Mueller Hintoni puljong (CAMHB) osteti ettevõttest BD (Sparks, MD, USA). Aju-südame infusioon (BHI) osteti firmalt Avantor (Radnor, PA, USA). AnaeroGen™ Compact kotikesed osteti firmalt Oxoid (Hampshire, UK). PrestoBlue™, Dulbecco modifitseeritud kotkasöötme (DMEM), kuumaga inaktiveeritud veiseloote seerum (FBS) ja penitsilliini-streptomütsiin saadi ettevõttest Invitrogen (San Diego, CA, USA). Inimese immortaliseeritud mittekasvajaline keratinotsüütide rakuliin HaCaT saadi ettevõttest Cell Line Service (Eppelheim, Saksamaa). Inimese IL-8 ja IL-6 Mini TMB ELISA arenduskomplektid saadi firmalt Peprotech (London, Ühendkuningriik). Kõik teised käesolevas uuringus kasutatud reaktiivid ja lahustid olid analüütilise kvaliteediga ja ostetud saadaolevatelt tarnijatelt.

2.2. Näidised

Selles töös kasutati väljavõtteid, mis on välja töötatud meie varasemates protsesside optimeerimisele keskendunud uuringutes [11,22]. Lühidalt, tursa raamid tarnisid Pascoal ja Filhos SA (Gafanha da Nazaré, Portugal) ning need koosnesid kala selgroost ja kleepunud lihasest. Peadest, ogadest ja siseelunditest valmistatud sardiinijäätmed tarnis Conservas A Poveira SA (Póvoa de Varzim, Portugal). Kasutatud toorainete ligikaudne koostis on toodud meie varasemates töödes [11,22]. Tursa raamide peamised komponendid olid valk (47 massiprotsenti) ja tuhk (39 massiprotsenti), väheses koguses lipiide ja süsivesikuid (vastavalt 2 massiprotsenti ja 0,3 massiprotsenti). On leitud, et kollageen on tursa raamides peamine valk ja sel juhul moodustab see ca. 65 protsenti algjäätmete kogu valgusisaldusest. Seevastu sardiin on õline kala, seega on selle jäätmed palju lipiidirikkamad kui tursa raamid. Sardiinijäätmete lipiidide sisaldus oli 26 massiprotsenti ja valgusisaldus 52 massiprotsenti, ülejäänu oli tuhk (17 massiprotsenti) ja süsivesikud (3 massiprotsenti).

Selle töö jaoks valitud ekstraktid tursa raamidest (Cf1, Cf2, Cf3 ja Cf4) ja sardiinijäätmetest (S1, S2 ja S3) saadi kõrgsurvetehnoloogia abil laborimõõtkavas aparaadis, nagu eelnevalt kirjeldatud [11,22 ,24], kasutades tabelis 1 kokku võetud tingimusi. Lühidalt, 60 g jahvatatud tursa raame või sardiinijäätmeid (rasvasttustatud või rasvatustatud) laaditi kõrgsurvereaktorisse, mis pandi ahju. Veepump lülitati sisse soovitud voolukiirusel (ca 10 ml/min) ja rõhk seati 100 baarile. Niipea, kui rõhk saavutas selle väärtuse, lülitati elektriahi sisse ja katse algas. Erinevaid ekstrakte koguti 30 minutit erinevatel temperatuuridel (90–250 ◦C). S1 ja S3 ekstraktid saadi pärast sardiinijäätmete rasvatustamist ScCO2-ga enne SW ekstraheerimist. Subkriitilisi vee ekstraheerimise katseid dubleeriti. Iga ekstraheeritud proovi kohta võeti kolmes eksemplaris 25 ml, lüofiliseeriti ja kaaluti vastava ekstraheerimissaagise arvutamiseks. Analüütilised andmed – valgusisaldus – on väljendatud kolme korduse keskmisena ± standardhälbe (SD). Teavet nende ekstraktide iseloomustamise kohta valgusisalduse, aminohapete profiili, peamiste mineraalsete ühendite või toksiliste ja raskmetallide osas on kirjeldatud meie varasemates töödes [11,22].

Cf1, Cf2, Cf3, Cf4 ja S2 põhilahused valmistati Milli-Q H2O-s kontsentratsiooniga 100 mg/ml. Teised proovid, nimelt S1 ja S3, lahustati DMSO-s (vastavalt 300 ja 550 mg/ml) nende madalama vees lahustuvuse tõttu. Proovid külmutati ja hoiti kuni edasise kasutamiseni temperatuuril –20 ◦C. Rakuliste analüüside jaoks steriliseeriti proovid eelnevalt kuumaga (121 °C, 15 min) autoklaavis (Tuttnauer 3870 el, Breda, Holland).

2.3. Hapnikuradikaalide neeldumisvõime (ORAC) test

ORAC test viidi läbi, et hinnata proovide antioksüdantset võimet peroksüülradikaalide (ROO• ) suhtes, järgides Huangi et al. välja töötatud meetodit. [25], mõningate kohandustega, nagu varem teatatud [26]. Lühidalt, mustal 96-süvendiga mikroplaadil lisati 25 µL proovilahjendustele 150 µL dinaatriumfluorestseiini (0,3 µM) ja inkubeeriti 10 minutit temperatuuril 37 °C. Seejärel käivitati reaktsioon 25 µl 2,20 - asobis(2-amidinopropaan)divesinikkloriidi (AAPH, 153 mM) ja fluorestsentsi (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20) lisamisega. nm) mõõdeti 40 minutit temperatuuril 37 °C FLx800 fluorestsentsmikroplaadilugejas (FL800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Standardkõver valmistati, kasutades 5, 10, 20, 30 ja 40 µM (6-hüdroksü-2,5,7,8-tetrametüülkromaan-2- karboksüülhapet (Trolox) )). Kõik lahused valmistati fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), 75 mM, pH 7,4. Tulemused on väljendatud Troloxi ekvivalentse antioksüdantse mahu mikromoolides ekstrakti grammi kohta (µmol TEAC/g ekstrakti).

2.4. Ensümaatilised analüüsid

2.4.1. Elastaasi inhibeerimise test

See analüüs põhines Wittenaueri jt tööl. [27] mõningate muudatustega, nagu eelnevalt kirjeldatud [6]. Elastaasi inhibeeriv aktiivsus määratakse spektrofotomeetrilise meetodiga, kasutades sigade pankrease elastaasi (PPE) ja ensüümi substraadina N-suktsinüül-Ala-Ala-Ala-p-nitroaniliidi (AAAPVN), jälgides p-nitroaniliini vabanemist 41 °C juures. {19}} nm. PPE lahustati 100 mM Tris (2-amino-2-hüdroksümetüülpropaan-1,3-diool)-HCl puhvris (pH)=8.0) kontsentratsioonini 1 mg/ml ja säilitatakse alikvootidena temperatuuril 20 ◦C. Analüüsi päeval võeti alikvoot ja lahjendati puhvris kontsentratsioonini 0,03 U/mL, 10 µL laaditi mikrotiiterplaatide süvenditesse koos 100 µL Tris-HCl puhvriga ja 30 µL. igast proovist. Pärast 20-minutilist eelinkubeerimist 25 °C juures käivitati reaktsioon 40 µl substraadi AAAPVN (0,55 mM) lisamisega. Neeldumist mõõdeti 20 minutit pärast AAAPVN lisamist BioTek Instruments EPOCH 2 spektrofotomeetri mikroplaadilugejaga. Arvutused tehti valemis (1) kirjeldatud viisil, kus A kontroll ja Asample esindavad vastavalt neeldumist lainepikkusel 410 nm proovi puudumisel või kohalolekul. Kuna proovide S1 ja S3 lahustamiseks kasutati DMSO-d, testiti ka seda lahustit ja kasutati nende proovide kontrollina. Ekstraktide potentsiaali elastaasi inhibeerida hinnati kasvavate kontsentratsioonidega, et määrata annusest sõltuvad seosed ja määrata poole maksimaalsest inhibeerivast kontsentratsioonist (IC50), mis näitab iga proovi võimet inhibeerida ensümaatilise aktiivsuse 50 protsendi ulatuses.

Kõik tulemused on väljendatud IC50 keskmiste väärtustena 95-protsendilise usaldusvahemiku alumise ja ülemise piiriga, mis on saadud vähemalt kolmest sõltumatust katsest.

2.4.2. Türosinaasi inhibeerimise test

Ekstraktide türosinaasi inhibeerivat potentsiaali hinnati spektrofotomeetriliselt, kasutades substraadina seene türosinaasi ja L-DOPA-d [28]. Türosinaas muudab L-DOPA dopakinooniks, mis tsükliseerub järjestikku, moodustades dopakroomi. Dopakroomi moodustumist saab jälgida neeldumise mõõtmisega 475 nm juures. Substraat lisati ensüümile proovi lahjenduste juuresolekul lõppkontsentratsioonini 30 U/mL türosinaasi ja 2,5 mM L-DOPA-d. Kuna proovide S1 ja S3 lahustamiseks kasutati DMSO-d, testiti ka seda lahustit ja kasutati nende proovide kontrollina. Pärast 30-minutilist inkubeerimist 37 °C juures mõõdeti neeldumist 475 nm juures BioTek Instruments EPOCH 2 mikroplaadi spektrofotomeetriga. Kõik reagendid valmistati naatriumfosfaatpuhvris (SPB; 0,1 M, pH 6,8), valmistati naatriumfosfaadi dihüdraadi ja naatriumfosfaadi monohüdraadi segamisel ning arvutused tehti valemis (1) kirjeldatud viisil. Kõik tulemused on väljendatud IC50 keskmiste väärtustena 95-protsendilise usaldusvahemiku alumise ja ülemise piiriga, mis on saadud vähemalt kolmest sõltumatust katsest.

2.5. Antimikroobse tundlikkuse testimine

Antibakteriaalse aktiivsuse analüüside jaoks valitud sihtmikroorganismid olid gramnegatiivsed bakterid Klebsiella pneumoniae CECT 8453 ja grampositiivsed bakterid Staphylococcus aureus ATCC 6538 ja Cutibacterium acnes ATCC 6919T. K. pneumoniae CECT 8453 ja S. aureus ATCC 6538 puhul viidi analüüsid läbi CLSI M07-A10 juhiste puljongi mikrolahjenduse meetodil, nagu on eelnevalt kirjeldanud Rodrigues et al. [29]. Lühidalt öeldes jaotati ekstrakti põhilahused ümarapõhjalisele mikrotiiter-{10}}süvendiga plaadile ja lahjendati 2-kordiliselt kaltsiumiga reguleeritud Mueller Hintoni puljongis (CAMHB; BD, Sparks, MD, USA), et saada lahuste kontsentratsioonivahemik. Inokulaadi valmistamiseks kasutati kasvumeetodit, et saada soolalahuses homogeenne suspensioon. Kohandatud inokulaadi lahjendati täiendavalt CAMHB-s, et tagada, et pärast inokuleerimist sisaldas iga süvend umbes 5 × 104 CFU-d. Plaate inkubeeriti aeroobsetes tingimustes 37 °C juures 16 kuni 20 tundi. C. acnes'e puhul viidi analüüsid läbi nagu eelnevalt kirjeldatud, kasutades CAMHB asemel aju-südame infusiooni (BHI) (Avantor, Radnor, PA, USA) puljongit ja inkubeerides mikrotiiterplaate 70–74 tundi temperatuuril 37 ◦ C anaeroobsetes purkides, mis sisaldavad atmosfääri tekitamise süsteemi AnaeroGen™ Compact (Oxoid, Hampshire, UK).

Iga analüüsitud põhilahuse jaoks on positiivne kontroll (CAMHB või BHI ja lahjendatud inokulaat), keskmise steriilsuse kontroll (nakatamata CAMHB või BHI) ja ekstrakti steriilsuse kontroll (nakatamata 2-kordne ekstrakti põhilahus CAMHB-s või BHI-s) teostati vastavalt. Minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) väärtused olid proovi madalaim kontsentratsioon, mis inhibeeris nähtavalt mikroobide kasvu pärast inkubeerimist. Vajadusel kinnitati MIC väärtused, kasutades rakkude elujõulisuse reagenti PrestoBlue™ (Invitrogen, San Diego, CA USA), järgides tootja juhiseid. Samuti määrati kindlaks täiendav MIC väärtus, tähisega MIC*, mis määratleti proovi madalaima kontsentratsioonina, mille juures oli bakterite kasvu visuaalselt ja erinevalt mõjutatud võrreldes positiivse kontrolliga. Minimaalse bakteritsiidse kontsentratsiooni (MBC) väärtused esitati proovi madalaima kontsentratsioonina, mis viis elujõuliste bakterite arvu vähenemiseni vähemalt 99,9 protsenti võrreldes esialgse inokulaadiga ja võrdse inkubatsiooniaja jooksul. Tulemused väljendati kolme bioloogilise korduse järel saadud väärtuste mediaanina. Kuna proovide S1 ja S3 lahustamiseks kasutati DMSO-d, testiti ka seda lahustit, et tagada, et kasutatud lõppkontsentratsioon ei mõjutaks sihtmikroorganismi, seega ka analüüsi.

2.6. Rakupõhised analüüsid

2.6.1. Rakukultuur

Inimese keratinotsüütide rakuliini HaCaT (CLS, Saksamaa) kultiveeriti standardses Dulbecco modifitseeritud Eagle söötmes (DMEM), millele oli lisatud 10% (maht/maht) veiseloote seerumit (FBS) ja 1% (maht/maht) penitsilliini-streptomütsiini. Rakke hoiti tavapäraselt monokihtidena 75 cm2 kultiveerimiskolbides ja inkubeeriti temperatuuril 37 °C 5% CO2-ga niisutatud atmosfääris.

2.6.2. In vitro tsütotoksilisus

Tsütotoksilisuse analüüsid viidi läbi vastavalt varasematele töödele [6]. Lühidalt, HaCaT rakud külvati 96 süvendiga plaatidele tihedusega 1,4 × 10 5 rakku/cm2. 3 päeva pärast inkubeeriti rakke iga proovi erineva kontsentratsiooniga (Cf1; Cf2; Cf3; Cf4; S2-50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, {{30} },78, 0,39; S1–3, 1,5, 0,75, 0,38, {{40}},19, {{51 }}.09, 0.05, 0.02; S3 — 5,5, 2,75, 1,38, 0,69, 0,34, 0,17, 0,09, 0,04 mg/ml), mis on lahjendatud söötmes (DMEM sööde, mis sisaldab 0,5 protsenti FBS-i). Kontrollina kasutati süvendeid, mis sisaldasid rakke, mida inkubeeriti ainult 0,5% (maht/maht) FBS-iga täiendatud söötmega. Lahusti toksilisuse välistamiseks viidi läbi ka lahustikontrollid 50% vee või 1% DMSO-ga söötmes. Pärast 24-tunnist inkubeerimist hinnati rakkude elujõulisust kasutades PrestoBlue® (5 mahuprotsenti kultuurisöötmes) 2 tundi temperatuuril 37 °C, 5% CO2, vastavalt tootja juhistele. Pärast seda mõõdeti iga süvendi fluorestsentsi (Ex./Em. 560 ± 20/590 ± 20 nm) FLx800 fluorestsentsmikroplaadi lugejas (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Rakkude elujõulisust väljendati elujõuliste rakkude protsendina kontrollist. Kolm sõltumatut katset viidi läbi kolmes eksemplaris.

2.6.3. Rakuline antioksüdantne aktiivsus

Rakkude antioksüdantset aktiivsust hinnati eelnevalt kirjeldatud meetoditega [6,30], mõningate muudatustega. Lühidalt öeldes külvati HaCaT rakud tihedusega 1,4 × 105 rakku/cm2 96 süvendiga plaatidele ja rakusisese ROS-i moodustumist jälgiti, kasutades 20,70 -diklorofluorestseiindiatsetaati ( DCFH-DA) fluorestsentssondina. 72 tundi pärast külvamist pesti rakke PBS-ga ja inkubeeriti 1 tund proovide mittetoksiliste kontsentratsioonidega (0,1875 mg/ml; 0,375 mg/ml; 0,75 mg/ml) pluss 25 uM DCFH-DA-ga PBS-is. Seejärel pesti rakke uuesti PBS-ga ja inkubeeriti stressi indutseerijaga (600 uM AAPH PBS-is) 1 tund. Pärast seda mõõdeti fluorestsentsi mikroplaadi fluorestsentsilugejas FL800 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 nm). Tulemused on väljendatud ROS protsendina töötlemata kontrolli (DCFH-DA ja AAPH-ga töödeldud rakud) suhtes. Kolm sõltumatut katset viidi läbi kolmes eksemplaris.

2.6.4. IL-6 ja IL-8 sekretsiooni hindamine

Katsed viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [31], mitme modifikatsiooniga. Lühidalt, HaCaT rakud külvati 12 süvendiga plaatidele tihedusega 1 × 1 0 5 rakku/cm2. 3 päeva pärast stimuleeriti rakke 15 µg/ml Escherichia coli lipopolüsahhariididega (LPS) ja inkubeeriti koos iga ekstrakti kolme erineva kontsentratsiooniga ({{10}},1875 mg/mL; {{) 14}},375 mg/ml; 0,75 mg/ml), mis on lahjendatud söötmes (DMEM sööde, mis sisaldab 0,5 protsenti FBS-i). Ainult LPS-iga inkubeeritud rakke ja ainult söötmega inkubeeritud rakke kasutati vastavalt positiivse ja negatiivse kontrollina. 24 tunni pärast koguti supernatandid, tsentrifuugiti 10 minutit 2000 g juures ja säilitati kuni edasise analüüsini temperatuuril –80 ◦C. IL-6 ja IL-8 tasemeid hinnati ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsiga (ELISA), kasutades kaubanduslikult saadavaid komplekte (PeproTech; London, UK) vastavalt tootja juhistele, neeldumist mõõdeti lainepikkusel 450 nm. lainepikkuse korrektsiooniga 620 nm mikroplaadi spektrofotomeetris (EPOCH 2, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Tulemused on väljendatud IL-6 või IL-8 protsendina positiivse kontrolli (LPS-ga stimuleeritud rakud) suhtes. Kolm sõltumatut katset viidi läbi kolmes eksemplaris.

2.7. Statistiline analüüs

ORAC ja rakupõhise analüüsi tulemused on väljendatud keskmise väärtusena ± SD, mis on saadud vähemalt kolmest sõltumatust katsest. Ensümaatiliste ja tsütotoksilisuse analüüside jaoks määrati IC50 väärtused annuse-vastuse kõveratest log10 graafikute kaudu, kasutades programmi GraphPad Prism 8.4.3. tarkvara (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Tulemused on esitatud IC50-na 95-protsendilise usaldusvahemikuga. Tulemuste statistiline analüüs viidi läbi endise tarkvara abil. Kui kontrolliti homogeenset dispersiooni ja andmete normaaljaotust, analüüsiti tulemusi ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes mitme võrdluse jaoks Tukey test. Heterogeensete dispersioonide korral või kui andmed ei olnud normaalselt jaotunud, viidi läbi sobiv paaritu Studenti t-test, et teha kindlaks, kas keskmised olid oluliselt erinevad. Kõigil juhtudel loeti statistiliselt oluliseks p-väärtust Väiksem või võrdne 0,05. Antimikroobse tundlikkuse testimise tulemused on väljendatud mediaanväärtusena, mis on saadud vähemalt kolmest sõltumatust katsest.

3. Tulemused ja arutelu

This study aims to investigate the cosmeceutical potential of protein-rich extracts that were produced by high-pressure technologies from fishery industry wastes, namely sardine wastes and codfish frames [11,22]. The selection of extracts was based on previous results regarding their characterization and process conditions. For codfish, all extracts were selected aiming at evaluating the impact of the extraction temperature on the recovery of compounds with promising bioactive effects on the skin. For sardine extracts, only three extracts derived from both defatted and non-defatted raw materials, processed at higher temperatures (190  and 250 ◦C) and with the highest extraction yield (>valiti 45,7 g/100 g). Iga ekstrakti koguvalgusisalduse tulemused on esitatud tabelis 1.

3.1. Antioksüdandid, vananemisvastased ja hüperpigmentatsioonivastased tegevused

Ekstraktide võimalikku kosmeetilist toimet uuriti algselt keemiliste ja ensümaatiliste testidega, et hinnata nende antioksüdantset, vananemisvastast ja hüperpigmentatsioonivastast toimet. Antioksüdandi võimekuse jaoks valiti ORAC-test, kuna see mõõdab proovide võimet eemaldada bioloogiliselt olulisi ROS-i, nimelt peroksüülradikaale, mida peetakse üheks peamiseks naha vananemise indutseerijaks [2,32]. Vananemisvastast toimet hinnati ka elastaasi inhibeerimise kaudu, kuna väidetavalt vastutab see ensüüm elastiini ja teiste ECM-valkude lagunemise eest [6]. Hüperpigmentatsioonivastase toime saavutamiseks kasutati türosinaasi testi, et hinnata proovide võimet inhibeerida melaniini tootmist. Tabel 2 võtab kokku kõigi ekstraktide ORAC ja IC50 väärtused.

Meie tulemused näitavad, et sardiini- ja tursaekstraktidel oli antioksüdantne toime ja inhibeeriv toime elastaasi ja türosinaasi ensüümide aktiivsusele. Sardiiniproovide hulgas oli S1 kõrgeim ORAC väärtus (1,94 ± 0,08 µmol TEAC/mg ekstrakti), millele järgnesid S3 ja S2. Need tulemused pärinevad varasemast antioksüdantide hindamisest, kasutades alternatiivset meetodit (2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüül-DPPH test), kus ekstraktil S1 olid madalaimad IC50 väärtused [22]. S1 proovi suurem puhastusvõime peroksüülradikaalide suhtes võib tuleneda ekstraktides esinevatest erinevate aminohappejärjestustega peptiididest, kuna nendevahelised interaktsioonid võivad mõjutada radikaalide eemaldamise võimet [33]. Lisaks võivad Maillardis või muudes termooksüdatsioonireaktsioonides tekkinud ühendid mõjutada proovide antioksüdantset aktiivsust [34]. Vaatamata madalaimale ORAC väärtusele olid proovid S2 ja S3 need, millel oli vastavalt suurim võime inhibeerida türosinaasi ja elastaasi aktiivsust.

Tursaekstraktidest oli Cf4 kõrgeim antioksüdant ja antihüperpigmentatsiooni aktiivsus. Ekstraktide SEC-GPC analüüs näitas, et ekstraheerimistemperatuuri tõstmisel kuni 250 ◦C saadi kahaneva molekulmassiga peptiidid [11]. Selle proovi elastaasi inhibeerimisvõime jääb teiste Cf ekstraktide, nimelt Cf1 ja Cf3 väärtuste vahemikku. Kuid testitud kontsentratsioonide puhul ei näidanud need kaks ekstrakti türosinaasi inhibeerivat toimet.

Kirjanduses on mõned aruanded näidanud, et mere kõrvalsaaduste ekstraktidel on oluline antioksüdantne toime ja türosinaasi pärssimine. Näiteks on leeliselise hüdrolüüsi teel mere (Scophthalmus maximus) kõrvalsaadustest saadud ekstraktid näidanud antioksüdantset aktiivsust, mis on saavutatud erinevate keemiliste testidega: 1,1-difenüül-2- pikrüülhüdrasüüli (DPPH) radikaalide püüdmise võime ( 36,12 protsenti kontrolli kohta), ABTS (2,20 -asinobis-(3-etüülbensotiasoliin-6-sulfoonhape) meetod (12,81 µg BHT/mL) ja krotsiini pleegitamise test (8.{101} {28}}3 µg Trolox/mL) [35] Teises uuringus näitas maarjasoolatud meduuside (Lobonema smithii) ensümaatiline ekstraheerimine kõrge antioksüdantse aktiivsusega hüdrolüsaate (IC{{20}}). 9 mg/mL ABTS e DPPH analüüside jaoks) ja türosinaasi inhibeerivat potentsiaali, IC50 väärtused jäävad vahemikku 14,1–24,5 mg/mL [36], mis on samas suurusjärgus selles töös saadutega. Lisaks saadi sarnaste antioksüdantide väärtustega ekstrakte (ORAC väärtused – 0,4 kuni 3,5 µmol TEAC/mg ekstrakti) teist tüüpi toiduainetööstuse jääkidest, nimelt veinivalmistamise jäätmevoogudest [6]. Nendel veinitehase jääkide ekstraktidel oli aga suurem türosinaasi (IC50 4,0–0,14 mg ekstrakti/ml) ja elastaasi (IC50 3,4–0,1 mg ekstrakti/ml) inhibeerimisvõime kui selles töös saadud, tõenäoliselt fenoolsete ühendite olemasolu tõttu. millel on teadaolevalt mitu bioaktiivsust. Oluline on mainida, et oma uuringus kasutasime ekstraktide hüperpigmentatsioonivastase toime skriinimiseks seene türosinaasi, kuna seda ensüümi on laialdaselt kasutatud suure läbilaskevõimega testides [37]. Sellegipoolest, kuna selle ensüümi sarnasuse ja homoloogia kohta imetaja/inimese türosinaasiga [38–40] on mõningaid vaidlusi, tuleks sardiini- ja tursaekstraktide võimaliku hüperpigmentatsioonivastase toime hindamiseks kaaluda imetajate rakuliinidega seotud tulevasi uuringuid.

Et teha kindlaks, millised ühendid võivad olla vastutavad ekstraktide bioaktiivse vastuse eest, viidi läbi bioaktiivsuse andmete ja varem teatatud ekstraktide aminohappekoostise vahelised korrelatsiooniuuringud [11, 22] (tabel S1). Antioksüdantse aktiivsuse puhul saadi kõigi ekstraktide puhul kõrgeim korrelatsioon (R2 suurem või võrdne 0,7) ORAC-i väärtuse ja treoniini üldsisalduse, vaba valiini ning vaba ja üldleutsiini vahel. Sardiiniproovide puhul saadi kõrge korrelatsioon (R2 on suurem või võrdne 0,94) vaba ja kogu trüptofaani sisalduse osas. Sellest tulenevalt on varem teatatud, et kõigil neil aminohapetel on mitmes mudelisüsteemis antioksüdantsed omadused [41–43]. Elastaasi ja türosinaasi inhibeeriva toime puhul saadi kõrgeimad korrelatsioonikoefitsiendid (R2 suurem või võrdne 0,8) vastavalt valgu üldsisalduse ja vaba arginiini kohta, mis viitab sellele, et neil ühenditel võib olla oluline roll kalatööstuse jäätmevoogude ekstraktide vananemis- ja hüperpigmentatsioonivastane toime.

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】