Komplemendi aktiivsust reguleerivad C3 glomerulopaatia korral IgG-faktor H fusioonvalgud koos Properdini sihtdomeenidega ja ilma nendeta

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook, Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² ja Matthew C. Pickering

Põletikuliste haiguste keskus, Londoni Imperial College, Ühendkuningriik; and² Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, USA

C3 glomerulopaatiaSeda iseloomustab komplemendi C3 akumuleerumine glomerulites. Põhjuste hulka kuuluvad, kuid mitte ainult, kõrvalekalded faktoris H, mis on komplemendi alternatiivse raja peamise negatiivse regulaatori. H-faktori puudulikkusega (Cfh-/-) hiirtel areneb C3glomerulopaatiakoos plasma C3 taseme langusega. Seda mudelit kasutades hindasime kahe sulandvalgu efektiivsust, mis sisaldavad H faktori alternatiivset rada reguleerivat domeeni (FH1-5).

seotud kas mittesihtmärgiga hiire immunoglobuliiniga (IgG-FH1-5) või hiire propidiinivastase antikehaga (Anti-P-FH1-5). Mõlemad valgud suurendasid plasma C3 ja vähendasid glomerulaarse C3 ladestumist samaväärsel määral, mis viitab sellele, et FH1-5 jaoks ei olnud C3 aktivatsiooni muutmiseks plasmas ega glomerulites vaja õigediini sihtimist. Pärast IgG-FH1-5 manustamist korreleerus plasma C3 tase ajaliselt B-faktori taseme muutustega, samas kui plasma C5 tase korreleerus plasma megfelelődiini taseme muutustega. Eelkõige suureneb plasma

C5 ja megfelelődiini tasemed püsisid kauem kui C3 ja faktori B tõus. Cfh-/- hiirtel vähendas IgG-FH1-5 neerukahjustust seerumi nefrotoksilise nefriidi kiirenemise ajal. Seega näitavad meie andmed, et IgG-FH1-5 taastas tsirkuleeriva alternatiivse raja aktiivsuse ja vähendas Cfh-/- hiirtel glomerulaarset C3 ladestumist ning et plasma megfelelődiini tase on C5 konvertaasi aktiivsuse tundlik marker H-faktori puudulikkuse korral. Immunoglobuliiniga konjugeeritud FH1-5 valk võib oma suhteliselt pika plasma poolväärtusaja tõttu olla potentsiaalne C3 raviglomerulopaatia.

Cistanche võib aidata glomerulopaatia korral

Tõlkeavaldus

C3 glomerulopaatia(C3G) on neeruhaigus, mida iseloomustab komplemendi C3 ebanormaalne akumuleerumine glomerulites ja glomerulaarkahjustus. See on tingitud komplemendi alternatiivse raja kontrollimatust aktiveerimisest. Sulandvalgud, mis koosnesid alternatiivse raja regulaatori, faktori H (FH) funktsionaalsetest domeenidest, mis on seotud antikehaga, taastasid komplemendi regulatsiooni ja vähendasid glomerulaarset C3 C3G hiiremudelis. Mittesihitud antikehade konjugatsiooni tulemuseks oli suhteliselt pikk sulandvalgu plasma poolväärtusaeg ja seda või sarnaseid konjugeerimismeetodeid saab kasutada FH funktsiooni suurendamiseks C3G ravis.

C3 glomerulopaatia(C3G) on komplemendi poolt vahendatud neeruhaigus, mida iseloomustab C3 ebanormaalne kogus glomerulites.1 See võib areneda neerupuudulikkuseks ja seda ei ole võimalik ravida.2 C3G on seotud komplemendi alternatiivse raja (AP) ebanormaalse aktivatsiooniga. AP aktiveerimise tulemuseks on C3bBb (C3 konvertaas) tootmine, ensüüm, mis lõhustab C3. Pärast teise C3b molekuli lisamist võib saadud C3bBbC3b kompleks (C5 konvertaas) lõhustada komplemendi C5. Kontrollimatu

AP aktiveerimist C3G-s võib seostada tsirkuleeriva C3, C5, faktori B (FB) ja propertydiini vähenemisega. Kontrollimatu AP aktivatsiooni põhjused hõlmavad funktsiooni muutuste kadumist komplemendi regulaatorites ja funktsiooni muutuste suurenemist komplemendi aktivaatorites.2 Peamine negatiivne AP regulaator on H-faktor (FH) ning FH puudulikkus inimestel, sigadel ja hiirtel on seotud C3G-ga. 3 C3 nefriitiline faktor, AP C3 konvertaasi stabiliseeriv antikeha on C3G-s sagedane.4 C3 nefriitiline faktor võib põhjustada ainult C3 (properdiinist sõltumatu C3 nefriidifaktor) või nii C3 kui ka C5 (properdiin- sõltuv C3 nefriitne faktor).5,6

Kuigi propidiini defitsiit plasma C3 taset ei parandanud, tõusis C5 tase, mis viitab sellele, et propediini oli vajalik C5, kuid mitte C3 konvertaasi aktiivsuseks.8,9

Hiire10 või inimese FH11,12 manustamine Cfh–/– hiirtele vähendas glomerulaarse C3 värvumist ja suurendas tsirkuleeriva C3 taset. Konstruktsioonid, mis sisaldavad ainult FH (mini-FH molekulid) regulatoorseid ja sihtmärke domeene, on samuti selles mudelis tõhusad.13 Teised lähenemisviisid hõlmavad valke, mis sihivad komplemendi aktivatsiooni saite. Nende hulka kuuluvad TT30,14 valk, mis sisaldab FH (FH1-5) komplemendi regulatoorseid domeene, mis on seotud komplemendi retseptori 2 komplementi siduvate domeenidega, ja homodimeersed FH molekulid, 15 mini-FH molekuli, mis sisaldavad komplementi siduvaid domeene. H-faktoriga seotud valk 1.

Kuna C3G-s uuritakse komplemendi C3 aktivatsiooni inhibeerimise terapeutilist kasulikkust, on oluline mõista glomerulaarse C3 ladestumise kineetikat ja selle seost AP aktivatsiooniga nii glomerulites kui ka vereringes. Immuunkompleksi poolt vahendatud glomerulonefriidi mudelites eraldus glomerulaarne C3c 24 tunni jooksul pärast komplemendi aktivatsiooni takistamist, samas kui glomerulaarne C3d püsis nädalaid.16 Samamoodi põhjustab eksogeenne FH Cfh–/– hiirtel glomerulaarse C3c värvumise vähenemist 24 tunni pärast. , kusjuures glomerulaarne C3d jääb muutumatuks.11

Selles uuringus uurisime kahe uudse komplemendi reguleeriva aktiivsusega sulandvalgu efektiivsust C3G Cfh-/- hiiremudelis. Valgud sisaldasid hiire FH (FH1-5) regulatoorseid domeene, mis bioloogilise poolestusaja pikendamiseks konjugeeriti hiire Ig-ga. Üks liitvalkudest, nimega IgG-FH1-5, konjugeeriti mittesihtmärgiks oleva hiire monoklonaalse antikehaga. Teine, anti-P-FH1-5, konjugeeriti hiire propidiini monoklonaalse antikehaga. Seda tehti selleks, et testida hüpoteesi, et selle sulandvalgu suunamine komplemendi aktivatsiooni saitidele, interakteerudes megfelelődiini ladestumisega, suurendaks koe komplemendi regulatsiooni. Meie andmed näitavad, et nii mittesihtivad (IgG-FH1-5) kui ka prodiini sihtmärgiks olevad (anti-P-FH1-5) valgud taastasid Cfh–/– hiirtel plasma ja glomerulaarse C3 regulatsiooni. Aja jooksul tehtud uuringud näitasid, et C3 ja FB taseme taastamine peegeldas vereringes olevate sulandvalkude taset. Seevastu plasma C5 tõus püsis pärast sulandvalkude vereringest eemaldamist. Näitame, et IgG-FH1-5 leevendas glomerulaarkahjustusi Cfh–/– hiirte seerumi nefrotoksilise nefriidi kiirenemise ajal.

cistanche võib ravida neeruhaigusi, parandada neerufunktsiooni

TULEMUSED

Liitvalkude genereerimine ning aktiivsuse hindamine in vitro ja in vivo Liitvalgud loodi hiire FH (FH1-5) esimese 5 lühiajalise konsensuskorduva (SCR) domeeni ühendamisel kas hiirevastase propidiini antikehaga (anti -P-FH1-5) või mittesihtiva Ig domeeniga antikeha (IgG-FH1- 5, täiendav joonis S1). Valkude aktiivsust hinnati AP-spetsiifilise hemolüütilise testi abil (joonis 1a). Anti-P-FH1-5 ja IgG-FH1-5 inhibeerisid hemolüüsi annusest sõltuval viisil, suurendades anti-P-FH1-5 toimet. Anti-properdiin (anti-P) vähendas ka hemolüüsi annusest sõltuval viisil, kuid IgG-kontroll ei avaldanud mõju. Pärast valkude ekvimolaarset süstimist Cfh–/– hiirtele oli IgG-FH1-5 valk tuvastatav kuni 11 päeva pärast süstimist, samas kui anti-P-FH1-5 oli tuvastatav kuni 4 päeva pärast süstimist. süstimine (täiendav joonis S2). Et teha kindlaks, kas IgG-FH1-5 ja anti-P-FH1-5 võivad taastada plasma AP regulatsiooni Cfh–/– hiirtel, mõõdeti esmalt plasma C3 taset pärast liitvalkude süstimist (joonis 1b). . Kas IgG-FH1-5 või anti-P-FH1-5 manustamine suurendas märkimisväärselt plasma C3 24 tundi ja vähemal määral 96 tundi pärast süstimist (joonis 1b). Need andmed näitasid, et nii IgG-FH1-5 kui ka anti-P-FH1-5 võivad ajutiselt taastada plasma AP regulatsiooni Cfh–/– hiirtel. Järgmisena viisime läbi nende muutuste üksikasjaliku analüüsi, iseloomustades mitte ainult plasma C3, vaid ka plasma C5 ja alternatiivsete radade valkude FB ja megfelelődiini muutuste aja kulgu. Pärast IgG-FH1-5 ja anti-P-FH1-5 manustamist Cfh–/– hiirtele püsib tsirkuleeriva C5 ja propadiini taseme tõus kauem kui C3 ja FB taseme tõus.

Võrdlesime C3, C5, FB ja propertydiini muutuste kineetikat, mõõtes valke intervalliga kuni 27 päeva pärast kas IgG-FH1-5 või anti-P-FH1-5 ühekordset süstimist ( Joonis 2). Pärast IgG-FH{10}} manustamist ilmnes C3, C5, FB ja megfelelődiini maksimaalne tõus 1. päeval pärast süstimist. Nende muutuste langemise aeg ravieelsele tasemele oli erinev. Ravieelsele tasemele naasmine toimus päevade 1 ja 4 vahel FB puhul, päevade 7 ja 11 vahel C3 puhul ning päevade 14 ja 21 vahel nii megfelelődiini kui ka C5 puhul (joonis 2a, c, e ja g). Pärast anti-P-FH1-5 manustamist saabus C3 maksimaalne tase 1. päeval, kuid langes ravieelsele tasemele 4. ja 7. päeva vahel (joonis 2b). Maksimaalne C5 tase ilmnes 4. päeval ja naasis ravieelsele tasemele 7. ja 11. päeva vahel (joonis 2d). FB maksimaalne tõus toimus 1. päeval ja langes ravieelsele tasemele päevade 1 ja 4 vahel (joonis 2f). Ootuspäraselt oli vaba plasma megfelelődiini sisaldus ammendunud pärast kas anti-P-FH1-5 või anti-P süstimist (joonis 2h). Vaba plasma propidiini tase püsis madalal kuni 7 päeva pärast anti-P-FH{50}} ja kuni 14 päeva pärast anti-P (joonis 2h). Kuigi mõlemad sulandvalgud taastasid ajutiselt plasma AP regulatsiooni, peegeldas C3, FB ja C5 taseme paranemise kestus nende plasmas tuvastamise kestust, mis anti-P-FH 1-5 puhul oli lühem (täiendav joonis S2) . Kokkuvõttes olid muutused C3 ja FB tasemetes pärast kummagi valgu süstimist lühemad kui C5 ja propidiini omad. Need andmed viitavad sellele, et plasma FB on selles seadistuses C3 konvertaasi aktiivsuse tundlik marker, samas kui propertydiin on C5 konvertaasi aktiivsuse marker. Nimelt tõusis pärast anti-P süstimist C5 24. ja 96. tunnil ning 7. päeval

Joonis 1| a) Täiendage alternatiivset rajast sõltuvat hemolüüsi testi. Antikehad tiitriti 2-kordsetes lahjendustes 60 nM kuni 0,5 nM. IgG-FH1-5, anti-P-FH1-5 ja anti-P reaktiivid vähendasid küüliku erütrotsüütide hemolüüsi annusest sõltuval viisil. IgG-kontrollvalgu inhibeerimist ei kasutatud. Horisontaalsed tulbad tähistavad keskmisi väärtusi ja vearibad tähistavad SD-d. ( b ) Plasma komplement C3 Cfh-/- hiirtel pärast sulandvalkude süstimist. Plasma C3 mõõdeti enne ja 24 tundi ja 96 tundi pärast IgG-FH1-5 (punased kolmnurgad, n ¼ 5) Anti-P-FH1-5 (lillad kolmnurgad, n ¼ 6), Anti manustamist. -P (rohelised punktid, n ¼ 5) ja IgG-kontroll (sinised punktid, n ¼ 5). Horisontaalsed tulbad tähistavad keskmisi väärtusi ja vurrud tähistavad SD. ***P # 0,001 võrreldes eeltöötluse väärtusega ja tuletatud 2-viisi ANOVA-st Bonferroni mitme võrdluse testiga. FH, faktor H; P, prodiin.

(Joonis 2d). Nagu teatatud, näitab 8, 9, et C5 konvertaas sõltub Cfh-/- hiirtel propidiinist.

IgG-FH1-5 ja anti-P-FH1-5 vähendasid glomerulaarset C3c-d, kuid ei muutnud Cfh–/– hiirtel C3d värvumist

Järgmisena hindasime IgG-FH1-5 ja anti-P-FH1-5 mõju glomerulaarsetele C3b/iC3b/C3c, C3d, propediini ja FH-ga seotud (FHR) valkudele. 96 tundi pärast IgG-FH1-5 süstimist vähenes glomerulaarne C3b/iC3b/C3c värvumine, kuid glomerulaarne C3d (joonis 3a) ja FHR värvumine (joonis 3b) mitte. Glomerulaarne C3b/iC3b/C3c jäi muutumatuks kas IgG-kontrolli või anti-P puhul. Ravimata Cfh-/- hiirtel9 püsis 96 tundi pärast IgG kontrolli glomerulaar-propadiini värvimise ebanormaalne lineaarne muster. Cfh–/– hiirtel, kellele süstiti kas anti-P või IgG-FH1-5, oli glomerulaarpropadiini tase 96 tunni pärast peaaegu tuvastamatu (joonis 3b). Ootamatult andis anti-P-FH1-5 süstimine tulemuseks granulaarse glomerulaarse värvumise mustri, kasutades anti-properdiini, anti-FH/FHR ja anti-IgG antikehi (joonis 3b). See leid viitas sellele, et anti-P-FH1-5 valk ladestub glomerulitesse. Anti-P-FH1-5 valgu süstimine metsiktüüpi hiirtele põhjustas glomerulaarse värvumise anti-properdiini, anti-FH/FHR ja anti-IgG antikehadega 96 tunni pärast (täiendav joonis S3), mis näitab, et see reaktiiv suhtleb normaalsete glomerulitega. Siiski oletasime, et anti-P-FH1-5 valk võib Cfh–/– hiirtel interakteeruda ka juba olemasoleva glomerulaarse propidiiniga. Kui me süstisime reaktiivi Cfh–/– hiirtele, keda oli glomerulaarse properdiini eemaldamiseks eelnevalt töödeldud anti-P-ga, vähenes granuleeritud värvimismustrid, kasutades properdiini-, FH/FHR- ja IgG-vastaseid antikehi ( Täiendav joonis S4). Need tähelepanekud näitavad, et anti-P-FH1-5 valgu glomerulaarne interaktsioon Cfh–/– hiirtel sõltub osaliselt glomerulaarsest propediinist.

IgG-FH1-5 leevendas neerukahjustust seerumi nefrotoksilise nefriidi kiirenemise ajal Cfh–/– hiirtel

C3G-ga patsientidel võib vahelduvate infektsioonide taustal tekkida äge neerukahjustus. Näiteks on neerufunktsiooni kaotus FHR5 nefropaatia korral seotud sünfarüngiitilise makroskoopilise hematuuria episoodidega.17 C3G-patsientide aluseks olev C3 düsregulatsioon põhjustab tõenäoliselt komplemendi poolt vahendatud neerukahjustuse suurenemist pärast neerupõletikku põhjustavat vallandamist. Selle modelleerimiseks kutsusime esile kiirendatud seerumi nefrotoksilise nefriidi, immuunkompleksi

Joonis 2| Plasma komplemendi profiili ajaline kulg Cfh–/– hiirtel, kellele süstiti IgG-FH1-5 ja anti-P-FH1-5. Plasma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) ja propediin (P; g,h) alates katse algusest kuni 27 päeva pärast IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; punased kolmnurgad, n ¼ 5) või anti-P-FH1-5 (b,d,f,h; lillad kolmnurgad, n ¼ 6). Kontrollid hõlmasid anti-P (rohelised täpid, n ¼ 5) ja isotüübile vastavat monoklonaalset antikeha (IgG-kontroll; sinised punktid, n ¼ 5). Horisontaalsed tulbad tähistavad keskmisi väärtusi ja vurrud tähistavad SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 versus eeltöötlusväärtus ja tuletatud 2-Bonferroni mitme võrdlustesti dispersioonanalüüsist. FB, tegur B; FH, tegur H.

glomerulonefriidi mudel, mis hõlmab komplemendi ja Fc retseptori vahendatud radu, 18, 19 Cfh-/- hiirtel. Varem näitasime, et Cfh–/– hiired on selles olukorras ülitundlikud neerukahjustuste suhtes7 ja oletasime, et FH1-5 valk võib AP regulatsiooni tugevdamise kaudu selles mudelis leevendada komplemendi poolt vahendatud neerukahjustusi. Kuna meie andmed näitasid, et anti-P-FH1-5 valk ladestus normaalsetes glomerulites, kasutasime seerumi kiirendatud nefrotoksilise nefriidi korral IgG-FH1-5. 24 tundi enne lamba nefrotoksilise seerumi süstimist süstiti hiirtele ip kas IgG-kontrolli (n ¼ 7) või IgG-FH1-5 (n ¼ 8). Katseprotokoll on kujutatud joonisel fig 4a. Hiired praagiti 6 päeva pärast lamba nefrotoksilise seerumi manustamist. Kõik kolm glomerulaarpatoloogia histoloogilist mõõdet (raskusaste, rakkude koguarv ja makrofaagide arv) olid IgG-FH1-5 rühmas oluliselt madalamad (joonis 4b). Tubulointerstitsiaalne vigastus oli väiksem ka IgG-FH1-5 rühmas (joonis 4b). Seerumi uurea sisaldus oli märkimisväärselt suurenenud

Joonis 3| Glomerulaarse komplemendi immunovärvimine Cfh–/– hiirtel 96 tundi pärast kas IgG-FH1-5 või anti-P-FH1-5 süstimist. (a) Tüüpilised kujutised koos glomerulaarsete C3b/iC3b/C3c ja C3d kvantifitseerimisega neljas katserühmas: IgG-FH1-5 (punased kolmnurgad, n ¼ 5), anti-P-FH1-5 (lillad kolmnurgad, n ¼ 6), anti-P (rohelised punktid, n ¼ 5) ja IgG-kontroll (sinised täpid, n ¼ 5). PlasmaC3 tase on joonisel 1 näidatud rakude ajal. (b) Andmepunktid tähistavad mediaanväärtusi ja vurrud tähistavad kvartiilidevahelist vahemikku. P väärtused on saadud Kruskal-Wallise testist Dunni mitme võrdluse testiga. (b) Tüüpilised kujutised glomerulaarsest IgG-st, FHR-st ja värvimisest neljas katserühmas. Riba ¼ 100 mm. AFU, suvalised fluorestseeruvad ühikud; FH, faktor H; P, prodiin. Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni aadressilwww.kidney-international.org.

IgG-kontrollrühmas, kuid seerumi albumiini ja uriini albumiini ja kreatiniini suhte muutused ei erinenud (joonis 4b). Ootuspäraselt vähenes glomerulaarne C3b/iC3b/C3c märkimisväärselt IgG-FH1-5 rühmas (joonis 4b), kuid glomerulaarne hiire IgG (joonis 4b) ja lamba IgG (andmeid pole näidatud) rühmade vahel ei erinenud .

Joonis 4| Eeltöötlemine IgG-FH1-5-ga leevendas neerukahjustusi Cfh–/– hiirte kiirenenud seerumi nefrotoksilise nefriidi ajal. a) Seerumi kiirendatud nefrotoksilise nefriidi protokolli skeem. Lamba IgG-ga eelimmuniseeritud hiired said 24 tundi enne lamba nefrotoksilise seerumi manustamist kas IgG-FH1-5 (ravirühm, n ¼ 8) või IgG-kontrolli (kontrollrühm, n ¼ 7). (b) Neerufunktsioon ja histoloogia 6 päeva pärast seerumi nefrotoksilise nefriidi kiirendatud esilekutsumist hiirtel, keda raviti kas IgG-FH1-5 (ravi; punased kolmnurgad, n ¼ 8) või IgG-kontrolliga (kontroll; sinised ringid, n ¼ 7). Horisontaalsed tulbad tähistavad mediaanväärtusi ja vurrud tähistavad kvartiilidevahelist vahemikku. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 versus kontroll ja tuletatud Mann-Whitney testist. FH, faktor H; P, prodiin.

ARUTELU

Nii IgG-FH1-5 kui ka anti-P-FH1-5 normaliseerisid Cfh–/– hiirtel C3, FB ja C5 taseme. See leid on kooskõlas tõsiasjaga, et hiire FH komplemendi reguleerivad domeenid asuvad SCR domeenides 1 kuni 5 (C3b-sidumissait ja kofaktori aktiivsus faktori I poolt vahendatud C3b lõhustamiseks).20 Pinnatuvastusdomeenid, mis mõjutavad hepariini ja endoteelirakkudega seondumist ning sisaldavad teist C3b-sidumissaiti, esinevad SCR domeenides 18 kuni

20 (FH18-20) ja seetõttu ei esine neid liitvalkudes.20 Sellegipoolest vähendasid mõlemad valgud glomerulaarset iC3b/C3b/C3c, mis näitab, et FH18-20 ei olnud selles seadistuses vajalik. See leid on kooskõlas varasemate andmetega, mis näitavad, et Cfh–/– hiirtel, kes ekspresseerivad mutantset FH valku, mis koosneb SCR domeenidest 1 kuni 15 (Cfh–/– .FHD16-20), ei arenenud ebanormaalset glomerulaarset C3 ladestumist.21,22 Kuid Cfh–/–.FH D16-20 loomad ei suutnud reguleerida C3 aktivatsiooni piki neerude endoteeli ja neil tekkis trombootiline mikroangiopaatia. Võimalik, et pinda sihtivate FH18-20 domeenide puudumise tõttu võib FH puudulikkuse korral FH1-5 sisaldavate liitvalkude manustamine põhjustada tundlikkust trombootilise mikroangiopaatia tekkeks. Samuti on võimalik, et suurenenud aviidsus C3b sidumisel liitvalkude dimeerse struktuuri all on piisav, et kompenseerida pinda sihtivate FH18-20 domeenide puudumist. Kuid C3b pinnatuvastust mõjutavad ka konformatsioonilised muutused FH-s.23 Streptococcus pneumoniae FH-d siduv valk (PspCN, mis seob SCR domeeni 9), käivitab FH konformatsioonimuutuse ning FH-PspCN kompleks oli suurendanud C3b seondumist ja suurenenud lagunemist kiirendav aktiivsus. FH20 C3d-sidumissait ei eksponeerita FH-s, vaid muutub paljastatuks FH-PspCN kompleksis. See võib seletada, miks FH19-20 interakteerub pinnaga C3d, kuid FH mitte.24,25 Me oletame, et meie ained võivad konformatsiooniliste muutuste kaudu tõhusalt suhelda nii vedelikufaasi kui ka pinnaga C3b. Eelkõige kaitsesid nii IgG-FH1-5 kui ka anti-P-FH1-5 erütrotsüüte lüüsi eest AP-sõltuva hemolüüsi testis.

Kumbki sulandvalk ei vähendanud glomerulaarse C3d värvimist, võib-olla glomerulaarse C3d püsiva olemuse tõttu. Eksperimentaalse immuunkompleksi nefriidi korral taandus glomerulaarne C3c 24 tunni jooksul pärast komplemendi aktivatsiooni lõppemist, kuid C3d püsis nädalaid.16 Lisaks on glomerulaarne C3d püsiv luupusnefriidi korral.26 See peegeldab tõenäoliselt selle kovalentset koostoimet glomerulaarsete pindadega. Inimese FH korduvad süstid Cfh–/– hiirtele näitasid glomerulaarse C3d vähenemist 10 päeva jooksul.11 On tõenäoline, et IgG-FH1-5 korduv annustamine võib selles mudelis vähendada glomerulaarset C3d. Samuti ei toimunud muutusi glomerulaarse FHR-i värvimises. Hiire FHR-valkude funktsioonide kohta on vähe teada, kuid nad võivad suhelda nii C3b27,28 kui ka C3d-ga.27 Tegelikult on nii FHR-A kui ka FHR-B näiv afiinsus C3d suhtes tugevam kui FH oma.27 Me oletame, et glomerulaarsed FHR-valgud eemaldatakse glomerulitest tõenäoliselt ainult siis, kui C3d on eemaldatud. Selles kontekstis on märkimisväärne, et inimese C3G-s seostub H-faktoriga seotud valk 5 glomerulaarse C3d-ga.29

Anti-P-FH1-5 valk vähendas ootuspäraselt vaba plasma properdiini taset, kuna selle sulandvalgu properdiinivastane osa võib blokeerida AP aktiivsust (properdiini ammendumise tõttu) 8 päeva jooksul pärast ühekordset süstimist.30 meie andmed näitasid, et FH1-5 efektiivsus plasma C3 taseme tõstmisel ja glomerulaarse C3b/iC3b/C3c värvumise vähendamisel oli kahe sulandvalgu vahel võrreldav (st ei sõltunud propidiini sihtimisest). Veelgi enam, ebanormaalne glomerulaar-propridiini värvumine vähenes pärast anti-P või IgG-FH{14}} manustamist märkimisväärselt. Ilmselt, erinevalt C3d- ja FHR-valkudest, puhastatakse glomerulaarne prodiin pärast C3 regulatsiooni taastamist kergesti. Glomerulaarne propediini muster muutus pärast anti-P-FH1-5 valgu manustamist, kuid selle muutis keeruliseks tähelepanek, et tuvastasime selle liitvalgu sadestumise nii Cfh–/– kui ka metsiktüüpi glomerulites. See oli osaliselt tingitud interaktsioonist glomerulaarse propidiiniga, kuid sadestumine metsiktüüpi glomerulites näitas, et see oli osaliselt ka glomerulaarsest komplemendist sõltumatu ja tõenäoliselt seotud liitvalgu füüsikalis-keemiliste omadustega.

Meie kineetilised andmed näitasid uudseid leide FB, C5 ja megfelelődiini ajaliste muutuste kohta, mis kaasnevad C3 suurenemisega Cfh-/- hiirtel pärast liitvalkude süstimist. FB tase tõusis pärast süstimist kiiresti

ja naasis algtasemele ajal, mil nii C5 kui ka megfelelődiini tase püsis kõrgenenud. Properdiini tase Cfh–/– hiirtel langes algtasemel ja tõusis normaalsele tasemele (20 mg/ml30) pärast IgG-FH1-5 süstimist ning püsis sellel tasemel vähemalt 14 päeva. Plasma C5 taseme tõusu puhul täheldati sarnast ajakulu. Hämmastav on see, et IgG-FH1-5 puudus enamasti vereringest 11 päeva pärast, mis näitab, et C5 konvertaasi moodustumine Cfh–/– hiirtel on aeglasem kui C3 konvertaasi oma (kuna C3 tase taastus algtasemele vahemikus 7 ja 11 päeva). Plasma C5 suurenes pärast anti-P-ravi ja suurenes veelgi anti-P-FH1-5 valguga. Seega aitasid nii propidiini sihtimine kui ka FH1-5 toime C5 taseme tõusule kaasa ja näitavad, et C5 konvertaas on Cfh–/– hiirtel osaliselt propidiinist sõltuv. See leid on kooskõlas C5 düsregulatsiooni leevendamisega hiirtel, kellel on kombineeritud FH ja propidiini puudulikkus.8,9 Tsirkuleerivat megfelelődiini taset saab C3G-s vähendada ja see näib olevat korrelatsioonis pinna C5 konvertaasi aktiivsusega, erinevalt kas plasma C5-st või lahustuvast C5b{ {30}}.31,32 Meie andmed toetavad intiimset seost propertydiini taseme ja C5-konvertaasi aktiivsuse vahel ning toetavad propertydiini taseme kasutamist glomerulaarse C5 pideva aktiveerimise biomarkerina.

Nimelt oli IgG-FH1-5 valk vereringes endiselt tuvastatav kuni 11 päeva pärast ühekordset süstimist. See on palju pikem, kui me varem teatasime konjugeerimata hiire FH1-5 valgu kohta, mis eemaldati vereringest 24 tunni jooksul.14 See leid näitab, et IgG-FH{ pikem poolväärtusaeg plasmas Valk {9}} tuleneb antikeha konjugatsioonist. Valgu IgG-FH1-5 poolväärtusaeg plasmas oli samuti pikem kui see, mida me varem täheldasime täispika FH puhul.10,11 Näiteks inimese FH eemaldati vereringest 96 tundi pärast ühekordset süstimist. Cfh–/– hiirtel.11 Koos meie andmetega, mis näitavad IgG-FH1-5 valgu efektiivsust komplemendi regulatsioonis, arvame, et FH1-5 valgu konjugatsioonil selle farmakokineetilise profiili pikendamiseks on potentsiaalne terapeutiline toime utiliit C3G-s.

Kokkuvõttes näitame, et vaatamata pinnatuvastusdomeenide puudumisele vähendasid FH1-5 sulandvalgud tõhusalt glomerulaarset C3 aktivatsiooni ja taastasid plasma komplemendi regulatsiooni FH puudulikkuse korral. FH1-5 domeenide konjugeerimisel antipropadiiniga ei olnud ilmset eelist ja valk IgG-FH1-5 vähendas neerukahjustust eksperimentaalse nefriidi korral. Vastupidiselt väljakutsetele FH suuremahuliste preparaatide tootmisel terapeutiliseks kasutamiseks on antikehadel põhinevate ravimeetodite laiaulatuslik tootmine hästi välja kujunenud, mis muudab IgG-FH{10}} atraktiivseks potentsiaalseks terapeutiliseks vahendiks C3G jaoks.

MEETODID

Liitvalgud

IgG-FH1-5. Esimesed 5 hiire FH SCR domeeni (mFH1-5) on lingitud

mittesihtmärgiks olevale IgG1 hiire Ig-le (hiire monoklonaalse antikeha vastu tekitatud anti-idiotüüpne antikeha).

Anti-P-FH1-5. Hiire FH1-5, mis on seotud hiire properdiinivastase antikehaga (anti-P),30 andis Alexionile W. Song, Pennsylvania ülikool).

Juhtnupud. Kontrollid olid isotüübiga sobitatud mittesihitud hiire Ig (IgG-kontroll) ja hiire anti-properdiin (anti-P) (täiendav joonis S1). Valgud genereeriti pVEK vektorite ja Expi293 rakkudega (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), puhastati A-valguga (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

AP-spetsiifiline hemolüütiline analüüs

Kakskümmend protsenti normaalset hiire seerumit, tiitritud 60 nM kuni 0,5 nM, inkubeeriti küüliku erütrotsüütidega (1 5 106 rakku/ml) 37 °C juures 30 minutit. Heemi vabanemine kvantifitseeriti spektrofotomeetriliselt (optiline tihedus 415 nm); 100-protsendiline lüüs oli seerum ilma inhibiitorita.

Plasma FB ja FH

Plasma saadi pärast etüleendiamiintetraäädikhapet sisaldavatesse katseklaasidesse kogutud vere tsentrifuugimist (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Saksamaa). Valke mõõdeti kapillaarelektroforeesi immuunanalüüsiga (WES, ProteinSimple, San Jose, CA). Kasutatud antikehad olid polüklonaalsed hiirevastased FH antikehad (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) ja hiire FB-vastased antikehad (Abcam, Cambridge, UK); Kasutati WES-i küülikuvastast tuvastamismoodulit (ProteinSimple, San Jose, CA). Kemiluminestsentssignaale analüüsiti Compass for SW tarkvaraga (ProteinSimple, versioon 5.{6}}.1), kvantifitseeriti piigi pindaladena ja normaliseeriti testi kontrolliks.

Hiired

Kõik hiired peeti spetsiifilistes patogeenivabades tingimustes; protseduurid viidi läbi vastavalt institutsionaalsetele juhistele ja Ühendkuningriigi siseministeeriumi poolt heaks kiidetud. C57BL/6 metsiktüüpi hiired osteti ettevõttest Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) ja Cfh–/– hiired loodi vastavalt eelnevalt kirjeldatule.7 Hiired sobitati vanuse ja soo järgi; ekvimolaarsed valkude annused manustati ip süstimise teel (1 mg antiproperdiini ja IgG kontrolli jaoks; 1,4 mg IgG-FH1-5 ja anti-P-FH1-5 jaoks). Kiirendatud seerumi nefrotoksiline nefriit kutsuti esile lamba nefrotoksilise seerumi iv süstimisega hiirtele, keda oli eelnevalt immuniseeritud lamba IgG-ga.7 Liitvalkude manustamine viidi läbi 24 tundi enne lamba nefrotoksilise seerumi esilekutsumist (joonis 4a).

C3, C5 ja vaba propidiin Plasma C3 mõõdeti ensüümseotud immunosorbentanalüüsiga.14 Plasma "vaba" propidiini ja C5 tasemed mõõdeti elektrokemoluminestsents-immunoanalüüside abil (Meso Scale Discovery [MSD], Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) koos antigeenidega. - Prodiin või kohandatud hiirevastane C5, mis on kaetud kõrge sidumisvõimega MSD plaatidel. Seotud "vaba" properdiin ja C5 tuvastati anti-properdiiniga (firmalt W. Song) või biotinüülitud monoklonaalse anti-C5-ga (Alexion) kombineerituna streptavidiin-SULFO-ga (MSD, Meso Scale Diagnostics). Kemoluminestsentssignaal saadi SECTOR S 6000 kujutisega (MSD, Meso Scale Diagnostics) ja analüüsiti tarkvaraga MSD Discovery Workbench (Meso Scale).

Diagnostika, versioon 4.{1}}.12.1). Standardidena kasutati rekombinantset hiire propidiini ja C5.

Neerufunktsioon ja histoloogia

Hematuuriat ja proteinuuriat hinnati kasutades Hema-Combistixi (Bayer, Reading, UK); Plasma uureat mõõdeti ja neerukudet töödeldi, nagu eelnevalt kirjeldatud.9 Uriini kreatiniinisisaldus määrati uriini punktproovidest, kasutades Creatinine Companion Protocol analüüsi (nr 1012; Excell, Philadelphia, PA) ja punkturiini/ plasma albumiini mõõdeti ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsiga (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Perioodilise happe-Schiffiga värvitud neerulõike hinnati pimemeetodil ja järjestati glomerulaar- ja tubulointerstitsiaalse kahjustuse raskusastme järgi (0 [puudub], 1 [kerge], 2 [mõõdukas]). Glomerulaarsete rakkude keskmise arvu määramiseks hinnati kümmet glomeruli sektsiooni kohta. Immunofluorestsentsvärvimine viidi läbi 5- mm krüosektsioonidel, mis olid paigaldatud Vectashieldi söötmele koos DAPI-ga (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Kasutatud antikehad olid fluorestseiini isotiotsüanaadiga (FITC) konjugeeritud polüklonaalne kitse hiirevastane C3b/C3c/iC3b (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; Viigiahela-spetsiifiline FITC-konjugeeritud polüklonaalne kitse hiirevastane IgG (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); FITC-konjugeeritud monoklonaalne hiire anti-kitse/lamba IgG (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); või FITC-konjugeeritud kitse inimesevastane propidiin (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immu- no logic Laboratories, Kopenhaagen, Taani).9 Biotinüülitud kitse hiirevastane C3d (1:10; # BAF2655; R&D Systems , Minneapolis, MN) kasutati biotiiniga blokeeritud lõikudel (Biotin Blocking System; Agilent Dako, Santa Clara, CA) koos streptavidiini AF488 sekundaarse antikehaga (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). FH visualiseeriti puhastatud roti hiirevastase CD16/CD{52}}blokeeritud lõikudes (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), kasutades kitse inimesevastast FH-d (1:1000; #A312; Quidel, San Diego , CA) ja monoklonaalne kitsevastane IgG-FITC sekundaarne antikeha (1:100; kloon GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Glomerulaarsed makrofaagid identifitseeriti, kasutades FITC-konjugeeritud roti hiirevastast CD68 (FA-11 kloon GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). Kvantitatiivne immunofluorestsentsanalüüs viidi läbi Leica DM4B optilise mikroskoobiga, mis oli ühendatud Leica DFC700T digitaalkaameraga (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksamaa) ja Image-Pro Plus tarkvaraga (Media Cybernetics, Rockville, MD, versioon 7). Sektsiooni kohta uuriti kümmet glomerulit ja keskmine intensiivsus väljendati suvalistes fluoresoloogilistes ühikutes.

Statistiline analüüs

Statistilise analüüsi jaoks kasutati GraphPad Prismi versiooni 8.{1}} (GraphPad, San Diego, CA). Ajakulu analüüsiks kasutati korduvate mõõtmiste 2-viisi dispersioonanalüüsi Bonferroni mitme võrdluse testiga (tegurid olid aeg ja ravi). Mitme rühma võrdlemisel kasutati Kruskal-Wallis ja Dunni mitme võrdluse testi ja Mann-Whitney testi kahe rühma jaoks.

AVALIKUSTAMINE

MCP on saanud nõustamistasusid firmadelt Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope ja Achillion Pharmaceuticals. HTC on saanud nõustamistasusid firmadelt Alexion, Novartis, Aurinia ja Achillion Pharmaceuticals. YZ, YW, KKJ ja SK-K on Alexion Pharmaceuticalsi töötajad. SK on endine Alexion Pharmaceuticalsi töötaja ja praegu töötab ettevõttes Gemini Pharmaceuticals. Kõik teised autorid ei deklareerinud konkureerivaid huve.

TUNNUSTUS

MCP on Wellcome Trusti kliinilise teaduse vanemteadur (toetuse viide 212252/Z/18/Z) ning see stipendium toetab ACG-d ja DPL-i. YZ, SK, YW, KKJ ja SK-K rahastas Alexion Pharmaceuticals.

LISAMATERJAL

Täiendav fail (PDF)

Joonis S1. Selles uuringus kasutatud fusioonproteiin.IgG-FH1-5 sisaldab hiirefaktori H (FH1-5) 5 esimest domeeni, mis on seotud mittesihitava hiire Ig-ga. Anti-P-FH1-5 koosneb mFH1-5-st, mis on seotud neutraliseeriva hiire anti-hiirepropadiini antikehaga (anti-P; vt Miwa et al.30). Kontrollvalkude hulka kuulusid isotüübiga sobitatud mittesihtmärgiks olev hiire Ig (IgG-kontroll) ja neutraliseeriv hiire anti-hiirepropadiini antikeha (Anti-P). Joonis S2. WES blot analüüs FH1-5 tuvastamiseks FH-puudulike hiirte plasmaproovides, kellele on süstitud kas (A) IgG-FH1-5 või (B) Anti-P-FH1-5. 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5) on tuvastatav kuni 11 päeva pärast IgG-FH1-5 süstimist ja kuni 4 päeva pärast anti-P-FH1-5 valgu (punased kastid) süstimist ).Kaasa arvatud metsiktüüpi hiirte plasma, kus tuvastatakse täispikk H-faktori valk (FH, mustad kastid, rada C1) ja süstimata FH-puudulikud hiired, kus FH-d ei esine (mustad kastid, rada C2). Nagu oodatud, ei ole FHnorFH1-5 tuvastatav anti-P või IgG-kontrolli süstitud hiirte plasmaproovides.

Joonis S3. Glomerulaarse komplemendi immunovärvimine 96 tundi pärast IgG-kontrolli või anti-P-FH1-5 süstimist metsiktüüpi hiirtele. Kuvatakse tüüpilised glomerulaarkujutised (riba ¼ 100 mm).

Joonis S4. Procediini roll anti-P-FH1-5 ladestumisel FH-puudulike hiirte glomerulites. Cfh–/– hiirtele süstiti kas IgG-kontrolli või anti-P-d (ravi 1), millele järgnes 24-tunde hiljem kas IgG-kontroll või anti-P-FH1-5 (ravi 2). Loomad praagiti 120 tundi pärast esimest töötlemist ja hinnati glomerulaarset värvimist IgG, megfelelődiini ja FH/FHR suhtes. Näidatakse esinduslikke pilte. Anti-P süstimine vähendas märkimisväärselt propertydiini (rida 1, veerg 2), kuid mitte FH/FHR (jääb muutumatuks) ega IgG (puudub) värvumist. Anti-P-FH{20}}tundide pärast IgG-kontrolli manustamine põhjustas anti-IgG, anti-FH/FHR ja anti-P antikehadega granuleeritud värvumise, nagu ilmnes pärast anti-P-FH süstimist 1-5 üksi (vt joonis 3b). See teraline värvumine vähenes, kui anti-P-FH1-5 süstimisele eelnes anti-P süstimine, mis tühjendab nii tsirkuleerivat (vt joonis 1h) kui ka glomerulaarsust (vt joonis 3b). Glomerulaarne värvumine anti-IgG-ga ilmnes ainult hiirtel, kellele süstiti anti-P-FH1-5 (rida 3, veerud 3 ja 4) ja oli oluliselt madalam hiirtel, kes said anti-P-FH1-5 millele eelneb anti-P. Jõudsime järeldusele, et anti-P-FH1-5 ladestumine Cfh–/– hiirte glomerulitesse sõltus osaliselt propertydiinist. Horisontaalsed tulbad tähistavad mediaanväärtusi ja vurrud tähistavad kvartiilidevahelist vahemikku. P-väärtus tuletati Mann-Whitney testist. Varras ¼ 100 mm.

VIITED

1.FakhouriF, Frémeaux-Bacchi V, Noöl LH jt C glomerulopathy∶ uus dassifikatsioon. Nat Rev Nephrol.20106:494-499.

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripaatia – haruldase komplemendi poolt põhjustatud tõelise haiguse mõistmine. Nat ReyNephrol.201915129-143

3. Pickering MC, Cook HT. Translational mini-review seeriad komplemendi faktori H kohta: neeruhaigused, mis on seotud komplemendi faktoriga H, uudsed arusaamad inimestelt ja loomadelt. Cin Exp Immunol.2008;151:210-230.

4. Daha MR Fearon DT Austen KF, C3-nekriitne tegur (C3NeF）∶vedeliku faasi ja rakuga seotud alternatiivse raja konvertaasi stabiliseerimine). J Immunol 1976;116:1-7.

5. Mollnes TE, Ng YC, Peters DK, jt nefriitilise faktori mõju C3-le ja komplemendi terminaalsele rajale in vivo ja in vitro. Oin Exp Immunol. 1986;65:73-79.

6. Nq YC, Peters DK. G3 nefriitiline faktor (C3NeF): alternatiivse raja C3 konvertaasi rakuga seotud ja vedelikufaasi stabiliseerimise dissotsiatsioon. Cn Exp Imunol.19865:450-457.

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J jt Kontrollimatu C3 aktivatsioon põhjustab membranoproliferatiivset glomerulonefriiti hiirtel, kellel puudub komplementfaktor H. Nat Genert.2002:31;424-428.

8. Lesher AM, Zhou L, Kimura Y jt. H-faktori mutatsiooni ja megfelelődiini puudulikkuse kombinatsioon põhjustab tõsist C3 glomerulonefriidi. J Am Soc Nephrol. 2013;24:53–65.

9. Ruseva MM, Veron KA, Lesher AM jt. Profaktiini kadumine süvendab H-faktori puudulikkusest tulenevat C3 glomerulopaatiat. J Am Soc Nephrol. 2013;24:43-52.

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M jt. Tegur H hõlbustab GBM-iga seotud iC3b kliirensit, kontrollides C3 aktiveerimist vedelikufaasis. Mol Immunol.2009;46:1942-1950.

11Fakhouri F, de Jorge EG. Brune F et al. Ravi inimese komplemendi faktoriga H muudab kiiresti H-faktori puudulikkusega hiirte komplemendi ladestumise neerudesse. Kidney Int.2010:78:279-286.

12. Michelfelder S, Parsons J, Bohlender Ll jt Mossi toodetud glükosüülimisel optimeeritud inimfaktor H terapeutiliseks kasutamiseks komplemendi häirete korral. JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474.

13. Nichols EM, Barbour TD, Pappworth Y jt Laiendatud minikomplementfaktori H molekul parandab eksperimentaalset C3 glomerulopaatiat. Kidney Int. 201588:1314-1322.

14. Ruseva MM, Peng T, Laser MA jt. Suunatud komplemendi inhibeerimise efektiivsus eksperimentaalses C3 glomerulopaatias. J Am Soc Nephrol. 2016;27:405-416.

15. Yang Y, Denton H, Davies OR et al. Komplemendi faktori H konstrukt C3 glomerulopaatia raviks. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1649-1661.

16. Schulze M, Pruchno CJ, Burns M jt. Glomerulaarne C3-klokaliseerumine näitab eksperimentaalse glomerulonefriidi pidevat immuunladestumise moodustumist ja komplemendi aktivatsiooni. Olen J PatholL. 1993:142179-187.

17. Athanasiou Y, Voskarides K Gale DP jt CFHRS mutatsioonidega seotud perekondlik C3 glomerulopaatia 91 patsiendi kliinilised omadused 16 sugupuust. CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. Kaneko Y, Nimmer动hn F, Madaio MP, et al. Patoloogia ja kaitse nefrotoksilise nefriidi korral määratakse spetsiifiliste Fc retseptorite selektiivse kaasamisega. J Exp Med.2006;203:789-797.

19. Sheerin NS, Springall T, Carroll MC et al. Kaitse glomerulaarse basaalmembraani vastase (GBM-vahendatud nefriit C3-ja C4-puudulike hiirte vastu. C Exp Immunol. 1997;110:403-409.

20. Cheng ZZ Hellwae J, Seeberger H et al. Hiire ja inimese komplemendi faktori H.Mol Immunol.2006;43.972-979 pinnatuvastus- ja C3b sidumisomaduste võrdlus.

21dp kalamari EG. Macor P.Paixao-Caakante D. jt Tüüpilise hemolüütilise ureemilise sündroomi kujunemine sõltub komplemendist C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:137-145.

22.Pdkering MC, de Jorge EG.Martinez-Barricarte Ry jt Spontaanne hemolüütiline ureemiline sündroom, mille vallandab komplemendi faktor H, millel puuduvad pinnatuvastusdomeenid. J Exp Med.2007;204:1249-1256.

23Herbert AP. Mike E, Chen ZAet al. Komplemendi kõrvalehoidmine, mida vahendab püütud faktori H suurendamine: mõju enesepindade kaitsmisele komplemendi eest. J Immunol. 2015;195:4986-4998.

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH et al. Komplemendi faktori H-ga seotud valkude dimeriseerimine moduleerib komplemendi aktivatsiooni. Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690.

25. Schmidt CQ, Bai H Lin Z jt. Unikaalsete kolmekordse sihtimise omadustega minimeeritud immuuninhibiitori ratsionaalne projekteerimine. J Immunol. 2013;190:5712-5721.

26. Wilson HR, Medjera-Thomas NR, Gilmore AC jt. Glomerulaarmembraani rünnakukompleks ei ole pidev C5 aktivatsiooni usaldusväärne marker luupusnefriidi korral. Kidney Int. 2019.{4}}.

27. Antonioli AH White J, Crawford F jt. Komplemendi alternatiivse raja moduleerimine hiire faktori H-ga seotud valkude abil. J Immunol. 2018;200:316-326.

28. Cserhalmi M, CsincsiALMezei Z et al. Hiire H-faktoriga seotud valk FHR-B soodustab komplemendi aktivatsiooni. Front Immunol.20178:1145.

29. Medjeral-Thomas NR, Moffett H, Lomax-Browne HJ jt. Glomerulaarse komplemendi faktori H-ga seotud valk 5 (FHR5) on C3 glomerulopaatia korral väga levinud ja seotud neerukahjustusega Kdney Int Ren. 2019;4:1387-1400.

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D jt. Produktiini, alternatiivse raja ja anafülatoksiini retseptorite blokeerimine parandab neeruisheemia-reperfusioonikahjustusi lagunemist kiirendava faktori ja CD59 topeltknockoutiga hiirtel. J Immunol. 2013;190:3552-3559.

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P jt C5 konvertaasi düsregulatsiooni biomarkerina C3 glomerulopaatias esinev seerumi tarbimine. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM, Zhou L Kimura Y jt. H-faktori mutatsiooni ja megfelelődiini puudulikkuse kombinatsioon põhjustab raske C3 glomerulonefriidi.JAm Soc Nephrol.2013;2453-65.

32. zhang Y, Nester OM Martin B. et al. C3 glomerulopaatia komplemendi biomarkeri profiili määratlemine. Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882.