Inimese loote ja perinataalsete amnionivedeliku tüvirakkude sekretoompreparaatide põhjalik profileerimine, 1. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Varem teatasime, et rutiinse Ⅱ trimestri sünnieelse diagnoosi (loote hAFS) järelejäänud proovidest saadud c-KIT pluss htamanist amnionivedelikust saadud tüvirakud on varustatud regeneratiivse parakriinse potentsiaaliga, mis soodustab ellujäämist, fibroosivastast ja proliferatiivset toimet. võib eraldada ka III trimestri kliinilistest jäätmeproovidest planeeritud C-sektsioonide (perinataalse hAFS) käigus, pakkudes seega loote hAFS-iga võrreldes hõlpsamini juurdepääsetavat alternatiivi. Sellegipoolest on perinataalse hAFS-i parakriinse profiili kohta vähe teada. Siin anname üksikasjaliku kirjelduse hAFS-i üldsekretoomist (st kõik lahustuvad parakriinsed faktorid, mida vabastavad rakud konditsioneeritud söötmes, hAFS-CM) ja ekstratsellulaarsed vesiikulid ( hAFS-EV-d) selle sees Ⅱ trimestri loote versus III trimestri perinataalsetest rakkudest. Loote- ja perinataalset hAFS-i iseloomustati ja nende parakriinse potentsiaali suurendamiseks tehti hüpoksiline eelkonditsioneerimine. hAFS-CM ja hAFS-EV preparaate analüüsiti valgu ja kemokiini / tsütokiini sisalduse suhtes ning EV lasti uuriti täiendavalt RNA sekveneerimisega. Loote- ja perinataalsete hAFS-ide fenotüüp koos vastavate sekretoompreparaatidega kattus; siiski näitas loote hAFS ebaküpset oksüdatiivset fosforüülimise aktiivsust võrreldes perinataalsetega. Nende parakriinse lasti profileerimine näitas mõningaid erinevusi vastavalt gestatsioonifaasile ja hüpoksilisele eelkonditsioneerimisele. Mõlemad rakuallikad pakkusid neurotroofsete, immunomoduleerivate, antifibrootiliste ja endoteeli stimuleerivate teguritega rikastatud preparaate ning ebaküpse loote hAFS-i sekretoom oli määratletud rohkem väljendunud vaskulogeense, regeneratiivse, lahustuva ja vananemisvastase profiiliga. Väike RNA profiilide koostamine näitas mikroRNA rikastumist nii loote- kui ka perinataalses hAFS-EV lastis, kusjuures võrdlusmolekulaarse signatuurina oli stabiilselt ekspresseeritud pro-lahutustuum. Siin kinnitame, et hAFS on ahvatlev regeneratiivsete parakriinsete tegurite allikas; loote või perinataalsete hAFS-i sekretoompreparaatide valikut tulevase parakriinravi jaoks tuleks hinnata, võttes arvesse konkreetset kliinilist stsenaariumi.

Märksõnad:amnionivedelik; tüvirakud; parakriinsed mõjud; rakuvälised vesiikulid; rakuga konditsioneeritud sööde; kemokiin; tsütokiinid; proteoomika; RNA sekveneerimine; mikroRNA

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Regeneratiivne meditsiin on hiljuti arenenud esilekerkiva valdkonnana, mis pakub vigastatud kudede funktsionaalset taastamist mitme strateegia abil. Kuna koetehnoloogia lähenemisviisid on viimastel aastatel märkimisväärselt edasi arenenud, on tüvirakkude parakriinsete mõjude uurimine samaaegselt üha intensiivistunud. On näidatud, et siirdatud tüvirakkude terapeutilist potentsiaali vahendavad enamasti nende sekreteeritud lahustuvad tegurid, mis võivad peremeeskoes organiseerida regeneratiivset mikrokeskkonda, käivitades samal ajal funktsionaalse taastumise endogeensete mehhanismide aktiveerimise [1, 2]. Seetõttu on mitmete sõltumatute prekliiniliste uuringute käigus kardiovaskulaarsete, neuroloogiliste ja/või põletikuliste uuringute käigus üha enam pakutud uuendusliku teraapia ravimina tüvirakkude sekretsiooni kogu rakkudest vabanevate parakriinsete troofiliste molekulide ja ka membraaniga seotud ekstratsellulaarsete vesiikulite hulka. haigus. Sellest tulenevalt võib tüvirakke kujutada bioloogiliste tehastena nende terapeutilise sekretoomi ärakasutamiseks, pakkudes kasutusvalmis ja valmis regeneratiivseid ravimeetodeid. Rakendades sellist rakupõhist, kuid rakuvaba strateegiat, saab ületada paljud kanoonilise rakuteraapiaga seotud piiravad aspektid, tagades samal ajal kasulikud mõjud.mis on cistancheSelles perspektiivis on mesenhümaalseid stroomarakke (MSC) oletatavate rakukandidaatidena põhjalikult testitud? Tõepoolest, MSC ja tüvi-/eellasrakud on konstrueeritud ja/või stimuleeritud erinevate eelkonditsioneerimisstrateegiate abil, et suurendada nende regenereerimisvõimet ja sekretoorset potentsiaali [3,4], olles selgesõnaliselt huvitatud nende sekreteeritud ekstratsellulaarsete vesiikulite (EV) bioloogilisest tähtsusest.

EV-d on nano-suurused osakesed, mis on piiritletud lipiidide kaksikkihiga ja mida sekreteerivad aktiivselt kõik rakutüübid. EV-de hulka kuuluvad väga väikesed (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); nad toimivad rakkudevahelise signaaliülekande kriitiliste bioloogiliste konveieritena, toimetades oma molekulaarse lasti vanemrakust reageerijale/sihtrakule [5,6]. Arvestades, et nende omapärane parakriinne potentsiaal avaldada kasulikku mõju on võrreldav nende päritolurakkudega, on tüvirakkude EV-d esile kerkinud ahvatlevate ravivõimalustena selliste haiguste prekliinilistes mudelites nagu isheemia, põletik või vigastus, mida on põhjalikult käsitletud artiklis [{{3 }}]. Translatsioonilisest vaatenurgast on lisaks raku moduleerivale potentsiaalile isoleerimise teostatavus ja kõrgem eneseuuenemine terapeutiliste EV-de ja lahustuvate tegurite ideaalse allika võtmeaspektid. Sellise stsenaariumi korral võib loote- ja perinataalne MSC pakkuda huvitavat võimalust, arvestades nende proliferatiivset potentsiaali ja arenguliselt ebaküpset profiili koos vahepealsete tunnustega embrüonaalsete ja täiskasvanud somaatiliste eellasrakkude vahel [10, 11]. Loote MSC-d saab eraldada embrüonaalsetest lisanditest tiinuse ajal, kui proovid, mis on võetud sünnieelse sõeluuringu käigus (st koorioni villid [12-14] ja amnionivedelik [15,16]) või sünnijärgsete eellasrakkudena, kliinilistest jäätmetest (st amnioni- ja platsentamembraanid [17-21], nabanööri komponendid [22-24] ja amnionivedelik [25,26]).

Cistanche on vananemisvastane toime

Nimelt on inimese amnionivedeliku tüvirakke (hAFS) esile tõstetud kui paljutõotavaid ravistrateegiaid regeneratiivses meditsiinis. ja on osutunud laialdaselt multipotentseks in vitro ja in vivo [16, 27, 28], aitavad kaasa emakasisese siirdamise järgsele hematopoeetilisele liinile [29] ja siirduvad vigastatud organitesse, avaldades samal ajal immunomoduleerivat toimet [26, 30] ja aktiveerides. endogeensed reparatiivsed vastused, nagu on põhjalikult kirjeldatud punktis [31]. Meie meeskond ja teised on lisaks näidanud, et hAFS vabastab sekretoomi, mis on väga rikastatud bioaktiivsete troofiliste molekulidega, mis on võimelised sihtima erinevaid reparatiivseid mehhanisme. On teatatud, et hAFS-i parakriinsed tegurid pakuvad ellujäämist soodustavaid stiimuleid põletikku kustutades [32], pakuvad kardiokaitset pikaajalise isheemia [33.34] ja kardiotoksilisuse [35] vastu ning stimuleerivad lokaalset angiogeneesi kardiomüotsüütide rakutsükli taassisenemisega. 34,36]. Kuna on näidatud, et enamik neist mõjudest tuleneb ainult hAFS-EV manustamisest, on sõltumatud uuringud keskendunud nende regeneratiivse profiili lahkamisele erinevate patoloogiliste taustade taustal, sealhulgas skeleti- ja südamelihase vigastused, neeruhaigused, osteoartriit, osteoporoos, nekrotiseeriv enterokoliit ja neurodegeneratiivne. mudelid [34,37-44].

Kuigi tõendid võivad toetada hAFS-EV-de kliinilist tõlget tulevase parakriinravi jaoks, on oluline arvestada, et enamik neist uuringutest on peamiselt uurinud Ⅱ trimestri sünnieelse skriinimise käigus saadud loote hAFS-i moduleerivat potentsiaali. Tõepoolest, sekretoomi täielik profiil perinataalset vastet (st III trimestri c-sektsioonidest) ei ole veel üksikasjalikult uuritud. Kolmanda trimestri perinataalsed hAFS-id on näidanud erilisi immuunsüsteemi reguleerivaid omadusi võrreldes esimese ja teise trimestri omadega [26], säilitades samal ajal asjakohase endoteeli regeneratiivse potentsiaali [25].kui palju tsistanche võttaPange tähele, et hiljutine aruanne loote hAFS-i heterogeense morfoloogia kohta[45] on andnud uusi teadmisi nende tüve ja geeniekspressiooni profiili kohta.bioflavonoididSee on toonud täiesti uut valgust hAFS-i erinevate rakufraktsioonide regeneratiivsele väärtusele[46]. Seetõttu tõmbab hAFS-i erinevate alampopulatsioonide põhjalik iseloomustus üha enam tähelepanu. Varem teatasime, et 24-tunnine hüpoksiline ja seerumivaba stimulatsioon on tõhus strateegia Ⅱ trimestri loote hAFS-i parakriinse potentsiaali suurendamiseks [34, 35, 37]. Kuna III trimestri hAFS-i sekretoomi koostisest on vähe teada, esitame siin Ⅱ versus Ⅲ trimestri hAFS-i ja nende sekretoomifraktsioonide (sealhulgas mütsi-EV-de) põhjaliku võrdluse, et käsitleda gestatsioonifaasi ja hüpoksilise raku mõju. eelkonditsioneerimine rakkude ja sekretoomi omaduste suhtes.

2. Tulemused

2.1. Perinataalne hAFS on lootele tihedalt fenotüübiliselt sobiv

Lootevee 1. trimestri ja perinataalse III trimestri lootevee proovide vahel ei täheldatud statistiliselt olulist erinevust doonori vanuses. Loote c-KIT* hAFS (f-hAFS II trimestri lootevee proovidest) ja perinataalne c-KIT* hAFS (p-hAFS III trimestri amnionivedeliku kliinilistest jäätmetest) kinnitasid sarnaseid tunnuseid fibroblastitaolise ja ovaalse ümara morfoloogiaga (joonis). 1A) ja mesenhümaalne stromaalne fenotüüp (andmeid pole näidatud), nagu varem teatatud [16, 25]. Nii f-hAFS kui ka p-hAFS, mida kultiveeriti in vitro kuni passaažini 5, näitasid umbes 4 protsendil rakkudest ebaolulist vananemise taset vananemisega seotud - -galaktosidaasi (SA- -Gal) aktivatsiooni tõttu (joonis 1B). . Nii f-hAFS kui ka p-hAFS näitasid mesenhümaalsete markerite CD107a ja CD146 kõrget koekspressiooni, millest on hiljuti teatatud, et need määratlevad väga sekretoorse fenotüübi [47]. CD107at CD146* rakud moodustasid suurema osa f-hAFS-i populatsioonist (ligikaudu 64 protsenti,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Joonis 1. Lootel on ja perinataalselt on fenotüübiline hinnang. (A) Standardsetes tingimustes in vitro kultiveeritud loote hAFS-i (f-hAFS, vasak paneel) ja perinataalse hAFS-i (p-hAFS, parem paneel) tüüpilised kujutised; skaala riba: 200 um. (B) vananeva markeri beeta-galaktosidaasi (SA- -Gal, sinine) analüüs f-hAFS-i ja p-hAFS-i tsütokeemilise värvimise teel pärast 5 passaaži kultuuris; esinduslikud pildid on esitatud vasakpoolsel paneelil, skaala riba: 200 um. Vastav -Gal-positiivsete rakkude protsent välja kohta on esitatud parempoolse paneeli graafikul (f-hAFS: 4,12±0,58 protsenti ja p-hAFS: 3,88±2,10 protsenti ;p=0,1424,n{ {24}} katsed).(C) CD146 ja CD107a mesenhümaalseid markereid ekspresseeriva hAFSi immunofenotüüp. f-hAFS ja p-hAFS tüüpilised voolutsütomeetria diagrammid (vasak paneel) ja vastavad väärtused viitasid topeltpositiivsetele CD107a pluss CD146 pluss rakkudele; CD107a pluss CD146* f-hAFS: 63,68±5,82 protsenti,*p=0,016 võrreldes ülejäänud 36,32±5,82 protsendiga f-hAFS (muu); CD107at CD146 pluss p-hAFS: 52,07±6,76 protsenti ülejäänud 47,76 protsenti 93±56,76 protsenti p-hAFS (muu); CD107a pluss CD146 pluss f-hAFS vs CD107a pluss CD146 pluss p-hAFS p=0.2403,n=4 katsed. Muu: ülejäänud CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS ja CD107at CD146-hAFS kogusumma. Kõik väärtused on väljendatud sõltumatute katsete keskmisena ± sem. SA- -Gal: vananemisega seotud- -galaktosidaas.

2.2. Loote hAFS näitab perinataalsest hAFS-ist erinevat ainevahetust

Et hinnata, kas gestatsioonistaadium võib mõjutada mitokondriaalset metabolismi, analüüsiti f-hAFS-i ja p-hAFS-i standardsetes in vitro kultiveerimistingimustes biokeemiliste analüüsidega. Aeroobse metabolismi hindamine näitas, et hapnikutarbimise määr (OCR) ja ATP süntees olid f-hAFS-is madalamad võrreldes p-hAFS-iga, mõlemat stimuleeriti püruvaadi ja malaadiga (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. Hüpoksiline eelkonditsioneerimine ei mõjuta loote- ja perinataalset elujõulisust ning säilitab nende sekretoorset aktiivsust

HAFS-i sekretoompreparaatide määratlemiseks kultiveeriti rakke seerumivabades tingimustes, et vältida FBS-i saastumist. Varem näitasime, et 24-tunnised seerumivabad (SF) ja 1-protsendilised O2-hüpoksilised kultiveerimistingimused ei muutnud oluliselt Ⅱtrimestri loote hAFS-i (f-lootus) elujõulisust, samas kui nad toetasid regeneratiivsete parakriinsete faktorite vabanemist nende raku konditsioneeritud söötmes. (hAFS-CM) ja ekstratsellulaarsetes vesiikulites (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Lisaks p-hAFS-i sekretoomfraktsioonide esmakordsele profileerimisele hindasime siin, kas p-del on sama eelkonditsioneerimisrežiimi korral sarnane käitumine, kasutades kontrollina normoksilist kultuuri tingimust. f-hAFS ja p-hAFS elujõulisust analüüsiti 24 tunni pärast järgmistes seadetes: normoksiline (20 protsenti O2) seisund täielikus kontrollis (Ctrl) söötmes (Ctrlf-hAFSnormo ja Ctrl p-hAFSnormo), normoksiline seisund SF söötmes (SF f-hAFSnormo ja SF p-hAFSnormo), hüpoksiline (1 protsent O2) seisund täielikus kontrollsöötmes (Ctrlf-on hüpo ja Ctrl p-hAFSnypo) ja hüpoksiline seisund SF söötmes (SF f-l on hüpo ja SF p - on hüpoglükeemia, joonis 3A). Kinnitasime, et f-halb elujõulisus ei muutunud nii Ctrl kui ka SF tingimustes ja hüpoksilise stimulatsiooni korral, kusjuures enam kui 80 protsenti (kuni peaaegu 88 protsenti) rakkudest ei muutunud. Varased ja hilised apoptootilised rakud ulatusid ca. 13–18 protsenti SF tingimustes, ilma statistiliselt olulise tähtsuseta. Samuti oli perinataalne elujõulisus vahemikus 80-92 protsenti ning varajased ja hilised apoptootilised rakud moodustasid SF tingimustes kuni 18 protsenti. p-hAFS oli vähesel määral mõjutatud ainult kombineeritud hüpoksia ja SF tingimustes; tõepoolest, kuigi eelkonditsioneerimine ei mõjutanud rakkude ellujäämist, kui p-hAFS-i kultiveeriti täielikus söötmes, näitas vastav SF-i seisund suurenemist ca. 4-fold (* lk<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Joonis 2. Loote- ja perinataalse AFS-i metaboolne iseloomustus. (A) Hapnikutarbimise kiirus (OCR), ATP süntees F1-F.ATP süntaasi kaudu ja P/O suhe f-have ja-have püruvaadi pluss malaadi (P/M) või suktsinaadi juuresolekul (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AustraaliaOCR-i ja ATP sünteesi inhibeerimise protsendi võrdlus f- ja hAFS-is ülalnimetatud inhibiitorite tõttu on esitatud alumisel paneelil B. OCR-katsete jaoks: hAFS pluss Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Seejärel hindasime valgu rikastamise põhjal f-hAFS-ist saadud sekretoomifraktsioonide saagist p-hAFS-iga võrreldes. Kogusummal on sekretoom, kuna rakkude poolt sekreteeritud parakriinsete tegurite kogum on siin esindatud hAFS-CM-iga. F-hAFS-CM ja p-hAFS-CM valgu kontsentratsioon SF-söötmes pärast hüpoksiliste rakkude eelkonditsioneerimist võrreldes normoksilise kontrollseisundiga algtasemena (nimelt f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo ja p -hAFS-CMHypo,) hinnati BCA testiga ja mõõdeti 10§ rakkude järgi.tsisantšSaadud tulemused näitasid, et f-has-CM ja p-hAFS-CM näitasid pärast hüpoksilist praimimist valgu rikastamises võrdset positiivset trendi (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 kraadi rakud; p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/10 kraadi rakud) võrreldes normoksiliste analoogidega (f-hAFS-CMnormo: 105,50±19,89 ug/10 kraadi rakud; p- hAFS-CMhypoi 91,12±24,39 ug/10 kraadi raku kohta. Samuti mõõdeti hAFS-EV-de pinnavalgu kontsentratsiooni f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo ja p-hAFS-EVShypo puhul. EV-d näitasid võrreldavat saagist, kui need saadi f-hAFS-ist või p-hAFS-ist. Mis puudutab hAFS-CM-i preparaate, siis f-hAFS-EV-de ja p-hAFS-i valgusisalduse suurenemises oli positiivne suundumus. EV-sid hinnati pärast hüpoksilist stimulatsiooni üle vastav normoksiline seisund (f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 ug/10 kraadi rakud ja p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 ug/10 kraadi rakud; f-have-EVsnormo∶1,28±0,36 ug/10 kraadi rakud -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 ug/10 kraadi rakkude kohta, joonis 3C).

2.4. Loote- ja perinataalsed hAFS-i väljalaskega EV-d, millel on analoogne morfoloogia ja suurusjaotus

Morfoloogiline analüüs transmissioonielektronmikroskoopia (TEM) abil suurendas nii f-hAFS kui ka p-hAFS kõrget EV-sekretoorset levikut (joonis 4). Lisaks uurisime f-hAFS-EV-de ja p-hAFS-EV-de suurust ja pindala (joonis 4B) pärast hüpoksilist eelkonditsioneerimist võrreldes normoksilise algtasemega. Loote- ja perinataalne EV-d on vabastanud heterogeense suurusega EV-d vahemikus 40-250 nm, hõlmates seega nii eksosoome/väikesi EV-sid kui ka mikrovesiikuleid/eraldusvesiikuleid. EV-de keskmine suurus põllu kohta erinevates rühmades oli võrreldav, loote hAFS-EV-d mõõdeti 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo: 104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo: 97,10±10,10 nm) ja perinataalsetel mõõdeti 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo: 94,60±19,53 nm; p-hAFS-EVShypo: 76,43±4.{37}} nm, joonis 4B, vasak paneel). Mis puutub saagisse, siis hüpoksia all stimuleeritud hAFS näitas positiivset trendi väikeste EV-de arvu suurenemises, kuigi see tõus ei olnud statistiliselt oluline. f-hAFS-EVStypo mõõdeti 40-70 nm, mis oli peaaegu kaks korda suurem kui nende normoksilise vastega. Perinataalne-has-EVSHypo, mis mõõdeti 40-70 nm, 70-100 nm ja 100-130 nm, oli peaaegu kolm korda suurem kui normoksilises kultuuris saadud kogus (joonis 4B).

Nanoosakeste jälgimise analüüs (NTA) näitas suurenenud osakeste arvu nii f-hAFS-EV kui ka p-hAFS-EV preparaatides ning kinnitas EV-de suurenemist hüpoksilistes proovides, nagu täheldati ka eelmistes analüüsides (f-hAFS- EVsnormo: 182±0,10'osakesed / 10 kraadi rakud; f-have-EVshypo: 3,30±0,22 × 10 kraadi osakesed / 10 kraadi rakud p-hAFS-EVsnormo: 2,43 ± 0,80 × 10 kraadi osakesed / 10 kraadi rakud; p-hAFS-EVshypo: 3,05 ± 0,62 × 10 kraadi osakesed / 10 kraadi rakud, joonis 4C).

Joonis 4. Loote- ja perinataalsete EV-de morfoloogiline iseloomustus. (A) f-hAFS-i ja p-hAFS-i transmissioonelektronmikroskoopia (TEM) tüüpilised kujutised (vastavalt ülemine ja alumine vasakpoolne paneel koos mustade nooltega, mis näitavad intratsütoplasmaatilisi multivesikulaarseid kehasid, milles on väikesed EV-d / eksosoomid) ja f -hAFS-EV ja p-hAFS-EV (vastavalt ülemine ja alumine parem paneel), mis vabanevad seerumivabades tingimustes ja normoksilise versus hüpoksilise eelkonditsioneerimise korral (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; ja f-hAFS-EVshypo), skaala ribad: 200 nm. (B) Vasak paneel: hAFS-EV-de suurusjaotuse TEM-analüüs; parem paneel: vaadeldi f-hAFS-EV-de ja p-hAFS-EV-de arvu jaotust välja suuruse intervallide kaupa vahemikus 40 nm kuni 250 nm; väärtused on väljendatud n=3 sõltumatu katse keskmiste ± sememidena. (C) Nanoosakeste jälgimise analüüs hAFS-i suuruse ja jaotuse jaoks. Vasak paneel: graafilise väljundi esinduspilt; parem paneel: hAFS-EV-de kontsentratsioon mõõdetuna 10 kraadiste osakestena 10 kraadi sekreteerivate rakkude kohta; nm: nanomeeter; ml: milliliiter.

2.5. Loote vs perinataalse hAFSi proteoomiline iseloomustus toob esile erinevused nende sekretoomi koostises vastavalt gestatsiooni vanusele ja hüpoksilisele eelkonditsioneerimisele

Nii f-hAFS-i kui ka p-hAFS-i sekretoomipreparaatide proteoomiline iseloomustamine viidi läbi püssimärgivaba platvormi abil, mis põhines nano-vedelikkromatograafia ja kõrge eraldusvõimega massispektromeetria (nLC-HRMS) ühendamisel. Nelikümmend kaheksa proteoomilist profiili saadi hAFS-CM-i ja f-hAFS-i ja p-hAFS-i has-EV-de kolme bioloogilise replikaadi dubleeritud analüüsiga, mis läbisid hüpoksilise raku eelkonditsioneerimise, võrreldes normoksilise seisundiga kontrollina. Kokku tuvastati 4179 erinevat valgurühma vähemalt ühe unikaalse peptiidiga, mille molekulmass oli vahemikus 2 kuni 3900 kDa ja isoelektrilised punktid 3,6 kuni 13. Võrreldes hAFS-CM-iga täheldati hAFS-EV-des kõrgemat keskmist valgu ekspressiooni . Kõigi saadud valguloendite joondamine viidi läbi tuvastatud valkude põhjal. Iga katsetingimuse jaoks koostati ainulaadne loend, mis normaliseeris ja keskmistas [50] valkudele omistatud peptiidispektri vaste väärtused (PSM), mis esindavad igale katsele omistatud massispektrite arvu ja kaudselt nende arvukust proovides. Täielik hAFS-CM ja have-EV preparaatides tuvastatud valkude loetelu on esitatud tabelis S1.

Lineaarse diskriminantanalüüsi (LDA[51]) rakendamine selles põhiloendis võimaldas ekstraheerida statistiliselt olulisi valke (Fratio Suurem või võrdne 4,5 ja** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 hAFS-CM ja have-EV koostistes, mida vaadeldakse eraldi. Kui umbes 69,5 protsenti ja 69,9 protsenti valkudest jagati vastavalt hAFS-EV-de ja hAFS-CM-i tingimustes, siis ülejäänud sisaldus paistis erinevates proportsioonides, vahemikus 3,7 protsenti kuni 13,4 protsenti.

Proteoomiliste muutuste kvantitatiivseks uurimiseks viidi läbi etiketivaba diferentsiaalanalüüs, kasutades kodus valmistatud MAProMa tarkvara ja rakendades kahte algoritmi, DAve (diferentsiaalkeskmine) ja DCI (diferentsiaalkindluse indeks), mis esindavad suhet ja diferentsiaalekspressiooni usaldusväärsust. vastavalt) iga üksiku valgu PSM-ide kohta kahe võrreldava termini vahel. Rangete filtrite kasutamine DAve ja DCI jaoks, et maksimeerida identifitseerimiskindlust ja võtta arvesse valke, mille varieeruvus on suurem kui 1,5-kordne muutus, f-hAFS-CM versus p-hAFS-CM ja f-hAFS-EV-de paaridevaheline võrdlus p-hAFS-EV-d valmistati vastavalt raku gestatsioonifaasile. Ülaltoodud has-CM ja have-EV sektsioonides leiti kokku 58 ja 109 valku, mis ekspresseerusid erinevalt (valitud üksikasjade jaoks joonisel S1B, C ja laiendatud kujul tabelid S2-S3). Neist 30 valku põhjustasid f-hAFS-CM-i ülesreguleerimise ja 28 p-hAFS-CM-i ülesreguleerimise (joonis S1B); samuti põhjustas 44 erinevat valku f-have-EV-de ülesreguleerimist ja 65 p-hAFS-EV-de ülesreguleerimist (joonis S1C). Eelkõige tuleb valke, mille tulemuseks oli f-have ülesreguleerimine, pidada p-has-i puhul allareguleerituks ja vastupidi.

esitatakse väärtused; teatatud valkude täieliku loetelu ja üksikasjalikud parameetrid leiate tabelist S2. (C) Valkude bioloogiliste protsesside rikastamise analüüs, mis on tuvastatud vähemalt 2 sagedusega loote hAFS-CM-is (vasak paneel) ja perinataalses have-CM-is (parem paneel) vastavalt rakkude hüpoksilisele eelkonditsioneerimisele. FunRichi tööriista põhjal kuvatakse geeniontoloogia terminid tulpdiagrammides, mis näitavad iga kategooria jaoks rikastatud geenide protsenti (roosad tulbad-have-CMnormo, lillad tulbad f-hAFS-CMhypor jaoks helesinised tulbad p-hAFS-CMnormo jaoks, ja sinised pallid p-hAFS-CMhypo jaoks).osta cistancheAinult geeniontoloogia terminid Bonferroniga parandatud tähega *p<0.05 are="">

See artikkel on välja võetud artiklist Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms