Inimese loote ja perinataalsete amnionivedeliku tüvirakkude sekretoompreparaatide põhjalik profileerimine

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Lisaks on joonistel fig 5B ja 6B kujutatud tulpdiagrammide põhjal märgatav valkude eristav jaotus vastavalt sekreteerivate rakkude hüpoksilisele eelkonditsioneerimisele. Sel juhul teatati täieliku teabe saamiseks ka valkudest, mis ei ületa DAve ja DCI komplekti läve. Loote sekretoomi tulemused on rikastatud 60 kDa soojusšokivalguga (HSPD1, joonis 5B, vasak paneel) selle hüpoksilises koostises, samas kui perinataalsel vastel on kõrge ekspressiooniga silelihasrakkude kontraktiilne müosiini reguleeriv [52] kerge polüpeptiid 9 (MYL9, joonis). 5B, parem paneel). Näib, et oluline osa gestatsioonifaaside erinevusest sõltub rohkem hAFS-i hüpoksilisest eelkonditsioneerimisest. elektriautod; Leiti, et hüpoksiliste rakkude praimimisel saadud f-have-EV-d on rikastatud selliste teguritega nagu Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), Laminiini subühik -5 ja -1(LAMA5 ja LAMB1), trombospondiin{17 }} (THBS1, joonis 6B, vasak paneel). Hüpoksilised p-hAFS-EV-d sisaldasid ferritiini rasket ahelat (FTH1), karkassvalke nagu Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), anneksiin A6 (ANXA6), Rab SKT dissotsiatsiooni inhibiitor beeta (GDI2) ja Thy. -1 membraani glükoproteiin (THY1), neuropiliin-1(NRP1) ja maatriksi metalloproteiin 14 (MMP14, joonis 6B, parem paneel).

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

F-hAFS-is leiti valke sagedusega vähemalt 2 igas uuritud seisundis. EV-sid ja p-hAFS-EV-sid võrreldi veelgi Vesciclepedia andmebaasiga [53]. Nagu oodatud, on enamikku tuvastatud valkudest (96 protsenti) varem kirjeldatud võrdlusandmebaasis EV-des ja eksosoomides (joonis S3A).cistanche eelisedSellega seoses viidi läbi geeniontoloogia (GO) rikastamise analüüs FunRichi abil [54]. GO terminite arvukust andmekogumis võrreldi nende loomuliku kogusega võrdlusandmebaasis, et leida statistiliselt üleesindatud valkude rühmad vastavalt nende osalemisele bioloogilistes protsessides, molekulaarses funktsioonis ja rakulistes komponentides (viimase aspekti puhul ei ole andmeid). näidatud, kuid saadaval nõudmisel). Seoses tuvastatud valkudega seotud molekulaarsete funktsioonide analüüsiga näitasid hAFS-CM fraktsioonid rakuvälise maatriksi ja tsütoskeleti struktuurse komponendi rikastumist, tsütoskeleti valkudega seondumist ja struktuurse molekuli aktiivsust (joonis S2), samas kui hAFS-EV-sid rikastati struktuurse struktuuriga. tsütoskeleti ja ribosoomi, DNA ja RNA sidumise ning GTPaasi ja chaperooni siduvate tegurite koostisosa (joonis S3C).

Nii hAFS-CM kui ka have-EV-de bioloogiliste protsesside rikastamise analüüs näitas, et suurem osa loote- ja perinataalsetes hAFS-i sekretoome fraktsioonides moduleeritud valkudest kuulub rakkude kasvu / säilitamise ja valkude metabolismi (joonised 5C ja 6C). HAFS-EV-de puhul märkasime, et mõiste "rakuvälise maatriksi struktuursed koostisosad" seostati eranditult hüpoksiliste f-hAF-EV-dega; terminid "kaltsiumioonide sidumine" ja "struktuurne molekulaarne aktiivsus" rikastati peamiselt hüpoksilistes f-hAFS-i ja p-hAFS-i proovides (joonis S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I ja DCI (diferentsiaalväljendi usaldusväärsus) I5I-st suurem või sellega võrdne läbisid filtrid ja neid loeti erinevalt väljendatuks; teatatud valkude täieliku loetelu ja üksikasjalikud parameetrid leiate tabelist S3. (C) Valkude bioloogiliste protsesside rikastamise analüüs, mis tuvastati sagedusega vähemalt 2 f-hAFS-EV-des (vasak paneel) ja p-hAFS-EV-des (parem paneel) pärast hüpoksilist eelkonditsioneerimist. FunRichi tööriista põhjal kuvatakse geeniontoloogia terminid tulpdiagrammides, mis kajastavad iga kategooria jaoks rikastatud geenide protsenti (tumekollased tulbad f-hAFS-EVsnormo jaoks, punased tulbad f-hAFS-EVShypo jaoks, helerohelised tulbad p-hAFS jaoks -EVsnormo ja tumerohelised ribad p-hAFS-EVShypo jaoks). Ainult geeniontoloogia terminid Bonferroniga parandatud*p<0.05 are="">

Cistanche on vananemisvastane toime

2.6. Loote vs. perinataalse has-CM ja have-EV tsütokiinide ja kemokiinide profileerimine näitas erinevaid jaotusmustreid

Oleme varem kinnitanud f-hAFS-CMhypo regeneratiivset võimet vigastatud kardiovaskulaarsetel rakkudel parakriinsete mõjude kaudu [34, 35, 49]. Siin võrdlesime f-hAFS-CMHypo tsütokiini ja kemokiini sisaldust vastava p-hAFS-i vastega (joonis 7A, joonis S4A ja tabel S4) ja leidsime mõned eristavad tegurid.

ANGIOGENIN, ekstratsellulaarse maatriksi metalloproteinaasi indutseerija (EMMPRIN), interleukiin 8 (IL-8) ja monotsüütide kemoatraktantne valk-1 (MCP-1) leiti ainult rikastatud inf-hAFS-CMNypo-na ja neid ei leitud tuvastati p-hAFS-CMhypo-s. Insuliinitaoline kasvufaktorit siduv valk 2 (IGFBP2) ja osteopontiin (OPN) suurenesid f-hAFS-CMhypo puhul märkimisväärselt 3.{16}}ja 3.{18}} korda (" lk<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Kui loote ja perinataalse has-CM ekspressioon oli nende tsütokiinide ja kemokiinide profiilis erinev, olid vastavad loote ja perinataalsed EV vasted jaotunud homogeensemalt, ehkki madalama ekspressiooniprofiiliga (joonis 7B, joonis S4B ja tabel S5). Sellegipoolest võib mõningaid erinevusi hinnata: dipeptidüülpeptidaas IV (DPPIV), kasvu-/diferentseerumisfaktor 15 (GDF-15) ja IL-8 väljendati ainult f-hAFS-EVSHypo-ga, kuigi madalal tasemel. tasemed; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND ja D-vitamiini siduv valk (VDBP) leiti ainult p-hAFS-EVShypo puhul, hoolimata sellest, et neid tuvastati taas väikestes kogustes. Muud tsütokiinid, nagu ajust tuletatud neurotroofne faktor (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, insuliinitaoline kasvufaktorit siduv valk 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, stroomist tuletatud faktor{ {23}} alfa (SDF-1a) leiti nii f-hAFS-EVShypo kui ka p-hAFS-EVSHvpo puhul, kusjuures PAI-1 ja EMMPRIN olid tugevamalt ekspresseeritud (joonis 7B)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 ja SDF-lo rikastati eranditult kõigis hüpoksilistes EV-des, võrreldes vastava hAFS-CM-ga, sõltumata gestatsioonifaasist. Veelgi enam, kuigi EMMPRIN-i p-hAFS-CMhypo sees ei tuvastatud, leiti, et see oli rikastatud EV vastava fraktsiooniga; vastupidi, OPN oli f-have-CMhypo puhul rikkalikum kui f-have-EVShypo-s, samas kui see oli võrreldav vastavate p-hAFS-i sekretoomi fraktsioonidega. FGF-19, MIF ja PTX3 ekspresseerusid sarnaselt nii loote- kui ka perinataalses has-CM-is ja vastavates hAFS-EV-des. PAI-1 oli väga rikastatud hüpoksiliste sekretoomifraktsioonidega.

Joonis 7. Tsütokiinide ja kemokiinide profileerimine loote- ja perinataalsetes hAFS-i sekretoomipreparaatides. (A) Tsütokiinide ja kemokiinide ekspressioon, mis on tuvastatud hüpoksilises loote ja perinataalses has-CM-is (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo), on esitatud pikslitiheduses suvalise ühiku [AU] järgi. Väärtused on väljendatud sõltumatute katsete keskmisena ± pool ja esitatud tabelis S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B) Hüpoksilises lootes tuvastatud tsütokiini- ja kemokiinisisaldus versus perinataalsed hAFS-EV-d (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) ja väljendatud pikslitihedusega suvalistes ühikutes [AU].cistanche kolesteroolVäärtused on väljendatud n=3 sõltumatu katse keskmiste ± keskmistena ja esitatud tabelis S5. CST3: tsüstatiin C; EMMPRIN: ekstratsellulaarse maatriksi metalloproteinaasi indutseerija; FCFF-19: fibroblastide kasvufaktor-19; IGFBP2: insuliinitaoline kasvufaktor (IGF) siduv valk 2; IL-8: interleukiin -8;IL-17a:Interleukiin-17a; MCP-1: Monocyte Chemoatractant Protein-1;MIF:Macrophage migration Inhibitory Factor; PTX3: pentraksiin 3; PAI-1: plasminogeeni aktivaatori inhibiitor-1; BDNF: ajust tuletatud neurotroofne faktor; DPPIV: dipeptidüülpeptidaas IV; GDF-15:kasvu diferentseerumisfaktor-15;IGFBP3:insuliinitaoline kasvufaktor (IGF) siduv valk 3;SDF-1a: stroomist tuletatud faktor-1 alfa; VDBP: D-vitamiini siduv valk.

2.7. Loote- ja sünnitusjärgsed elektriautod on oma lastis rikastatud RNA teabega

Kuna väikseid mittekodeerivaid RNA-sid on peetud EV parakriinse mõju peamisteks regulaatoriteks sihtrakkudele [4,55], keskendusime RNA sekveneerimise analüüsile peamiselt f-hAFS-EV-de ja p-hAFS-EV-de mikroRNA (miRNA) sisaldusele. Väikese RNA profiili koostamine näitas miRNA rikastumist nii loote- kui ka perinataalsetes hAFS-EV-des (umbes 35-36 protsenti), võrreldes väikese RNA koguhulgaga (joonis 8A). MiRNA komponent oli tõepoolest kahe enim esindatud RNA liigi hulgas mõlemas EV preparaadis koos rRNA(***p) p < 0.0001).="" analüüsitud="" ev="" proovides="" olid="" kõige="" enam="" rikastatud="" järgmised="" mirna-d:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir-125a-5p;="" mir-27b-3p,let-7a-5p,let-7b-5p,let-7f{="" {27}}p,let-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" ja="" mir-221-3p.="" märkimisväärne="" on="" see,="" et="" loote-="" ja="" perinataalsed="" ev-d="" jagasid="" enamikku="" sellistest="" mirna-dest="" (nimelt="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{{47="" }}f-5p,="" let-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir-29a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" ja="" mir-221-3p,="" joonis="" 7b).="" 15="" kõige="" rikastatud="" mirna="" liiki="" katsid="" igas="" proovis="" enam="" kui="" 60="" protsenti="" mirna="" kogusisaldusest.="" teisest="" küljest="" leiti="" umbes="" 100="" mirna-d="" ülejäänud="" 30="" protsendis="" vesikulaarse="" mirna="" sisaldusest="" (joonis="">

MiRNA sisalduse edasiseks iseloomustamiseks hAFS-EV-des uurisime, kas hAFS-i rasedusstaadium või in vitro hüpoksiliste rakkude eelkonditsioneerimine võivad mõjutada spetsiifiliste miRNA-de rikastamist. Tugevaim modulatsioon leiti gestatsioonifaaside vahel, kus peaaegu kõik moduleeritud miRNA-d rikastati f-hAFS-EV-dega võrreldes perinataalse vastega (joonis 9A ja tabel 1). Hüpoksilisel eelkonditsioneerimisel oli miRNA lastile leebem mõju, samas kui selles võrdluses oli modulatsioon mõlemas suunas, kusjuures mõned miRNA-d olid rikastatud hüpoksilistes ja teised normoksilistes kontrolltingimustes (joonis 9A).

Täiendava analüüsina keskendusime uuritud miRNA-de tuvastamisele, mille varieeruvus on erinevate doonorite vahel ja kultuuri eelkonditsioneerimine mõlemast uuritud gestatsioonifaasist tuletatud EV-de jaoks. Selle analüüsi tulemusel saadud miRNA-d ulatusid kõrgest kuni madala ekspressioonitasemeni (joonis 9B). hAFS-EV-de lasti kõige stabiilsemas miRNA tuumas tuvastati mõned jagatud miRNA-d f-hAFS-EV-de ja p-hAFS-EV-de vahel (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p kõrgel tasemel; miR-221-3p, miR-221-5p ja miR-22-3p hämaras tasemel, tabel 2).

Joonis 9. MiRNA-de diferentsiaalse rikastamise analüüs loote- ja perinataalsetes hAFS-EV-des. (A) Vulkaanigraafikud hAFS-EV miRNA lasti diferentsiaalseks rikastamiseks vastavalt gestatsioonifaasile (vasak paneel) ja sekreteerivate rakkude in vitro hüpoksiliseks eelkonditsioneerimiseks (parem paneel). MiRNA üksikasju leiate tabelist 1. (B) Loote hAFS-EV-de (vasak paneel) ja perinataalsete hAFS-EV-de (parem paneel) stabiilsete miRNA-de varieeruvuse (X-telg) ja rikastamise taseme (Y-telg) vahelise korrelatsiooni hajuvusdiagramm vastavalt kõrgele (kollased punktid), hämar (rohelised täpid) ja madal (tumelillad täpid) rikastus. MiRNA üksikasjad leiate tabelist 2. RPM: näidud miljoni kohta.

3. Arutelu

Inimese amnionivedeliku järelejäänud äravisatud proovid on tuvastatud kui väärtuslik stroomarakkude allikas, millel on paljutõotav potentsiaal regeneratiivses meditsiinis ja koetehnoloogias. Nende isoleerimisega seotud eetilised probleemid on minimaalsed, kuna neid võib saada kas rutiinse sünnieelse amniotsenteesi sõeluuringu järelejäänud proovidest, raseduse II trimestril (loote hAFS) või amnionivedelikust, mis on III trimestri planeeritud C-sektsioonis kliiniliste jäätmetena ära visatud. Viimastel aastatel on hAFS-i pakutud potentsiaalsete ravimitena inimese kudede parandamiseks ja regenereerimiseks, võttes arvesse eksperimentaalsetest haigusmudelitest saadud julgustavaid tõendeid. Huvitaval kombel on neid pakutud ka loote-vastsündinu neuroloogiliste haiguste emakasiseseks raviks; tõepoolest, prekliinilised uuringud näitasid, et sünnieelselt amnionisisese sünnituse teel manustatud hAFS kaitses seljaaju tiinuse ajal parakriinse aktiivsuse kaudu müelomeningotseeli rotimudelis [56-58] ja vähendas katmata soolestiku kahjustusi eksperimentaalse näriliste gastroskise korral[59]. ]. Translatsioonilisest vaatenurgast võib hAFS-i emakasisese siirdamise asendada nende sekretoomi kõige sobivama preparaadi (hAFS-CM või hAFS-EV-de) manustamisega.cistanche deserticola kõrvaltoimedSee strateegia võimaldaks kiiret ja õigeaegset sekkumist tiinuse ajal, ületades kanoonilise rakuteraapia piirangud (st aeganõudev in vitro raku laiendamine), pakkudes samal ajal valmis ja kasutusvalmis ravimvorme.

Vähem invasiivsete sünnieelsete diagnostikameetodite hiljutine väljatöötamine võib lähitulevikus kaasa tuua amniotsenteesi protseduuride vähenemise, toetades seega perinataalset hAFS-i kui juurdepääsetavamat võimalust. Sellegipoolest, kuna loote hAFS on arenguliselt ebaküpsem, võib neil olla tõhusam parakriinne potentsiaal. Selle stsenaariumi raames võrdlesime siin loote- ja perinataalset c-KITt hAFS-i ning keskendusime nende sekretoorsete fraktsioonide profileerimisele. Tõstsime esile asjakohased erinevused, mida tuleb arvesse võtta nende parakriinse võime võimaliku kliinilise tõlkimise jaoks.

Kooskõlas varasemate sõltumatute uuringutega näitame, et gestatsioonistaadium ei mõjutanud heterogeenset hAFS-i morfoloogiat ja nende mesenhümaalset antigeeni profiili [25, 26]. Seejärel hindasime parameetreid, mis tõenäoliselt mõjutavad rakkude sekretoorset ja parakriinset aktiivsust väljaspool kanoonilist strooma immunofenotüüpi. Hiljuti on näidatud, et luuüdi mesenhümaalsetes eellasrakkudes on CD146-positiivne, kõrge CD107a-sisaldusega alampopulatsioon korrelatsioonis märkimisväärse moduleeriva ja terapeutilise parakriinse aktiivsusega [47]. Siin selgus, et nii loote- kui ka perinataalset hAFS-i iseloomustab tugevalt see molekulaarne signatuur, mis toetab nende sekretoorset potentsiaali ja millel on asjakohased translatsioonilised tagajärjed. Veelgi enam, loote hAFS-i iseloomustas ebaefektiivne aeroobne metabolism, samas kui küpsematel perinataalsetel oli suurem hapnikutarbimise kiirus ja ATP süntees. See võib viidata II trimestri hAFS-i ebaküpsemale metaboolsele profiilile, mis sarnaneb enneaegsete vastsündinute nabanööri stroomarakkudega, mis on näidanud sama suundumust [60].

Parakriinse potentsiaali vallandamiseks eksponeeriti hAFS 24-tunnisele seerumivabale hüpoksilisele praimimisele, strateegiale, mille oleme varem looterakkude jaoks edukalt välja töötanud [34, 35, 37] ja mida siin uurisime esimest korda nende perinataalset vastet. Loote- ja perinataalse hAFS-i eelkonditsioneerimine hüpoksia all põhjustas positiivse suundumuse nende sekretoomide kontsentratsiooni ja vabanenud EV-de hulga suurenemises, samas kui rasedusstaadium ei avaldanud mingit mõju raku sekretoomi saagisele ega EV morfoloogiale ja suuruse jaotusele.

Eelkõige näitas hAFS-i parakriinse lasti iseloomustus mõningaid spetsiifilisi erinevusi vastavalt meie hinnatud erinevatele tingimustele. Loote hAFS-i sekretoomi proteoomiline profileerimine näitas märgatavaid tegurite jaotusi, mis põhinevad gestatsioonifaasil ja rakkude hüpoksilisel eelkonditsioneerimisel. See näitab, et hAFS-i parakriinne potentsiaal võib küpsemise ajal Ⅱ kuni Ⅲ raseduse trimestril omandada selge identiteedi, mida saab omakorda moduleerida sekreteerivate rakkude stimuleerimisega in vitro. HAFS-CM ja hAFS-EV-de bioloogiliste protsesside rikastamise analüüs näitas, et enamik moduleeritud valke võib kokku leppida rakkude kasvu / säilimise ja valkude metabolismiga, toetades seega raku kasulikke parakriinseid mõjusid, millest on seni teatatud. Eelkõige leiti, et loote hüpoksiline hAFS kogusekretoom on rikastatud kuumašoki valguga HSPD1 (HSP60), mis näitas, et see toetab haavade paranemist diabeetilise hiire nahavigastuste mudelis ja soodustab makrofaagide pro-lahunemist M2 fenotüübiks [61]. . Samuti rikastati hüpoksilisi loote hAFS-EV-sid neurogeneesi soodustavate teguritega (HSPG2[62], rakkude eneseuuenemine ning aju ja kardiovaskulaarne areng (LAMA5[63] ja LAMB1[64] ning migratsioon (THBS1 [2]).) Proteoglükaan AGRN leiti ka EV-des pärast loote hAFS-i hüpoksilist praimimist.cistanche dosage redditMeie leiud on kooskõlas varasemate tõenditega, et AGRN on mesenhümaalsete stroomarakkude proteoomides põletikuliste ja hüpoksiliste juhendavate stiimulite mõjul ülesreguleeritud [65]. Samuti on näidatud, et AGRN on seotud immuunsünapsi signaaliülekandega [66] ja vastab vastsündinu hiire südame taastumisele [67], toetades seega noore loote hAFS-i tugevat eelsoodumust regeneratiivsete parakriinsete mõjude suhtes. Lisaks kinnitati, et loote hAFS reageerib paremini hüpoksilisele eelkonditsioneerimisele, nagu näitab veresoonte regeneratiivse efektiivsuse ennustajate, nagu ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 ja MCP-1 tsütokiin[68], rikastumine. nende konditsioneeritud keskkond. See toetab varasemaid tõendeid loote hAFS-CM parakriinse toime kohta endogeense neoarteriogeneesi suurendamisel müokardiinfarkti, tagajäseme isheemia ja isheemilise fasciokutaanse klapi prekliinilistes näriliste mudelites [34,69-71] Lisaks loote hAFS leiti, et kogu sekretoom on IGFBP2 ja OPN-ga oluliselt rikastatud võrreldes perinataalse sekretsiooniga, mis viitab selgemale lahutust soodustavale ja vananemisvastasele moduleerivale profiilile[72-75]. Perinataalset have-CM-i, kuigi parakriinsete tegurite osas vähem tõhustatud, täiendati sarnaselt neurotroofsete ja immunomoduleerivate teguritega, nagu CST3[76,77] ja MIF[78].

Võrreldes kogu hAFS-CM-ga, näitasid vastavad hüpoksilised loote- ja perinataal-EV kolleegid tsütokiinide ja kemokiinide madalamat ekspressiooni, välja arvatud veresoonte remodelleerumise vahendaja EMMPRIN [79], mis oli enamasti rikastatud vesiikulite sektsioonis. Loote hAFS-EV-de [34,37] varem teatatud kardioaktiivne ja regeneratiivne profiil on siin kinnitatud tõenditega, et need avaldavad ainult kardioprotektiivset IL-8 [80] ja GDF-15, võtmetähtsusega parakriinne tegur, mis käivitab endogeense täiskasvanute hipokampuse neurogeneesi[81,82] ja neutraliseerib antratsükliinist põhjustatud kardiotoksilisuse [78]. Nii loote- kui ka perinataalsed hAFS-EV-d näitasid eellas-/tüvirakkude kaubitsemise regulaatori SDF-1 [83-85] puhul sarnast ekspressiooni. Proteoomiline analüüs teatas angiogeneesiga seotud valkude, nagu NRP1 [86] ja MP14[87], suurenenud ekspressioon hüpoksilistes perinataalsetes hAFS-EV-des; selline stimuleeriv profiil võib selgitada varasemaid tulemusi Ⅲ trimestri hAFS-i endoteeli regeneratiivsete omaduste kohta skeletilihaste isheemilise kahjustuse prekliinilises hiiremudelis [25], hoolimata tõenditest, et nende hAFS-CM on vähem proangiogeenne kui vastav loote oma. Eelkõige leiti neuraalset kasvufaktorit BDNF nii loote- kui ka perinataalses EV lastis, kuigi väikestes kogustes, mis viitab hAFS-EV-de oletatavale neurotroofsele aktiivsusele neuronite ellujäämises ja neuroarenguprotsessides, nagu on täheldatud ka inimese luust sekreteeritud rakuväliste vesiikulite puhul. luuüdi ja nabaväädi veri-MSC[8889]. Mõlemad hüpoksilise stimulatsiooni läbinud loote- ja perinataalse hAFS-i sekretoompreparaadid olid rikastatud PAI-ga-1, endoteeli aktiveerimise hõlbustaja [90], mis on samuti osalenud M2 makrofaagide polarisatsioonis südames ja millel on kardioprotektiiv. ja anti-fibrootiline potentsiaal [91].

MikroRNA-sid (miRNA-sid) on laialdaselt käsitletud kui tüvirakkude ja mesenhümaalsete stroomarakkude-EV parakriinse aktiivsuse olulisi regulaatoreid [92, 93]. Siin leidsime, et 15 kõige rikastatud miRNA liiki hAFS-EV-des katavad enam kui 60 protsenti iga proovi miRNA kogusisaldusest. On teatatud, et need miRNA-d iseloomustavad mesenhümaalsete stroomarakkude EV-de molekulaarset lasti (olgu -7a-5p [4,95]), kaitsevad müokardi isheemia eest, mõjutades veresoonte regeneratsiooni ja inhibeerides fibroosi. -7b-5p, olgu-7f-5p, miR-21-5p ja miR-155-5p [96,97]), reklaamige haavade paranemine, reguleerides keratinotsüütide funktsiooni (miR-16-5p [98]) ja neutraliseerides neuronite surma pärast eesajuisheemiat (miR-29a-3p [99,100]). Teisest küljest leiti ülejäänud 30 protsendist vesikulaarsest miRNA sisaldusest umbes 1000 miRNA-d. Selline tasakaalustamata jaotus on kooskõlas varasemate uuringutega [4] ja tõstab esile enamasti rikastatud miRNA-d kui oletatavaid, mis on vastutavad hAFS-EV-de peamise bioloogilise aktiivsuse eest. Huvitaval kombel jagasid loote- ja perinataalsed hAFS-EV-d enamikku 15 miRNA-st. Samuti täheldasime, et nii loote hAFS-EV-d kui ka perinataalsed sisaldasid väga stabiilseid miRNA-sid erinevatel rikastustasemetel. Sellised tõendid võivad viidata paljudele "majapidamise" kandidaatidele, mida kasutatakse sisemise võrdluskontrollina hAFS-EV-de qPCR-katsetes. Lisaks on selliste stabiilsete miRNA-de järjepidev alamhulk (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) on jagatud kahe gestatsioonifaasi vahel ja kattub 15 enamjaolt rikastatud faasiga, mis viitab veelgi püsivamale käitumisele ja usaldusväärsele eelnevalt lahendatavale molekulaarsele signatuurile ([96,{{45 }}]). Pange tähele, et paar kandidaati sellises eristavas tuumas on hiljuti teatatud kui referents-miRNA-d neuroprotektiivsetes EV-des, mis on saadud II trimestri amnionivedelikust pärinevatest mesenhümaalsetest stroomarakkudest (miR-29a-3p ja miR{{ 49}}lk[95]). Sellegipoolest märkasime ka, et rasedusaeg võib miRNA lasti moduleerida rohkem kui hüpoksiline eelkonditsioneerimine. III trimestri loote hAFS-ist saadud juveniilsemad EV-d rikastati miRNA-dega, mis varem näitasid, et need toetavad embrüonaalsete tüvirakkude elujõulisust (miR{51}}p [101]), rakkude proliferatsiooni ja luuüdi stroomarakkude osteogeenset diferentseerumist (miR). -217 [102]), sisaldades samas ka kasvaja supressori potentsiaali (miR-302-3p[103,104]);miR-383-5p[105,106]).

Meie tulemuste põhjal kinnitame siin, et loote- ja perinataalne hAFS võib kujutada endast atraktiivseid parakriinseid allikaid, mida regeneratiivse meditsiini jaoks kasutada. Kuigi nende fenotüüp ja sekretoorne aktiivsus olid sarnased, oleme esile toonud nende sekretoorsete preparaatide mõned eripärased aspektid, mis on kasulikud teadmised nende tulevase terapeutilise tõlke jaoks.

4. Materjalid ja meetodid

4.1.Inimese amniootilise vedeliku tüvirakkude eraldamine ja in vitro kultiveerimine

Inimese lootevee tüvirakud (hAFS) eraldati amnionivedeliku (AF) järelejäänud proovidest, mis koguti rutiinse sünnieelse sõeluuringuga Ⅱ trimestri amniotsenteesi teel (loote hAFS, f-hAFS) või kliiniliste jäätmetena plaanilise keisrilõikega sünnituse ajal Ⅲ trimestril. (perinataalne hAFS, p-hAFS) IRCCS San Martino haigla sünnieelse diagnostika ja perinataalmeditsiini osakonnas, IRCCS Istituto Gaslini haigla (Genova, Itaalia) loote- ja perinataalse meditsiini ja kirurgia osakonnas ning inimese geneetika laboris. Kõigilt doonoritelt saadi teadlik kirjalik nõusolek vastavalt kohaliku eetikakomitee loale (protokoll PR428REG2015) ja Helsingi deklaratsiooni juhistele. II trimestri loote AF-i proovid saadi naisdoonoritelt, kelle keskmine vanus oli umbes 37,42±0,32 aastat (n=15 vahemikus 36-kuni 41 aastat);Ⅲ trimestri perinataalse AF-i proovid saadi naisdoonorid, kelle keskmine vanus on 34,25±1,31 aastat (n=10 vahemikus 26- kuni 42 aastat). Loote- ja perinataalne hAFS saadi proovidest, mis olid valideeritud normaalse kariotüübi jaoks ja eraldati immunomagnetilise sorteerimisega c-KIT ekspressiooni jaoks (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Itaalia) kleepunud AF mesenhümaalsetest stroomarakkudest[16].cistanche ekstrakti eelisedc-KIT* hAFS-i kasvatati minimaalse olulise söötmes (MEM)-alphas koos 15% FBS-iga (veise loote seerum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itaalia), 18% Chang B ja 2% Chang C söötmega (Irvine Scientific). , Santa Ana, CA, USA) 1 protsendi L-glutamiini ja 1 protsendi penitsilliini/streptomütsiiniga (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itaalia), inkubaatoris 37 kraadi juures 5 protsendi CO2 ja 20 protsendi Oz atmosfääriga ning kultiveeriti. 5 passaaži in vitro enne kasutamist nende sekretoomi eraldamiseks.

4.2.HAFS-i metabolismi biokeemiline hindamine

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) rakke kasutati igas katses. Basaalhingamise hindamiseks permeabiliseeriti hAFS 10 minutiks 0,03 mg/mL digitoniiniga ja suspendeeriti fosfaatpuhversoolas (PBS). Raja stimuleerimiseks lisati 10 mM püruvaati pluss 5 mM malaati või 20 mM suktsinaati. - viisid, mis koosnevad vastavalt kompleksidest I, II ja IV või kompleksidest Ⅱ ja IV [60].

Et hinnata suhtelist panust glutamiini, pika ahelaga rasvhapete oksüdatsiooni ja glükoosi hingamisse, suspendeeriti rakud pärast digitoniini permeabiliseerimist kasvusöötmes ning 4 uM BPTES-s, 4 uM etomoksiiris ja 4 uM UK5-s{{22} }99 lisati, et inhibeerida vastavalt glutaminaasi, karnitiinpalmitoüültransferaasi 1A (CPT1A) või mitokondriaalset püruvaadi kandjat (MPC). Fi-F.ATP süntaasi (ATP süntaasi) aktiivsus tuvastati ATP tootmise mõõtmisega ülitundliku lutsiferiini/lutsiferaasi meetodil. Analüüsid viidi läbi 37 kraadi juures 2 minutit ja andmeid koguti iga 3 0 sekundi järel. Esimeses katsekomplektis inkubeeriti 10 kraadi rakke 10 min söötmes, mis sisaldas 50 mM KCl, 1 mMEGTA, 2 m MEDTA, 5 mMKH2PO4, 2 mMMgC12, 0,6 m Mouabaiini, 1 mM P1P5-Di. (adenosiin-5')pentafosfaat, 0,040 mg/ml ampitsilliini ja 10 mM Tris-HCl, pH 7,4. Seejärel indutseeriti ATP süntees hingamisteede substraatide (10 mM püruvaati pluss 5 mM malaati või 20 mM suktsinaadi) ja 0,1 mM ADP lisamisega. Reaktsiooni mõõdeti lutsiferiini/lutsiferaasi ATP bioluminestsentsanalüüsi komplekti CLSII (Roche, Basel, Šveits) abil luminomeetris (GloMax 20/20 Luminometer, Promega, Milano, Itaalia) ATP standardlahustes (Roche, Basel, Šveits) vahemikus {{ Kalibreerimiseks kasutati 42}}/M. Teises katsekomplektis hinnati ATP sünteesi 4 uM BPTES, 4 uM etomoksiiri või 4 uM UK5099 juuresolekul. Sel juhul inkubeeriti 10 rakku 10 minutit kasvusöötmes ilma või juuresolekul. metabolismi inhibiitorit ja ATP süntees indutseeriti 0,1 mM ADP-ga. OxPhos (oksüdatiivne fosforüülimine) efektiivsus (P/O suhe) arvutati kui suhe toodetud ATP kontsentratsiooni ja tarbitud hapniku koguse vahel respiratoorse substraadi ja ADP juuresolekul. Kui hapnikutarbimine on täielikult pühendatud energia tootmisele, peaks P/O suhe pärast püruvaadi ja malaadi või suktsinaadi lisamist olema vastavalt ligikaudu 2,5 ja 1,5 [48] Anaeroobse glükolüüsi panuse hindamiseks hAFS-i metabolismis hinnati glükoosi ja laktaadi kontsentratsioone. kasvukeskkonnas. Glükoositarbimist hinnati heksokinaasi (HK) ja glükoos-6-fosfaatdehüdrogenaasi (G6PD) sidestussüsteemiga pärast NADP redutseerimist 340 nm juures. Analüüsi sööde sisaldas 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12, 2 IU heksokinaasi ja 2 IU glükoos-6-fosfaatdehüdrogenaasi. Laktaadi vabanemist testiti pärast NAD pluss redutseerimist 340 nm juures. Analüüsi sööde sisaldas 100 mM Tris-HCl (pH8), 5 mM NAD pluss ja 1 IU/ml laktaatdehüdrogenaasi. Proove analüüsiti enne ja pärast 4 ug puhastatud laktaatdehüdrogenaasi lisamist. Mõlemal juhul normaliseeriti andmed rakkude arvu järgi ja väljendati vastavalt mM glükoosi / 10 kraadi rakkude või mM laktaadi vabanemise / 10 kraadi rakkude kohta [107].

4.3. Voolutsütomeetria HAFS-i iseloomustus

Sada tuhat (105) loote- ja p-hAFS-rakku eraldati ja inkubeeriti hiire anti-inimese-CD107a-Alexa Fluor 647-ja anti-inimese CD146-FITC-ga. konjugeeritud antikehad (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Itaalia). Rakkude apoptoosi hinnati FITC anneksiin V apoptoosi tuvastamise komplekti (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Itaalia) abil, järgides tootja juhiseid. Sündmused saadi BD Bioscience FACS Aria II sorteri ja analüsaatoriga, mis oli varustatud FACS Diva tarkvaraga (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milano, Itaalia). Andmeid analüüsiti tarkvara FlowJo V9.0 (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milano) abil. , Itaalia). 4.4.Vananemise värvimine

Kuni 5. passaažini kultiveeritud hAFS-i vananemisfenotüüpi standardsetes in vitro tingimustes hinnati Senescence-Galactosidase värvimiskomplektiga (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA): f-hand p-hAFS fikseeriti 1x Fixative lahusega 70% juures. konfluentsus ja värvitud SA- -gal 37 kraadi juures üleöö, vastavalt tootja juhistele. Vananemissündmused koguti Leica DMil mikroskoobiga (varustatud Leica Acquire tarkvaraga V3.4.4, Leica Microsystems, Milano, Itaalia) ja hinnati SA- -gal-positiivsete rakkude protsendina rakkude koguarvust välja kohta.

4.5. HAFS-i sekretoomi fraktsioonide eraldamine ja kontsentreerimine

f-hAFS-i ja p-hAFS-i kultiveeriti 24 tundi seerumivabas söötmes (SF) 1-protsendilise O2 hüpoksia ja 20-protsendilise O2-normoksiaga (kontroll), millest viimast kasutati võrdlusalusena. Seda eelkonditsioneerimisstrateegiat kasutati bioaktiivsete parakriinsete tegurite vabanemise suurendamiseks, nagu me varem teatasime [34, 35, 37, 49]. hAFS-e kultiveeriti 24 tundi seerumivabas (SF) söötmes (kõrge glükoosisisaldusega Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde, DMEM, 1% L-glutamiini ja 1% penitsilliini/streptomütsiiniga, kõik firmalt Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Itaalia), normoksilisuse all. (20% O2 ja 5% CO2 37 kraadi juures) või hüpoksilistes (1% O2 ja 5% CO2 37 kraadi juures CellXpert C170i ja Galaxy 48R CO2 inkubaatorites, Eppendorf, Milano, Itaalia) tingimustes.

f-hAFS-CM ja p-hAFS-CM koguti ja tsentrifuugiti 4 kraadi juures 300x g 10 minutit ja 2000 × g 20 minutit, et eemaldada rakujäänused; hAFS-CM kontsentreeriti 3 kDa selektiivse eraldusvõimega ultrafiltreerimismembraanidega (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Saksamaa) 4 kraadi juures 3000 × g juures 90 minutit ja seejärel kontsentreeriti edasi 4 °C juures. kraadi juures 3000× g 30 minutit. hAFS-EV-d eraldati ja kontsentreeriti hAFS-CM-st järjestikuse ultratsentrifuugimisega. Lühidalt, hAFS-CM koguti ja tsentrifuugiti 4 kraadi juures 300 x g 10 minutit ja 2000 x g 20 minutit, et eemaldada rakujäägid. Seejärel töödeldi supernatanti 10 000 × g juures 40 minutit. Pellet visati ära ja supernatanti töödeldi täiendavalt ultratsentrifuugimisega seadmes Optima L-90K (Beckmann Coulter, Milano, Itaalia) kiirusel 10 000 × g 120 minutit, kasutades Beckman Coulteri pöörleva kopaga SW55Ti tsentrifuugirootoreid. Heterogeenseid hAFS-EV-sid sisaldav pellet pesti PBS-is, tsentrifuugides lõpuks 100 000 × g juures 120 minutit ja seejärel resuspendeeriti PBS-is, mis oli filtreeritud 0,22 um poorifiltriga. Valgu kontsentratsioone hAFS-CM-is ja hAFS-EV-de pinnal mõõdeti BiCinchoninic Acid (BCA) testiga (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itaalia). Proovid koguti Gen5 mikroplaadilugejaga 570 nm juures, et hinnata hAFS-CM ja hAFS-EVs saagist ug lahuse/10 kraadi tootvate rakkude kohta.

4.6. HAFS-EV-de iseloomustamine ülekandeelektronmikroskoopia ja nanoosakeste jälgimise analüüsi abil

Transmissioonelektronmikroskoopia (TEM) analüüs viidi läbi Hitachi TEM mikroskoobiga (HT7800 seeria, Hitachi High Technologies, Monza, Itaalia). Digipildid tehti Mega view 3 kaamera ja Radius tarkvaraga (EMSIS, Muenster, Saksamaa). f-hAFS ja p-hAFS fikseeriti 3,7% paraformaldehüüdi (PA) lahuses, mis oli lahjendatud 1:1 hAFS-i täissöötmega, pesti 0,1 M kakodülaatpuhvris ja inkubeeriti seejärel kohe 1 tund toatemperatuuril 0,1 M kakodülaatpuhver, mis sisaldab 2,5 protsenti glutaaraldehüüdi (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA). Rakupelleteid fikseeriti 1 tund osmiumtetroksiidis ja 1 tund 1-protsendilises uranüülatsetaadi lahuses. Proove dehüdreeriti 24 tundi 42 kraadi juures ja 48 tundi 60 kraadi juures läbi sorteeritud etanooli seeria ja sisestati epoksüvaiku (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Saksamaa). Üliõhukesed lõigud (50 nm) lõigati Leica Ultracut mikrotoomiga (Leica Microsystems, Milano, Itaalia) ja värviti 5% uranüülatsetaadiga 50% etanoolilahuses. f-hAFS-EV ja p-hAFS-EV resuspendeeriti 20 uL PBS lahuses ja fikseeriti, lisades võrdses koguses 2 protsenti paraformaldehüüdi 0,1 M fosfaatpuhverlahuses (pH 7,4). Seejärel adsorbeeriti EV-d 10 minutiks formvar-süsinikkattega vaskvõredele, ujutades võred 5 μL tilkadel parafilmil. Seejärel loputati kleepuvate EV-dega võreid PBS-is ja värviti negatiivselt 2-protsendilise uranüülatsetaadi lahusega 5 minutit toatemperatuuril. Värvitud võred sisestati 2,5% metüültselluloosi, et parandada säilivust ja kuivatati enne uuringut õhu käes. HAFS-EV-de morfomeetriaanalüüsi mõõdeti 10 juhuslikult tehtud mikropildil 40000 × g suurendusega. Suurus arvutati suvalise joonefunktsiooni abil, mis oli sisseehitatud tarkvara Radius mõõtmisdialoogiboksi (EMSIS, Muenster Saksamaa). HAFS-EV-de suuruse jaotuse visualiseerimiseks joonistati tulemused hajutatud punktigraafikuna ja sagedusjaotisena, milles iga suurus on esitatud punktina koos joontega mediaanväärtuse ja vahemiku jaoks.

f-hAFS-EV-sid ja p-hAFS-EV-sid analüüsiti ka nanoosakeste jälgimise analüüsi (NTA) abil, et hinnata 10-kraadiste rakkude poolt vabanenud osakesi. hAFS-EV-sid lahjendati PBS lahuses vahekorras 1:100 ja hangiti NanoSight LM10-ga (Malvern Instruments, Malvern, UK), mis salvestas vähemalt 3 erinevat kaadrit pikkusega 60 sekundit. Iga proovi kolme erinevat omandamist analüüsiti, kasutades tarkvara Batch Process suvandit. 4.7. hAFS-CM ja hAFS-EV LC-MS/MS analüüs 4.7.1. Lahusesisene seedimine

Proteoomiline analüüs viidi läbi 3 hAFS-CM ja hAFS bioloogilise kordusega. f-hAFS-i ja p-hAFS-i EV-d pärast normoksilist või hüpoksilist eelkonditsioneerimist (n=24 erinevat tingimust). hAFS-CM-i ja hAFS-EV-de proovid suspendeeriti 0.1 M NHCO3-s pH 7,9 ja töödeldi RapigestIM-iga SF-reaktiiv (Waters Co, Milford, MA, USA) lõppkontsentratsioonil 0,25% (mass/maht). Saadud suspensioone inkubeeriti segades 100 kraadi juures 2{{40}} min. Iga proovi seedimine viidi läbi, lisades järjestusastmega modifitseeritud trüpsiini (Promega Inc, Madison, WI, USA) ensüümi/substraadi suhtega 1:50 (mass/mass) üle öö temperatuuril 37 kraadi 0,1 M NH4HCO3-s pH 7,9. 10% CHSCN-ga puhvrit. Hommikul lisati täiendav alikvoot trüpsiini (1:100 w/w) ja seedimist jätkati 4 tundi. Veelgi enam, 0,5-protsendilise trifluoroäädikhappe (TFA) lisamine Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA) peatas ensümaatilise reaktsiooni ja sellele järgnenud inkubeerimine 37 kraadi juures 45 minutit viis RapiGesti happe hüdrolüüsi lõpule[108]. Veega segunematud lagunemissaadused eemaldati tsentrifuugimisega kiirusel 13.000 p/min 10 minutit. Lõpuks eemaldati trüptilise lõhustamise segudest soolad PierceTM C-18 tsentrifuugimiskolonnidega (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itaalia) vastavalt tootja protokollile ja resuspendeeriti 0,1% sipelghappes (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) vees (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, USA) kontsentratsioonil 0,1 ug/μl.

4.7.2. Vedelikkromatograafia

Trüpsiiniga lagundatud segusid analüüsiti platvormi abil, mis koosnes nanovedelikkromatograafilisest süsteemist Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D System (Eksigent, AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, USA), mis oli konfigureeritud lõksu-elueerimise režiimis. ühendatud kõrge eraldusvõimega massispektromeetriga. Lühidalt, proovid (süstitud 0,8 ug) laaditi esmalt peptiidilõksule (200 um × 500 um ChromXP C18- CL, 3 um, 120 A) ja pesti isokraatlikus režiimis töötava laadimispumbaga 0,1 protsendilise sipelghappega vees 10 minutit voolukiirusel 3 μL/min. Kümnekäigulise ventiili automaatne ümberlülitamine elueeris seejärel kinnijäänud segu nano-pöördfaasilises kolonnis (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL, 3 um, 120 A) eluendi B 150-minutise gradiendi kaudu. (eluent A, 0,1% sipelghapet vees; eluent B, 0,1% sipelghapet atsetonitriilis) voolukiirusel 300 nL/min. Põhjalikult oli gradient järgmine: alates 5-10 protsenti Bin 3 min, 10-40 protsenti Bin 130 min, 40-95 protsenti Bin 10 min ja hoides 95 protsenti B 7 minutit. 4.7.3. Massispektromeetria

MS/MS analüüsid viidi läbi LTQ-OrbitrapXL massispektromeetriga (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itaalia), mis oli varustatud nanopihustusiooniallikaga. Pihustuskapillaari pinge määrati 1,7 kV ja iooniülekande kapillaari temperatuuri hoiti 22{11}} kraadi juures. Täielikud MS-spektrid registreeriti positiivsete ioonide režiimis vahemikus 400-1600 m/z, lahutusvõimega 60 000 (täislaius poole maksimumi juures) ja skaneerimiskiirusega 2 spektrit/s. Sellele etapile järgnes viis madala eraldusvõimega MS/MS sündmust, mis genereeriti järjestikku andmetest sõltuval viisil viiele parimale ioonile, mis valiti kogu MS spektrist (35% kokkupõrkeenergiaga), kasutades dünaamilist välistamist 0,5 minutit. MS/MS analüüs. Massispektromeetri skaneerimise funktsioone ja kõrgjõudlusega vedelikkromatograafia lahustigradiente kontrolliti Xcaliburi andmesüsteemi versiooniga 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itaalia).

4.7.4.Proteoomiline andmetöötlus ja andmekaeve

Kõiki genereeritud andmeid otsiti Sequest HT otsingumootori abil, mis sisaldub Thermo Scientific Proteome Discoverer tarkvara versioonis 2.1. Eksperimentaalsed MS/MS spektrid korreleeriti trüptiliste peptiidide järjestustega, võrreldes teoreetiliste massispektritega, mis saadi Uniprot Homo Sapiensi proteoomide andmebaasi in silico digereerimisel (74600 kirjet), mis laaditi alla 2. jaanuaril. 020 (www.uniprot.org, juurdepääs 10 2. märtsil021). Peptiidjärjestuste ja nendega seotud valkude tuvastamiseks kasutati järgmisi kriteeriume: trüpsiin kui ensüüm, kolm vahelejäänud lõhustamist peptiidi kohta, prekursorioonide massitolerants ±50 ppm ja fragmendi ioonide puhul ±0,8 Da. Perkolaatori sõlme kasutati koos siht-peibutusstrateegiaga, et anda lõplikuks valeavastamise määraks (FDR) peptiidspektri vaste (PSM) tasemel 0,01 (range) q-väärtuste põhjal, võttes arvesse maksimaalset deltaCN-i 0,05 [109]. Arvesse võeti ainult peptiide, mille peptiidi minimaalne pikkus on kuus aminohapet ja 1. kategooria. Rakendati valkude rühmitamist ja rangeid säästlikkuse põhimõtteid. MS andmed on talletatud ProteomeXchange konsortsiumi PRIDE [10]partneri hoidla kaudu (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, juurdepääs 10. märtsil 2021). SEQUEST-algoritmiga saadud 48 valku joondati, normaliseeriti , ja sildivaba võrreldes. Sel eesmärgil kasutati ettevõttesisest algoritmi, nimelt Multidimensional Algorithm Protein Map (MAProMa), kasutades keskmisi peptiidispektri vasteid (aPSM) [111,112], mis vastavad kõigi valgu ja järelikult tuvastatud spektrite keskmisele. , selle suhtelisele arvukusele igas analüüsitud seisundis. Erinevalt ekspresseeritud valkude valimiseks võrreldi põhjalikult alarühmi (nii loote- ja perinataalse hAFS-CM kui ka hAFS-EV jaoks, võttes arvesse ka hüpoksilist rakkude eelkonditsioneerimisstimulatsiooni), rakendades kahele MAProMale künniseid 0, 4 ja 5. indeksid vastavalt DAve (diferentsiaalkeskmine) ja DCI (diferentsiaalkindlusindeks). DAve, mis hindab muutusi valgu ekspressioonis, defineeriti kui (XY)/(X＋Y)/0,5, samas kui DCI, mis hindab diferentsiaalse ekspressiooni usaldusväärsust, defineeriti kui (X pluss Y) × (XY)/2 X ja Y terminid tähistavad antud valgu PSM-i kahes võrreldavas proovis. Lisaks viidi igast uuritud seisundist saadud keskmised valguloendid läbi lineaarse diskriminantanalüüsi (LDA) ja suurima F-suhtega (suurem või võrdne 4,5) ja väikseima p-väärtusega (väiksem või võrdne 0,001) säilitati ja töödeldi hierarhilise klastrite abil, rakendades Wardi meetodit ja Eukleidilise kauguse mõõdikut, kasutades JMP 15.2 tarkvara. Täpsemalt, F-suhe esindas mudeli keskmist ruutu jagatuna vea keskmise ruuduga, samas kui p-väärtus näitas tõenäosust saada F-väärtus, mis on suurem kui arvutatud väärtus, kui tegelikkuses ei oleks elanikkonnarühma keskmiste vahel erinevusi. 4.8. HAFS-CM ja have-EV-de tsütokiinide ja kemokiinide profileerimine

F-hAFS-i ja p-hAFS-iga pärast hüpoksilist eelkonditsioneerimist saadud hAFS-CM ja have-EV-de tsütokiinide ja kemokiinide profileerimist hinnati Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array komplekti (R&D System, Minneapolis, MN, USA) abil vastavalt tootja juhised. Kasutati 20 ug hAFS-CM ja hAFS-EVs proove. Membraanide kujutised saadi Chemidoc Mini HD9 Autoga (Uvitec Cambridge, UK). Spetsiifilist tsütokiini/kemokiini sisaldust hinnati iga tuvastatava tsütokiini positiivse pikslite intensiivsuse kvantifitseerimise teel (suvalise ühiku abil), kasutades ImageJ tarkvara (saadaval aadressil https: //imagej.nih.gov/ij/,vaadatud 10. märtsil 2021 [13]). 4.9.RNA ekstraheerimine hAFS-EV-dest ja Next

Põlvkondade järjestamine

RNA eraldati f-hAFS-EV-dest ja p-have-EV-dest miRNeasy Micro Kitiga (Qiagen, Milano, Itaalia) vastavalt tootja juhistele. RNA terviklikkust ja suurusjaotust hinnati väikese mittekodeeriva RNA kiibiga Agilent Small RNA Kit abil, et hinnata väikeste RNA-de sisaldust vahemikus 6 kuni 150 nukleotiidi (nt). MikroRNA (miRNA-de) sisalduse kvantifitseerimiseks kasutati Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Monza, Itaalia), järgides tootja juhiseid. miRNA sekveneerimisraamatukogud valmistati ja amplifitseeriti, kasutades QIAseq miRNA raamatukogu komplekti (Qiagen, Milano, Itaalia), kasutades sisendina 18,5 ng eraldatud miRNA-sid ja järgides tootja juhiseid. Raamatukogud ühendati pärast TapeStationi (Agilent Technologies, Foster City, CA, USA) kvaliteedikontrolli ja kvantifitseerimist, kasutades Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Koondteeke hinnati kvaliteedikontrolli reaalajas qPCR abil, järgides juhendit "Sequencing Library qPCR Quantification" (Illumina Inc, San Diego, CA, USA) ja järjestati Illumina NextSeq platvormi abil, kasutades High Output Hit v2.5 (75 tsüklit) ( Illumina Inc, San Diego, CA, USA). Baaskõne viidi läbi Illumina NextSeq500 vaiketöövooga.

4.10.MiRNA sekveneerimise bioinformaatiliste andmete analüüs

Fastq-faile töödeldi esmalt 3'-adapteri ja madala kvaliteediga aluste kärpimisega, kasutades Cutadapti [114]. Pärast kärpimist tuvastati insertsioonijärjestused ja UMI järjestused. Ilma adapterjärjestuseta lugemised, alla 16 aluspaari pikkuste insertsioonijärjestustega lugemised ja alla 10 aluspaari pikkuste UMI järjestustega lugemised jäeti kõrvale. Inserdijärjestuste märkimiseks joondati lugemised Bowtie abil GRCh38 inimese genoomi komplektiga [15] Iga proovi jaoks loendati kõik konkreetsele miRNA-le määratud lugemised ja seotud UMI-d agregeeriti unikaalsete molekulide loendamiseks. Sekundaarne analüüs viidi läbi kohandatud R-skriptidega, mis olid saadaval mõistliku taotluse korral. Diferentsiaalrikastamise analüüs viidi läbi Limma [116] ja EdgeR Bioconductori pakettide [117] abil.

4.11. Statistilised analüüsid

Tulemused on esitatud vähemalt kolme (n{{0}}) sõltumatu katse keskmisena ± pool. Võrdlused tehti ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes posthoc Tukey mitme võrdluse test või Studenti t-test. Analüüsid viidi läbi Graph-Pad Prism versiooni 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, juurdepääs 10. märtsil 2021) abil statistilise olulisusega* p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

Kokkuvõtteks leiti, et loote- ja perinataalne hAFS on fenotüüpiliselt samaväärne võrreldava sekretoorse tugevuse ja EV rikastumisega suuruse ja jaotuse poolest; ometi võib hinnata mõningaid erinevusi nende sekretoorses profiilis. Täpsemalt, loote hAFS-i arenguliselt ebaküpset profiili võib kokku võtta nende sekretoompreparaatidega, millel on rohkem väljendunud pro-vaskulogeenne, pro-regeneratiivne ja noorendav sekretoom. Perinataalne hAFS säilitab siiski asjakohase parakriinse profiili endoteelirakkude migratsiooni, immuunmoduleeriva, põletikuvastase ja neurotroofse potentsiaaliga seotud tegurite ekspressiooni kaudu, mis on sarnased loote hAFS-iga. Need leiud võivad anda kasulikke teadmisi vigastustega seotud ja põletikuliste/isheemiliste haiguste tulevase parakriinravi toetamiseks. Seetõttu tuleks konkreetset kliinilist stsenaariumi arvestades hinnata kas loote või perinataalse hAFS-i kui kõige ideaalsema rakuallika valikut.

See artikkel on välja võetud artiklist Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms