Kombineeritud pannanoomika ja transkriptoomika paljastab kiiresti areneva taime patogeeni põhi- ja üleliigsed virulentsusprotsessid
Dec 05, 2023
Abstraktne
Taust
Kiiresti arenevate patogeenide genoomse variatsiooni uurimine võimaldab potentsiaalselt tuvastada geene, mis toetavad nende "põhibioloogiat", mis on olemas, funktsioneerivad ja ekspresseeruvad kõigi tüvede või "paindliku bioloogia" poolt, varieerudes tüvede vahel. Paindlikku bioloogiat toetavaid geene võib pidada "tarvikuteks", samas kui "tuum" geenikomplekt on tõenäoliselt oluline patogeeni liigibioloogia ühiste tunnuste, sealhulgas kõigi peremeesorganismi genotüüpide virulentsuse jaoks. Nisu patogeenne seen Zymoseptoria tritici kujutab endast üht kõige kiiremini arenevat ohtu ülemaailmsele toiduga kindlustatusele ja oli selle uuringu keskmes.
Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi
Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin
【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Tulemused
Konstrueerisime 18 Euroopa väliisolaadi pangenoomi, millest 12 allutati nakatumise ajal ka RNAseq transkriptsiooniprofiilidele. Neid andmeid kombineerides ennustasime "tuuma" geenikomplekti, mis sisaldas 9807 järjestust, mis olid (1) olemas kõigis isolaatides, (2) millel puudusid inaktiveerivad polümorfismid ja (3) mida ekspresseerisid kõik isolaadid. Samuti määratleti suur lisagenoom, mis koosneb 45% kõigist geenidest. Klassifitseerisime geneetilise ja genoomse polümorfismi nii kromosomaalses kui ka individuaalses geeniskaalas. Oluliste funktsioonide, sealhulgas virulentsuse, jaoks vajalikel valkudel oli põhigeenide järjestuse varieeruvus keskmisest väiksem. Nii tuuma- kui ka lisagenoomid kodeerisid paljusid väikeseid sekreteeritud efektorkandidaatvalke, mis tõenäoliselt interakteeruvad taimede immuunsusega. Viirusvektori poolt vahendatud mööduv 88 kandidaadi planta üleekspressioon ei suutnud tuvastada ühtegi haigusele iseloomulikku lehenekroosi. Kuid mittepatogeense deletsioonmutandi, millel puudus viis põhigeeni, funktsionaalne komplementatsioon näitas, et täielik virulentsus taastati ühe geeni uuesti sissetoomisega, millel oli vähim järjestuse polümorfism ja kõrgeim ekspressioon.
Järeldused
Need andmed toetavad pangenoomika ja transkriptoomika kombineeritud kasutamist geenide määratlemiseks, mis esindavad kiiresti arenevate patogeenide põhilisi ja potentsiaalselt kasutatavaid nõrkusi.
Märksõnad
Rebasesaba mosaiikviirus, Septoria tritici, nekrotroofne efektor, olulised geenid, lisakromosoomid, dothideomycetes,Kromosoomide ebastabiilsus, Mycosphaerella spp
Taust
Loomi ja taimi mõjutavate nakkushaiguste jätkusuutlikku tõrjet seab kahtluse alla põhjuslike mikroorganismide areng [1, 2]. Kõige raskemini kontrollitavad haigused on need, mida põhjustavad kõige kiiremini arenevad liigid, mis suudavad kiiresti reageerida selektiivsele survele, sealhulgas peremeesorganismi loomulikule immuunsusele, ebasoodsatele keskkonnatingimustele ja/või infektsioonivastastele ravimitele [1, 3]. Mikroobsete patogeenide potentsiaali kiireks arenemiseks määravad mitmed tunnused, sealhulgas muu hulgas; (1) kiire elutsükkel ja (2) seksuaalset paljunemist soodustavad mehhanismid [4]. Viimane võib kaasa tuua patogeenipopulatsioonides eksisteeriva suure püsiva geneetilise variatsiooni taseme, mida saab säilitada ja võimendada välise selektiivse surve korral. Kuigi teatud geenidel võib olla tõenäoline loomulik geneetilise järjestuse varieeruvus, mis juhib nende evolutsiooni, ei saa teisi kaduda (või mutatsiooni tõttu inaktiveerida), ilma et see mõjutaks patogeenide sobivust. Eukarüootsete ja prokarüootsete taimede patogeenide puhul on see erinevus geenide polümorfismide tasemetes viinud "kahekiiruseliste genoomide" [5] realiseerimiseni, mis koosnevad mõnest komponendist, mis arenevad kiiresti ja mis arvatakse reageerivat välistele mõjuritele (peremeeste vahemik ja immuunsus jne), samas kui aeglasemalt arenev komplekt sisaldab põhiliste majapidamis- ja muude oluliste funktsioonidega geene. Patogeeni genoomide lisa- ja põhiosad saab koondada "pangenoomiks", mis peaks esindama peaaegu kogu liigis esinevat geenide komplekti [6]. Pangenoomide südamiku- ja lisaosade suurus varieerub bakteri-, seen- ja munamütseediliikide lõikes [7–13] ning võib anda märku mikroobipopulatsioonide potentsiaalist areneda kiiresti selektiivse surveni. On mõeldav, et mida suurem on lisapangenoom tuuma suhtes, seda võimekamad on need populatsioonid kiiresti arenema. Nisu askomütseedi seenpatogeen Zymoseptoria tritici on Septoria tritici blotch (STB), ülemaailmselt olulise haiguse, mis ohustab toiduga kindlustatust, põhjustaja [14]. Patogeeni on pikka aega peetud ka populatsioonibioloogia ja evolutsiooni uuringute mudelsüsteemiks [15–18]. Selle põhjuseks on asjaolu, et Z. triticil on kõrge seksuaalse rekombinatsiooni määr, mis säilitab oma populatsioonides suurel hulgal püsivat geneetilist mitmekesisust ja võimaldab kiiret kohanemist nii globaalsel kui ka kohalikul tasandil [17, 19–24]. Selle tulemusena ületatakse kiiresti peamised nisu geenid, mis annavad resistentsuse Z. tritici suhtes [25]. Lisaks kaotab enamik laialdaselt kasutatavaid kaubanduslikke fungitsiide aja jooksul oma tõhusust [3]. Nende kahe teguri kombinatsioon ohustab ülemaailmset nisutoodangut, millega tuleb kiiresti tegeleda. Z. tritici on hiljuti esile kerkinud ka patogeenide genoomika uue mudelina, millel on nüüd saadaval palju kvaliteetseid genoomiviiteid [26], lisaks pangenoomidele, mis on konstrueeritud paljudest üksikutest isolaatide genoomidest [27, 28]. Võib-olla on Z. tritici genoomi üks huvitavamaid omadusi 13 tuuma kromosoomi (1-13) olemasolu, mida leidub kõigis isolaatides, kuid seejärel kuni 8 väiksemat lisakromosoomi (14-21), mis näitavad isolaatide olemasolu/puudumine ja struktuurne polümorfism [26, 29]. Õnneks kannab üks kogukonna võrdlusisolaatidest ja esimene täielikult sekveneeritud Hollandi väliisolaat IPO323, mis koguti 1980ndatel, 21 kromosoomi, mis on seni suurim arv. Seetõttu on IPO323 suurepärane võrdlusalus teiste isolaatide varieerumise uurimiseks ja karkassina pangenoomide ehitamisel.
cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi
Z. tritici aseksuaalne nakkustsükkel on tüüpiline paljudele seotud taimepatogeenidele, mis mõjutavad paljusid toidukultuure [30]. Need seened, mis kuuluvad Dothideomycetes'i seltsi Mycosphaerellaceae perekonda, tungivad taimekudedesse tavaliselt stoomide kaudu [30, 31]. Seejärel järgneb taimerakkude vaheline pikaajaline asümptomaatiline kasv, mis kestab vähemalt 8 päeva, mis lõpeb järsult nekrootiliste lehtede kahjustuste moodustumisega – olukord, mis Z. tritici puhul näib olevat taime "hüperaktiveerimise" tulemusena. immuunsus [32–34]. Taimerakkude surma seostatakse seejärel uute sporulatsioonistruktuuride, pükniidide moodustumisega substomataalsetes õõnsustes ning sellele järgnenud äsja moodustunud püknidiospooride ekstrusiooni ja levikuga sademete pritsmete perioodidel. On näidatud, et teised Dothideomycetes seened kutsuvad esile taimede immuunsuse hüperaktiveerimise tundlikes taimedes äratuntavate valgu "efektorite" sekretsiooni kaudu, mille tulemuseks on rakkude ja kudede surm (nekroos või programmeeritud rakusurm). Need nekrotroofsed seened saavad sellest vastusest kasu ja kaasatud efektorvalke nimetatakse nüüd nekrotroofseteks efektoriteks [35, 36]. Kuigi on mõningaid esialgseid tõendeid selle kohta, et Z. tritici võib sümptomaatilisele kasvule üleminekul rakendada ka nekrotroofilisi efektoreid [37], viidates lehtede kahjustustele, ei ole seda hüpoteesi siiani kindlalt kontrollitud. Kaks vastastikku mittevälistavat viisi tulevase nisutoodangu kaitsmiseks STB mõju eest on (1) suurendada taimede loomulikku resistentsust haigustele ja (2) tuvastada uued molekulaarsed sihtmärgid, mida saaks kasutada haiguste tõrjeks. Ideaalis võimaldaksid need patogeeni selektiivset kontrolli, piirates samal ajal muid keskkonna- ja ökoloogilisi mõjusid. Patogeeni genoomika ja eriti pangenoomika pakuvad potentsiaali mõlema strateegia täiendamiseks. Kuigi lisaseadme, kiiresti arenev pangenoomi osa kodeeritud valgud võivad sisaldada paljusid geene, mis interakteeruvad taime immuunsusega (nt efektorid), võib tuumagenoom sisaldada sihtmärke, mis muteeruvad negatiivsete sobivuse (ja virulentsuse) karistuste tõttu. Sel põhjusel on põllumajanduslikud fungitsiidid tavaliselt suunatud põhiprotsessidele, mida peetakse arvatavasti vähem muutuvateks. Kuid nagu eelnevalt mainitud, võivad isegi need sihtmärgid keemilisest inhibeerimisest kõrvalehoidmiseks mingil määral areneda, nagu on kirjeldatud paljude praeguste fungitsiidi sihtvalkude puhul [3, 14]. Enamik seni kasutatud fungitsiide on suunatud üsna kitsale molekulaarsetele protsessidele (nt steroolide biosüntees, hingamine jne) [3]. Võimalik, et on palju muid sihtmärke, mida saaks kasutada seenpatogeenide selektiivseks tõrjeks, mis peaksid tekkima mitme omika andmestiku kombineerimisel ja analüüsimisel. Suurt avastamispotentsiaali rõhutab asjaolu, et tavaliselt kuni 40% kõigist patogeensete seente (ja seente üldiselt) genoomijärjestustest tuvastatud geenidest on siiani teadmata funktsiooniga. Eriti olulised võivad olla need, mis esinevad ja võivad olla konserveerunud patogeensete seente tuumagenoomis.
Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >80% geenidest on märgitud tuumana [10]. Teised taimedega seotud leekseente analüüsid on aga ennustanud suuremaid lisageenikomponente, sealhulgas ~ 38% patogeenide Claviceps purpurea [38] ja ~ 44% Pyrenophora tritici-repentis [39] puhul. Varasemad põhjalikud pan-genoomilised uuringud Z. tritici kohta on kasutanud globaalseid ja ajaloolisi populatsioone, mis hõlmavad suurt isolaatide arvu, mis on sekveneeritud nii fragmenteeritud kui ka täieliku genoomi skaalal [27, 28]. Need uuringud tuvastasid selle liigi jaoks suure lisageenide komplekti (~ 40% kõigist geenidest). Lisaks oli see korrelatsioonis ulatusliku olemasolu / puudumise ja kromosomaalsete struktuursete polümorfismidega, mis hõlmas ka dünaamilisi korduvaid elemente (sealhulgas ülekantavaid elemente). Täiendav analüüs näitas ka, et paljud lisageenid ekspresseeruvad (keskmiselt) vähem kui põhigeenid. Need uuringud kujutavad endast Z. tritici liigi pangenoomi struktuuri "kuldstandardit" ja seni kõige põhjalikumat mis tahes niitja seente kohta. Selle ja teiste liikide puhul jääb aga küsimus, mil määral saab pangenoomikat kasutada põhiliste virulentsusgeenide ja -protsesside tuvastamiseks. Ja kas põhigeenide komplektides reedavad aminohapete muutusi mõjutavate kogu populatsiooni hõlmavate polümorfismide tasemed ja geeniekspressioonitasemed peamiste patogeenide virulentsusgeenide identiteedi?
Selles uuringus oleme ühendanud genoomi sekveneerimise ja RNAseq-põhised transkriptoomilised lähenemisviisid, et toota pangenoom hiljutisest Euroopa Z. tritici isolaatide kogust. Meie peamine eesmärk oli testida, kas isolaatide vahel madala aminohappe polümorfismiga (st kodeerivates järjestustes) valke kodeerivates tuumagenoomis esinevad geenid täidavad olulisi funktsioone, sealhulgas olulist rolli nisu tuuma nakatumise protsessides. Kooskõlas varasemate uuringutega [27, 28] demonstreerime, et Z. triticil on äärmiselt suur lisagenoom (~45% kõigist geenidest), mis toetab selle kiiresti arenevat staatust. Lisaks pakume bioloogilisi andmeid, mis toetavad selgelt mõlema omika meetodi kombineeritud kasutamise kasulikkust uute tuumvirulentsusgeenide tuvastamiseks. Vastupidiselt, suure läbilaskevõimega viiruse poolt vahendatud funktsionaalsete valkude üleekspressiooni sõeluuringud ei suutnud tuvastada ühtegi kandidaati nekrotroofilist mõjurit, mis vastutaks nisu lehtedes haiguskahjustuste esilekutsumise eest kas tuum- või lisapangenoomist.
cistanche taime suurendav immuunsüsteem
Tulemused
Euroopa Z. tritici kollektsiooni virulentsusekraanid tuvastavad sarnaselt agressiivsed tüved geograafiliselt sidumata asukohtadest
Testisime 43 Z. tritici isolaadi virulentsust 21 laialdaselt vastuvõtlikul Euroopa leivanisusordil, et saada kokku 2709 andmepunkti (sh kolm kordamist). Eraldamise teave (kood ja päritoluriik) on esitatud lisafailis 1: Tabel S1. Iga interaktsiooni hinnati kvantitatiivselt järgmiste parameetrite osas: (1) inkubatsiooniperioodi pikkus, (2) aeg, mis kulus täieliku nekroosini (kui see ilmnes) ja (3) aseksuaalse sporulatsiooni tase (joonis 1A). Tuginedes nii arvutuslikule kui ka visuaalsele haigusskoorile (vt meetodid ja lisafail 2: joonis S1), rühmitati kõik isolaadid testitud kultivaride paneelil nende virulentsusprofiilide alusel (joonis 1B). Positiivne kontroll-isolaat IPO323, mis toimib globaalse võrdlusalusena [26] koos täielikult sekveneeritud genoomiga, oli peaaegu kõigi kultivaride suhtes vähem agressiivne kui enamik testitud isolaate. See isolaat koguti ~1984. aastal ja on sellest ajast saadik laos hoitud, aeg-ajalt on seda nisulehtede kaudu taaskasutatud; seetõttu on praegu ebaselge, kas see tähelepanek võis (vähemalt osaliselt) tuleneda proovide säilitamisest aja jooksul. Tuvastasime seitse isolaati, mis ei suutnud tekitada haiguse sümptomeid ühelgi nisusordil (joonis 1B). Kuna kõik need isolaadid pärinevad kas Hispaaniast või Itaaliast, kus kasvatatakse sagedamini tetraploidset (kõva/pasta) nisu (Triticum durum L.), on tõenäoline, et need isolaadid olid kõva nisu spetsiifilised [40, 41]. Märkimisväärne on see, et sarnase virulentsusprofiiliga isolaadid ei koondunud oma kogumiskohta, kusjuures isolaadid pärinevad nii kaugelt idast kui Slovakkiast kuni läände kuni Iirimaani (joonis 1B). See tähelepanek ühtib hästi isolaatide ja varasemate uuringute vahel eksisteeriva suure geneetilise varieeruvuse tasemega, mis on näidanud, et see on ühe nisulehe kahjustuse skaalal sama suur kui kogu mandritel [42]. Paljud agressiivsemad isolaadid, millel on erinevad virulentsusprofiilid, valiti seejärel genoomse järjestuse (joonisel 1B esile tõstetud tähega #) ja RNAseq analüüsi jaoks (joonisel 1B esile tõstetud tähega "+").
Joonis 1 Euroopa isolaatide kollektsiooni virulentsuse hinnangud erinevate heksaploidsete (leiva-) nisusortide suhtes. Tüüpiline haiguse progresseerumise aja kulg, mis illustreerib ekraanil hinnatud parameetreid, sealhulgas aega, mis kulub esimeste nähtavate sümptomite ilmnemiseni ja lehtede täieliku nekroosi ilmnemiseni nakatatud alal. Joonisel on kujutatud nisusordi Riband nakatumist Z. tritici isolaadiga IPO323. B Isolaatide virulentsusprofiil versus kultivaride paneel, mis põhineb lehtede nekroosi ja kloroosi tasemetel. Mõõtmised viidi läbi nii visuaalsete hinnangute abil kui ka LemnaTec ja LemnaGrid pildianalüüsi tarkvara abil, mille lõpptulemused olid võrreldavad. Isolaadid järjestati ja rühmitati virulentsuse andmete põhjal. Z. tritici isolaadid, mis on esile tõstetud #-ga, sekveneeriti pangenoomi konstrueerimiseks. +-ga esile tõstetud isolaate analüüsiti ka RNAseq transkriptoomika abil. Nisu kultivar Panorama (esile tõstetud X-ga) leiti olevat enamiku isolaatide suhtes võrdselt ja täielikult vastuvõtlik ning valiti peremeesorganismi genotüübiks leheinfektsiooni RNAseq jaoks. Pange tähele, et seitsme isolaadi välisrühma madala virulentsuse andmed kõigi kultivaride suhtes tulenevad tõenäoliselt sellest, et need isolaadid on kohandatud põhjustama haigusi tetraploidsel nisul (Durum või Pasta). Kõik andmed esindavad kolme nakatunud lehte, mida analüüsiti / nendega suheldi kahest bioloogilisest korduskatsest (kokku 6 lehte). C SplitsTree analüüs genoomse sekveneerimise jaoks valitud isolaatide molekulaarsest fülogeneesist. Isolaatide päritoluriik on näidatud lühendis (Pl=Poola; GB=Suurbritannia; Be=Belgia; Cz=Tšehhi Vabariik; Ge {{8 }} Saksamaa; Sw=Rootsi; Fr=Prantsusmaa; Sl=Slovakkia; Ir=Iirimaa). Esindatud on ka võrdlusisolaat IPO323, mis koguti ~1984 Hollandist (Ne).
Seitsmeteistkümne Euroopa isolaadi genoomijärjestus ja fülogeneetiline analüüs näitavad geneetilise mitmekesisuse kõrget taset
We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >97% kõigil juhtudel näitas geeniruumi (kodeerivate piirkondade) head kokkupanekut kõigi isolaatide jaoks. Kõigist kooslustest puudusid mõned valitud BUSCO geenid, mis viitab sellele, et Z. triticil ei pruugi olla nende geenide ortolooge. Prognoositud kodeerivaid piirkondi mõjutava geneetilise variatsiooni suuruse määramiseks teostasime seejärel iga tüve jaoks SNPEf analüüsi pangenoomi suhtes, mis oli üles ehitatud võrdlusisolaadi IPO323 täielikule genoomile (tabel 2). See analüüs näitas, et igal uuel tüvel oli tuletatud pangenoomi suhtes üle 160 000 SNP-d. Nende hulgas oli üle 65 000, mis kas põhjustasid valgu funktsiooni võimaliku kaotuse (suur efekt, kaadri nihe, kaotatud algus, enneaegsed stoppkoodonid) või kutsusid esile aminohapete muutuse prognoositud valkudes (Mõõdukas). Need andmed näitasid Z. tritici isolaatide vahel eksisteerivat geneetilist mitmekesisust.
17 äsja sekveneeritud tüve ja IPO323 puhul viidi läbi lõhestatud puu analüüs, et teha kindlaks, kas sarnase kultivariga nakatumise mustriga isolaatidel oli fülogeneetiline seos ja kas see oli seotud päritoluriigiga. Fülogeneesi määramiseks kasutati kuue kodeeriva ja mittekodeeriva järjestuse ühendamist (vt meetodid ja lisafail 3: andmed S1). Puu (joonis 1C) illustreerib veel kord, et virulentsusprofiilide ja järjestatud isolaatide proovivõtukoha vahel ei olnud selget seost, kuna erinevatest Euroopa riikidest kogutud isolaatide puhul on näha tihedalt seotud virulentsusprofiile (võrreldes joonisega 1B). fülogeneetiliselt tihedalt seotud.
Pangenoomi ehitus ja analüüs ennustab 9807 "tuuma" ja 8083 "tarviku" geeni
Lisaks genoomi järjestustele valisime RNAseq-põhiseks transkriptsiooniprofiiliks 12 isolaati (joonisel 1B tähistatud +). Iga isolaat profileeriti kolmes eksemplaris YPD puljongis aksenilise kasvu ajal ja ka kahes sõltumatus lehtede nakatumise etapis; 6 päeva pärast inokuleerimist (dpi), mis tähistab sümptomiteta faasi keskmist ja 9 dpi, varajase sümptomite arengu üleminekufaasis. Nakkuskatseteks kasutati universaalselt vastuvõtlikku nisusorti Panorama, mida kõik isolaadid suutsid eristamatu kineetikaga täielikult nakatada. Kasutades neid transkriptsiooniandmeid koos uute genoomikomplektidega ja IPO323 algset võrdlusjärjestust karkassina, määrasime Euroopa isolaatide jaoks pangenoomi, mis sisaldas ka teistes isolaatides esinevaid järjestusi, mida IPO323-s ei tuvastatud. Pangenoomi ehituse etapid ja meie kriteeriumid geenide "tuumaks" või "tarvikuks" kategoriseerimiseks on näidatud joonisel 2. Oluline on see, et inaktiveerivate (suur mõju, funktsiooni kadumine-LoF) järjestuse polümorfism ning olemasolu ja puudumine, kaalutlused neid toetasid ka tõendid geeniekspressiooni kohta. Seega peaks geen olema funktsionaalses vormis ja seda ekspresseerima kõik isolaadid, et määrata see "tuum" kategooriasse. Meie üldine lähenemisviis (joonis 2) määratles kokku 17 890 geeni pangenoomi, sealhulgas 2017, mida IPO323-s ei esinenud. Järgnevates filtreerimisetappides liigitati 9807 tuumagenoomi ja ainult veidi väiksem arv, 8083, lisatarvikute komplektis. Viimane moodustab ~ 45% kogu pangenoomist, mis on veidi suurem kui eelnevalt kirjeldatud [28]. Kuigi need arvud ühtivad üldiselt hästi, on abigeenide hinnangud kasutatud meetodite (Panseq jne) tõttu subjektiivsemad ja me ei saa eeldada, et täiendav tulevane analüüs ei pruugi vähendada lisageenide arvu, kasutades näiteks ortoloogiapõhist geeni. lähenemisi. Kõiki pangeene analüüsiti mitme funktsiooni (sekretsiooni, membraani assotsiatsiooni, lokaliseerimise ja tsüsteiinisisalduse prognoosid) ja prognoositud funktsioonide (BLAST, GO ja Interpro annotatsioonid) osas. Esitatakse tabel, mis sisaldab kogu saadaolevat teavet kõigi geenide kohta (lisafail 4: tabel S2). Tabelis on näidatud ka suhtelised keskmised RNAseq-st tuletatud geeniekspressioonitasemed, mis on määratud kõigi 12 isolaadi kõigi geenide jaoks kolmel testitud tingimusel. Kui võrrelda ka selle organismi varasemate pan-genoomiliste uuringutega [27, 28], siis on selge, et Z. triticis on seni uuritud üks suurimaid seente geneetilisi lisakomponente, mis tõenäoliselt peegeldab selle kiiresti arenevat. loodus.
Tabel 1 BUSCO analüüs uute genoomide kohta
Tabel 2 SNP mõjude kokkuvõte iga uue genoomi kohta võrreldes IPO323 võrdlusgeenimudelitega
Joonis fig 2 Kokkuvõte sammudest, mida kasutati äsja konstrueeritud Euroopa Z. tritici pangenoomi "tuum" ja "lisa" geenikõnede ja numbrite genereerimiseks. Numbrid näitavad geenide arvu, mis on identifitseeritud igas torujuhtme etapis
Euroopa Z. tritici pangenoomi variatsiooni struktuurilised tunnused
Selle uuringu eesmärk oli testida hüpoteesi, et pangenoomikat saab kasutada uute oluliste geenide tuvastamiseks, mis on kas eluks olulised või patogeensete organismide virulentsuse jaoks. Me oletasime, et need on geenid, mis esinevad ja funktsioneerivad igas patogeeni tüves ning ekspresseeritakse nende poolt. Lisaks oletasime, et nendel geenidel on madalam kõrge ja mõõduka toimega SNP mutatsioonide tase, mis mõjutavad kodeerivaid järjestusi (vähem polümorfsed) ja et need võivad koonduda teatud kromosoomide piirkondadesse.
Kasutasime SNP variatsiooniandmeid (kõrge, mõõdukas ja modifikaatorid – vt lisafail 4: tabel S2), samuti kõigi geenide keskmisi ekspressiooniandmeid, et uurida 21 kromosoomi abil kodeeriva polümorfismi ja ekspressiooni keskmisi tasemeid kromosoomipõhiselt. IPO323 kui karkass. Modifikaatori SNP-d esindavad nukleotiidide muutusi, mis ei kutsu esile aminohapete muutust. Joonisel fig 3A on näidatud, et mutatsioonide sageduse osas ei esinenud erilist kõrvalekallet, kui kumulatiivseid kõrgeid, mõõdukaid ja modifitseerivaid SNP-sid väljendati keskmise valgu pikkuse tunnusena kogu kromosoomi kohta. Kui aga modifikaatorite mutatsioonid, st need, mis ei põhjusta aminohapete muutust, jäeti välja, oli selge, et kõige väiksemas 8 kromosoomis oli geene, millel oli suurem arv kõrgeid ja mõõdukaid SNP mutatsioone (joonis 3B). Seda efekti rõhutati veelgi, kui analüüsiti ainult suure efektiga SNP-sid (joonis 3C). Erinevalt tuumkromosoomidel 1–13 (~ 20%) ilmnevatest tasemetest oli kuni 90% kaheksas väikseimas kromosoomis 14–21 paiknevatest geenidest vähemalt ühes suure mõjuga, tõenäolised funktsioonikaotusega mutatsioonid. isoleerida (joonis 3C). Kõigi 12 uue isolaadi kumulatiivsed transkriptsiooniandmed näitasid ka kromosoomides 14–21 esinevate geenide suhteliselt madalat keskmist ekspressiooni (joonis 3D), nagu oli varem täheldatud IPO323 puhul [32, 43, 44]. Kokkuvõttes näitavad need andmed selget genoomset sektsiooni, kusjuures kaheksa väikseima lisakromosoomiga on järjestused, mis on väga polümorfsed, täiendavad ja üldiselt halvasti ekspresseeritud.
Kõigi tuuma- või lisagenoomi geenide võrdlemine näitas, et ~60% kõigist viimases leiduvatest geenidest leiti vähemalt ühest tüvest, millel oli kõrge mõju (funktsiooni kaotus (LoF)) mutatsioon ja et 47% puudusid ka vähemalt üks tüvi (lisafail 4: tabel S2). Sarnaselt lisakromosoomide analüüsiga ekspresseerusid üksikud lisageenid testitud isolaatides üldiselt väga halvasti (lisafail 4: tabel S2) ja neil oli palju suurem arv tundmatute funktsioonidega järjestusi (umbes 80%). Need tähelepanekud on hästi võrreldavad varasemate pangenoomiliste uuringutega, mis viidi läbi Z. tritici ülemaailmsetes kogudes, mis koguti aastakümnete vahega [27, 28].
Samuti teostasime kõigi võrdlusisolaadis IPO323 ennustatud geenide geenipõhise olemasolu ja puudumise (PAV) analüüsi ülejäänud 17 järjestatud isolaadi jaoks. Need olemasolu/puudumise andmed kanti positsiooniliselt iga geeni kohta iga 21 kromosoomi IPO323-s. Joonistel fig 3E ja F on toodud andmed tüüpiliste tuumkromosoomide (1 ja 7) kohta, samas kui joonistel 3G ja H on toodud andmed tüüpiliste lisakromosoomide (13 ja 14) kohta. Ülejäänud kromosoomide andmed on näidatud lisafailis 2: joonis S2. See analüüs tuvastas palju IPO323-s esinevaid geene, mis puuduvad paljudes uuesti sekveneeritud isolaatides, ja näitab selgelt erinevust üldises geeni olemasolus/puudumises IPO323 "tuum" kromosoomide vahel (mida leidub igas Z. tritici tüves). võrreldes 8 väikseima "tarviku" kromosoomiga. Andmed tõstavad esile ka 7. kromosoomi piirkonda, mis jääb vahemikku 1,7 Mb kuni 2,5 Mb, mis näitab geenide puudumise kõrget sagedust uutes isolaatides (joonis 3F). Huvitaval kombel ühtib see piirkond täpselt genoomi asukohaga, mille geeniekspressioon IPO323-s oli varem minimaalne või puudub üldse, kas kultuuris kasvamise ajal või taimede nakatumise mis tahes faasis [32, 43]. See piirkond vastab ka kromosomaalsele deletsioonile, mida täheldati Jeemeni isolaadis eelmises pangenoomiuuringus [28]. Üheskoos kinnitavad need andmed arusaama, et Z. tritici esindab kiiresti arenevat organismi, mille populatsioonis on kõrge ja erinevat tüüpi geneetiline ja genoomne mitmekesisus.
Valgu lokaliseerimise ennustused näitavad lisapangenoomi geene, mis võivad toimida muutuva keskkonnaga kohanemisel
WolfPsorti valgu lokaliseerimise ennustused viidi läbi kõigi pangenoomi poolt kodeeritud valkude puhul. Seejärel arvutasime igasse subtsellulaarsesse piirkonda eeldatavasti lokaliseeruvate valkude suhtelise protsendi tuuma- või lisapangenoomi valkude koguarvu tunnusena (joonis 4). Tuumagenoomis rikastati mitut lokaliseerimiskategooriat, sealhulgas "tsütoplasma", "rakuväline" ja "plasmamembraan", millest viimane sisaldab palju olulisi transpordifunktsioone (joonis 4). Vastupidi, asukohad "tuum" ja "mitokondrid" olid seotud suurema osa geenidega lisagenoomis (joonis 4). Lisagenoomi rikastati teatud tsinki siduvate domeenide jaoks, mis võivad tagada transkriptsiooni paindlikkuse. Selle kategooria rikastamisest teatati ka eelmises pangenoomiuuringus, milles rõhutati, et meie üldine torujuhe andis võrreldavaid tulemusi [27, 28]. "Mitokondrite" rikastamine on huvitav, kuna on olemas heausksete mitokondriaalsete valkude pseudogeenid ja paraloogid, mille sihtmärgiks on seenevastane keemia. Üks selge näide lisapangenoomist on suktsinaatdehüdrogenaasi subühiku C (SDHC3) paraloog, mis on näidanud, et see vahendab püsivat resistentsust SDHI (suktsinaatdehüdrogenaasi inhibiitor) fungitsiidide alamklassi suhtes Z. triticis [45]. Me tuvastasime selle geeni täielikud järjestused ainult kolmes seitsmeteistkümnest järjestatud isolaadist ja tuvastasime geeniekspressiooni kõrge taseme ainult ühes 12-st RNAseq-iga hiljem uuritud isolaadist (joonis 5B). Sellegipoolest rõhutavad eelmine uuring ja meie praegune analüüs, et lisagenoomis on tõepoolest olulisi funktsioone, kuid need on ilmselt olulisemad muutuvate keskkondadega kohanemiseks kui põhielustiili jaoks.
Joonis 3 Pangenoomi struktuursed tunnused ja polümorfismi olemasolu/puudumine referentsisolaadi IPO323 21 kromosoomi vahel. Modifikaatori, mõõduka (M) ja kõrge (H-funktsiooni kadu-LoF) mõjumuutuste kumulatiivsete SNP mutatsioonide koguarv, mida väljendatakse kromosoomi keskmise valgu pikkuse (aa) tunnusena. B Kumulatiivsete SNP mutatsioonide koguarv, mis annavad mõõduka ja suure mõjuga muutusi, väljendatuna valgu keskmise pikkuse tunnusena kromosoomi kohta. C SNP kumulatiivsete mutatsioonide koguarv, mis annavad suure mõjuga muutusi, väljendatuna valgu keskmise pikkuse tunnusena kromosoomi kohta. D Kõigi isolaatide kõigis 21 kromosoomis esinevate geenide keskmine ekspressioon. E Isolaadi IPO323 1. tuuma kromosoomil prognoositud geenide olemasolu ja puudumine (PaV) polümorfism 17 äsja sekveneeritud isolaadis. F PaV 7. tuumkromosoomi geenide jaoks. G PaV lisakromosoomi 15. geenide jaoks. G–F PaV lisakromosoomi 15. geenide jaoks. Andmed näitavad ulatuslikku piirkondlikku varieeruvust ja näitavad selget erinevust üldiste järjestuste polümorfismide tasemete ja esinemise/ esinemise vahel. puudumine ilmne tuum- ja lisakromosoomidel
Joonis 4 Tuum- ja lisageenide poolt kodeeritud valkude prognoositud lokaliseerimine. WolfPsorti poolt määratud valkude prognoositud lokaliseerimise protsentide kokkuvõte kategooriate jaoks, mis on näidatud tuuma- ja lisapangenoomis esinevate valkude üldarvu suhtes
Lisagenoomi efektorvalgud näitavad ekspressioonis suuremat tüvedevahelist varieeruvust kui tuumas
Üle kaheksa protsendi tuumagenoomi geenidest kodeerisid oletatavaid sekreteeritud valke, mis on suurem kui lisagenoomi puhul (~ 5%). Sekreteeritud valku kodeerivas lisagenoomi geenid olid aga sagedamini tundmatu funktsiooniga, neil puudusid äratuntavad domeenid või katalüütilised piirkonnad. Need tundmatu funktsiooniga valgud moodustasid ~ 75% kogu lisa sekretoomist, võrreldes 42% tuuma sekretoomiga. Paljud tuumagenoomis esinevad kandidaat- (ja mõnel juhul ka valideeritud) efektorid ekspresseerusid sarnaste mustritena ja võrreldavatel tasemetel kõigis kaheteistkümnes RNASeq-i analüüsitud isolaadis. Näiteks kolm LysM (Lysin) domeeni sisaldavat efectors, 3LysM, 1LysM ja xLysM, olid väljendatud väga sarnasel tasemel ja identsed mustrid, iga tüvi (joon. 5C-E). Te 3LysM efektor jääb Z. tritici ainsaks peamiseks sekreteeritud virulentsuse määrajaks, kus see valk pärsib kitiini poolt vallandatud taime immuunsust varase nakatumise ajal [46, 47]. Siiski on teada, et kõik kolm LysM-efektorit töötavad sel eesmärgil koos [48]. Seega on tähelepanuväärne, et nende geenide ekspressiooni varieerumine isolaatide vahel oli väga väike, kinnitades veel kord vihjeid, et see kaitse supressioon on nakkuse põhikomponent. Seevastu kandidaat efektorid leitud lisagenoom kuvatud nii olemasolu ja puudumine variatsiooni ja väga varieeruv ekspressioon vahel isolaadid (joonis 5F-H). Näiteks AvrStb6, esimene Z. tritici identifitseeritud avirulentsuse efektor [49, 50], näitab märkimisväärset ekspressioonivariatsiooni (joonis 5F), hoolimata sellest, et see esineb kõigis isolaatides. Selle järjestuse muutuja, väikese sekreteeritava valgu, tunnevad ära nisusordid, mis sisaldavad retseptoritaolise kinaasi Stb6 funktsionaalseid alleele [25, 51]. See äratundmine tagab haigusresistentsuse kõigi isolaatide suhtes, mis sisaldavad selle efektori konkreetset alleeli. Tere oli oluline AvrStb6 ekspressioonivariatsioon isolaatide vahel ja tuvastasime ühe isolaadi (Zt118), kus meil ei õnnestunud üheski kolmest testitud seisundist ekspressiooni tuvastada. Sel põhjusel klassifitseeriti meie ennustuskonveieris AvrStb6 lisagenoomi. Paljud teised praegu tundmatute funktsioonide kandidaatefektorid näitasid lisagenoomi märkimisväärset olemasolu / puudumist ja / või ekspressioonivariatsiooni (joonis 5G ja H).
Joonis fig 5. Geenide ekspressiooni varieerumine tuum- ja lisapangenoomis ning ajutise viiruse üleekspressioonisüsteemi loomine, mida kasutatakse nekrotroofsete efektorekraanide jaoks. Andmete tõlgendamise võti on näidatud joonistel. B Lisagenoomis esineva suktsinaatdehüdrogenaasi subühiku C paraloogi olemasolu/puudumine ja geeniekspressiooni varieeruvus. C-E ZtLysM efectorite, 3LysM, 1LysM ja xLysM ekspressiooniprofiilid, mis kõik esinevad tuumpangenoomis. F Avirulentsusefektori AvrStb6 ekspressiooniprofiil. Mis tahes ekspressiooni puudumine isolaadis 118 klassifitseerib efectori lisapangenoomi. G ja H kujutavad näiteid täiendavatest kandidaatefektoritest lisapangenoomis.
Funktsionaalsed ekraanid ei anna tõendeid nekrotroofse efektori aktiivsuse kohta ei tuuma ega lisapangenoomis
Võtsime kasutusele hiljuti välja töötatud viirusvektori poolt vahendatud valgu transientse ekspressioonisüsteemi nisu (ja muude teravilja- ja muude põllukultuuride jaoks), kasutades Foxtail Mosaic viirust (FoMV), et teostada kandidaatide Z. tritici efectors keskmise kuni suure läbilaskevõimega sõelumist. pangenoomist. Meie eesmärk oli konkreetselt testida, kas kellelgi on võime kutsuda esile nekroosi väikesel nisukultuuride paneelil, mis võib viidata nende funktsioonile üleminekul haiguse sümptomitele kui "nekrotroofsetele efektoritele" [36, 52]. Selle uuringu jaoks tegime varem avaldatud süsteemis mõned muudatused [53]. Ekstratsellulaarse valgu sekretsiooni juhtimiseks nisus kasutasime nisu patogeneesiga seotud valgu 1 (TaPR1) signaalpeptiidi järjestust, mis oli koodoniga optimeeritud Arabidopsis thaliana jaoks, mis seejärel liideti kaadris geenisünteesi abil iga kandidaadi seeneefektorjärjestusega (joonis 1). 5I). TaPR1 signaalpeptiidi efektiivsus funktsionaalsete Z. tritici ekstratsellulaarsete valkude sekreteerimisel määrati kindlaks selle võimega indutseerida tubakas lehtede nekroosi, kui see asetatakse Z. tritici nekroosi ja etüleeni indutseeriva valgu (ZtNLP) ette, mis on ainult funktsionaalne. kui see on suunatud ekstratsellulaarsele sekretsioonile (joonis 5 Jl) [54]. Seejärel kinnitasime, et vektor võib valke üleekspresseerida võrdselt paljudes nisukultuurides, visualiseerides rohelise fluorestseeruva valgu (GFP) lokaalset ja süsteemset ekspressiooni erinevate nisukultuuride lehtedel (lisafail 2: joonis S3). Lõpuks testisime seejärel sarnase nisu patogeeni Parastagonospora nodorum hästi iseloomustatud nekrotroofse efektori SnToxA võimet indutseerida nekroosi Tsn1 tundlikkuse geeni omavate genotüüpide nisulehtedes [55]. Ootuspäraselt põhjustas FoMV-vahendatud SnToxA üleekspressioon TaPR1 signaalpeptiidiga nekroosi ainult nisusordil, millel oli Tsn1 (cv Halberd joonisel 5K), kusjuures kultivaridel, millel see vastuvõtlikkuse geen puudus (cv Riband5K), sümptomeid ei täheldatud. ). Need andmed kinnitasid, et viirusvektori poolt vahendatud üleekspressioonisüsteem sobis kandidaat-Z. tritici efektorite suuremahuliseks skriinimiseks, et tuvastada nekrotroofse efektoraktiivsusega aineid. Kokku valiti välja 88 kandidaati, keda sõeluti viie nisusordi suhtes (lisafail 5: tabel S3). Need hõlmasid 66 valku, mis asusid tuumapangenoomis ja 22 lisaseadmest. Valitud geenid (lisafail 5: tabel S3) ulatusid põhigeenidest, millel ei olnud tüvespetsiifilisi polümorfisme (monomorfsed) ja kõrge taimeekspressiooniga, kuni lisagenoomi geenideni, millel on esinemine/puudumine ja/või oluline ekspressioonipolümorfism. Kõikides katsetes viidi läbi paralleelsed ToxA vs cv Halberd ja cv Riband tehnilised kontrollid ning need andsid alati oodatud tulemused. Seevastu ükski 88 testitud Z. tritici üleekspresseeritud valgust ei kutsunud esile lehtede nekroosi ühelgi nisusordil. Kokkuvõttes ei andnud need tulemused tõendeid nekrotroofsete mõjurite kohta ja seetõttu ei toetanud ühtegi testitud kandidaati infektsiooni ajal nekrotroofsele kasvule ülemineku esilekutsumisel.
cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi
Tuumgeenidel, mis kodeerivad demonstreeritud või prognoositud eluks hädavajalike või võtmetähtsusega virulentsusfunktsioonidega valke, on aminohapete polümorfismi üldine tase madalam
Tegime kirjanduse otsingu, et tuvastada kõik Z. tritici geenid, mida oli funktsionaalselt iseloomustatud, kas virulentsuse või oluliste geenidena kuni 2018. aastani. See koostas 28 valgujärjestuse loendi (lisafail 6: tabel S4). Samamoodi tuvastasime 26 valgu loendi, mida oli samuti funktsionaalselt iseloomustatud, kuid mille puhul on näidatud, et need ei mängi virulentsuses olulist rolli ega ole olulised (lisafail 6: tabel S4). Seejärel uurisime nende geenide kumulatiivsete üleliigsete kõrgete ja mõõdukate mutatsioonide taset ja väljendasime nende väärtusi iga valgu pikkuse tunnusena ning määrasime seejärel komplekti keskmised väärtused. Joonisel 6 on välja toodud, et avaldatud virulentsust mõjutavatel geenidel oli statistiliselt oluliselt madalam mutatsioonide (polümorfismi) sagedus (p=0.007) kui neil, mis on osutunud funktsionaalselt üleliigseks.
Uuringuid, mille eesmärk on määratleda eluks hädavajalikud (vajalikud) geenid filamentsetes seentes (v.a pärmseened), on vähe ja siiani on oluliste geenide andmebaasis (DEG) vaid üks esindaja, kes pärineb oportunistlikust inimese patogeenist Aspergillus fumigatus. [56–58]. Tuvastasime kõigi 28 geeni Z. tritici ortoloogid, mis on eksperimentaalselt näidanud, et need on A. fumigatus'e eluks hädavajalikud, ja arvutasime uuesti iga geeni suhtelise mutatsioonimäära järjestuse pikkuse suhtes (lisafail 7, tabel S5). Taaskord leidsime nende oluliste kandidaatgeenide kõrgete ja mõõdukate SNP mutatsioonide esinemissageduse selge statistiliselt olulise vähenemise (p{7}}.0148), mida seejärel täheldati geenide puhul, mis ei ole virulentsuse ega elu jaoks hädavajalikud ( joonis 6). Seevastu eksperimentaalselt kinnitatud virulentsusgeenide ja prognoositud oluliste geenide mutatsioonimäärade vahel olulist erinevust (p=0.2128) ei olnud (joonis 6). Need andmed koos toetavad kontseptsiooni, et aminohapete polümorfismide taset populatsioonides saab kasutada geenide suhtelise tähtsuse ennustamiseks organismi põhielustiili jaoks.
Joonis fig 6. Eksperimentaalselt kinnitatud patogeensuse ja/või prognoositud eluks vajalike geenide põhigeenikomplektide analüüs näitab madalamaid mutatsioonimäärasid kui mitteoluliste geenide puhul. Keskmised kõrged ja mõõdukad (H/M) mutatsioonimäärad, väljendatuna valgu pikkuse (aa) tunnusena geeniloendite puhul, mis kodeerivad valke, mis on olnud; 1- on eksperimentaalselt kindlaks tehtud, et see ei mängi seente virulentsuses mingit rolli (või mängib seda väga vähe); 2-katseliselt otsustatud mängida olulist rolli virulentsuses ja 3-ennustatakse, et see kodeerib oletatavaid eluks vajalikke geene ortoloogia kaudu valkudele, mida katseliselt iseloomustas Aspergillus fumigatus. Tärni (*) sümbol näitab statistiliselt olulist erinevust näidatud geenikomplektide mutatsioonimäärade vahel. Geeniloendid ja seotud polümorfismi andmed on näidatud lisafailis 6: tabelis S4
Kombineeritud ennustava lähenemisviisi kasulikkust patogeeni nõrkuse paljastamiseks toetavad geneetilise komplementatsiooni uuringud viie "tuuma" geeni deletsioonmutandiga
Z. tritici on võimeline edastama geneetikasõeluuringuid, mis põhinevad T-DNA juhuslikul integratsioonil Agrobacterium-mediated fungal transformation (AMT) kaudu. Meie eelmine töö oli tekitanud ühe Z. tritici T-DNA mutandi, mis ei suutnud põhjustada nakatunud nisulehtedel täielikku haigust (joonis 7A). See mutant, mida nimetatakse 23-21 (23. transformatsioonivoor ja 21. koloonia korjatud), võis normaalselt kasvada metsiktüübina toitainerikkal agarisöötmel (YPD), kuid ei suutnud kasvatada seente hüüfide võrreldavat taset. toitaineteta sööde, sealhulgas vesiagar (joonis 7A). Kasutasime kogu genoomi Illumina-põhist 23-21 uuesti sekveneerimist, et paljastada potentsiaalselt põhjusliku T-DNA sisestamise asukoht. See analüüs näitas ühe T-DNA integratsiooni 8. kromosoomi positsioonide 899878 ja 912699 vahel, mis põhjustas viie ennustatud kodeeriva järjestuse deletsiooni/katkestuse (joonis 7B). SNP ja indeli analüüs ei näidanud tüves 23-21 täiendavaid märgistamata mutatsioone võrreldes IPO323 metsiktüüpi genoomi järjestusega. 23-21 T-DNA deletsioon eemaldas tõhusalt viis geeni, mis kõik asuvad tuumagenoomis ja millel on järgmised funktsionaalsed (Interpro) prognoosid; geen 1=Tsütokroom P450; geen 2=S-adenosüülmetioniinmetüültransferaas; geen 3=Tsink (2) C6 tüüpi DNA-d siduv valk; geen 4=Nukleosiiddifosfaatkinaas (NDK) ja geen 5=glükosüülhüdrolaas 31 (joonis 7B). Uurisime iga valgu kõrgete ja mõõdukate mutatsioonide suhtelist arvu valgu pikkuse tunnusena, mis näitas, et valgul 4 (NDK) oli palju vähem mutatsioone, mis mõjutasid aminohappejärjestuse muutusi kui ülejäänud neljal analüüsitud järjestusel isoleeritud komplektis (joonis 1). 7C ja lisafail 2: joonis S4). Seejärel uurisime kõigi viie geeni keskmist suhtelist ekspressiooni kõigis testitud isolaatides. Samuti selgus, et geen 4 (kodeerib NDK-d) oli oluliselt kõrgem kui kõik teised kandidaadid (joonis 7D ja lisafail 2: joonis S5). Seega püstitasime hüpoteesi, et vähima polümorfse ja kõrgeima ekspressiooniga geeni, geeni 4, NDK, kadumine põhjustas virulentsuse kadumise ja sellega seotud defekti hüüfaalide pikendamisel. Selle testimiseks transformeerisime kõik viiest kandidaatgeenist eraldi tagasi 23-21 Z. tritici mutantseks tüveks, millest igaüks oli juhitud oma endogeense promootori poolt. Igast saadi mitu transformanti ja testiti uuesti virulentsust nisulehtedel ja võimet pikendada filamentseid hüüfisid vesiagaril. See näitas, et ainult NDK geeni (geen 4) uuesti kasutuselevõtt taastas täielikult nii virulentsuse kui ka hüüfikasvu metsiktüüpi tasemele (joonis 7E ja lisafail 2: joonis S6). Ülejäänud nelja kandidaadi taastoomine ei põhjustanud algse mutantse tüve 23-21 fenotüübi muutust (joonis 7E). Tagamaks, et kõik uuesti sisestatud geenid ekspresseeriti nende vastavas komplementeeritud tüves, viidi läbi RT-PCR iga transformandi ja algse 23-21 mutandiga. See kinnitas iga transkripti eeldatavat puudumist 23-21 mutandis ja näitas iga sihtgeeni õiget ekspressiooni komplementeeritud isolaatides (joonis 7F). Tus, viie kandidaadi väikseima populatsioonitaseme polümorfismi ja kõrgeima suhtelise ekspressiooniga üksiku geeni uuesti sissetoomine taastas selle nisu patogeeni defektsed fenotüübid. See eksperimentaalne vaatlus toetab pangenoomika ja transkriptoomika kombineerimise kasulikkust geenide ennustamiseks, mis on potentsiaalselt olulised peamiste funktsionaalse elu tunnuste jaoks.
Joonis 7. Viie geeni deletsiooniga mittepatogeense Z. tritici mutandi funktsionaalse komplementatsiooni testid toetavad pangenoomist tuletatud mutatsioonimäära ja ekspressioonitaseme analüüsi kombineeritud kasutamist oluliste elustiili põhigeenide ennustajatena. Z. tritici juhusliku T-DNA sisestamise mutandi "23-21" kasvu- ja nakkusomadused. Tüvi kasvab normaalselt rikkalikul toitaineagaril, kuid kehva toitainega agaril on filamentne kasv puudulik ja nisulehtede haigusi põhjustav aktiivsus on tõsiselt kahjustatud. Skaalavardad tähistavad 1 cm. B Tüve 23-21 kogu genoomi resekveneerimine paljastab 13 kb genoomse piirkonna T-DNA vahendatud deletsiooni, mis katkestab või kustutab viis ennustatud geeni tuumpangenoomist. C Kuvab iga geeni (tähisega 1-5) keskmised kõrge ja mõõduka mutatsiooni sündmused pangenoomist kodeeritud valgu pikkuse (aa) suhtes
Arutelu
Kombineeritud pangenoomikat ja transkriptoomikat saab kasutada relvana kiiresti arenevate patogeenide vastu
Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>40% kõigist geenidest) lisagenoom kui need liigid. Miks ja kuidas Z. tritici ja potentsiaalselt teised taimepatogeensed seened nii suurt lisakomponenti säilitavad, on ebaselge. Näiteks IPO323-s tuvastatud kaheksal väikseimal kromosoomil ei ole selget olulist mõju virulentsusele ega muudele protsessidele, kusjuures ainult üks uuring viitab praegu kromosoomidele 14, 16, 18, 19 ja 21, et mängida virulentsuses peent rolli. valitud nisusordid [59]. Sellest hoolimata säilivad populatsioonides nende väikeste kromosoomide kombinatsioonid. On oletatud, et need pakuvad rekombinatsioonisündmusi, mis võivad olla aluseks seene võimele kiiresti areneda, et kohaneda keskkonnamõjudega, mis võib olla kombineeritud ülekantavate elementide kõrge aktiivsusega [60–62]. Sarnast juhtumit võib väita ka suure lisagenoomi kohta. Seda toetab kahe käesolevas uuringus viidatud genoomi lisakomponendi – SDH subühiku C paraloog ja AvrStb6 – funktsionaalne tähtsus, millel mõlemal on võtmeroll väliskeskkonna muutuvate elementidega suhtlemisel (fungitsiidide kasutamine ja sobitatud kultivarid). haigusresistentsuse geenid) [25, 45]. Kirjeldatud on ka teisi bioloogilisi protsesse, mis võivad ka üksikutes Z. tritici isolaatides kaduda ilma selgete sobivusdefektideta, sealhulgas melaniseerumise (pigmentatsiooni) kontroll [63]. Meie uuring on rõhutanud, et Z. tritici kiiresti arenevat lisagenoomi saab potentsiaalselt selle vastu kasutada, kui keskendutakse selle asemel sellele, mida ei saa kaotada või millel on piiratud polümorfism. See uuring on püüdnud seda teha, pidades põhigeene mitte ainult kõigis isolaatides esinevateks ja funktsionaalseteks, vaid ka ekspresseerituks kõigis isolaatides. Samuti võtsime kasutusele lähenemisviisi, mille kohaselt püüdsime järjestada geenikomplekte tuumagenoomi aminohappejärjestuse varieeruvuse taseme põhjal. Muidugi on meie kasutatud meetoditega seoses mõned hoiatused, eriti seoses sellega, et üleliigseid (identne tüüp ja asukoht) mutatsioone ei saa kergesti eraldada sarnasest arvust mutatsioonidest, mis võivad esineda iga isolaadi unikaalsetes positsioonides (mitte-liigsed mutatsioonid). Seega ei sobi meie meetod kiiresti arenevate geenide järjestamiseks. Sellegipoolest võimaldab see meetod aminohapete muutusi mõjutavate polümorfismide madalate määrade põhjal hõlpsasti tuvastada geene, mille varieeruvus puudub ja on madal. See lähenemisviis näitas, et eksperimentaalselt kontrollitud ja prognoositud eluks hädavajalikud geenid või virulentsusgeenid sisaldasid oluliselt vähem seda tüüpi polümorfismi isolaatide vahel kui need, mille funktsioonid on nende protsesside jaoks hädavajalikud. Lõpuks laiendasime seda lähenemisviisi, et tuvastada nukleosiiddifosfaatkinaasi (NDK) uus virulentsusfunktsioon, millel ilmnes 5-geeni T-DNA deletsioonis kõigist geenidest kõige väiksem variatsioon. Nende leidude põhjal teeme ettepaneku, et pangenoomikas tuvastatud põhigeenide polümorfismi tasemeid saaks kasutada kodeeritud valkude oluliste funktsioonide järeldamiseks ja seeläbi geenide prioriteediks funktsionaalseks analüüsiks, et teha kindlaks uued põllukultuuride kaitse ja potentsiaalselt loomade tervise sihtmärgid.
Kas Z. tritici ja sellega seotud patogeenide nakkusbioloogias ilmneb nõrkus?
See uuring andis ka täiendavaid konkreetseid teadmisi selle olulise nisu patogeeni nakkusbioloogiast. Esiteks ei saadud tõendeid, mis toetaksid peamiste nekrotroofsete efektoraktiivsuste olemasolu 88 sekreteeritud valgu puhul, mis olid valitud nii tuum- kui ka lisagenoomidest. Me ei saa kõrvale jätta võimalust, et me ei valinud õigeid valke või et mitmed efektorid võivad koos töötada, et kutsuda esile taimeraku surma (mida soovitavad ka sarnased ekspressiooniprofiilid). Kui viimane on nii, erineks see üksikute nekrotroofsete efektorite selgest tähtsusest seotud nisu nakatavates seentes, eriti Parastagonospora nodorum ja Pyrenophora liikides [35]. Samuti on võimalik, et ekspressioonitasemed, mille me tuletame mööduvast FoMV süsteemist, on madalamad kui need, mis on vajalikud efektoritele, mille äratundmine on vähem väljendunud kui SnToxA. Sellegipoolest ei toeta siin esitatud andmed ideed, et üleminek sümptomaatilisele kasvule ja taimerakkude surm on tingitud peamiste (üksikute) nekrotroofsete Z. tritici efectorite tuvastamisest. Seetõttu on võimalik, et nende valkude masstootmine sümptomite ilmnemisel võib selle asemel kaitsta seente hüüfisid rakusurma ja taime vastuse ilmse hüperaktiveerimise eest. Kooskõlas sellega on näidatud, et selle ja teiste seente sekreteeritud efektoritel on võime inhibeerida taimse päritoluga proteaase, kitinaase ja teisi rakuseina ründavaid ensüüme, mida taimed kaitsereaktsioonide käigus ise esile kutsuvad [46, 48, 64, 65 ]. Hiljuti on näidatud, et seente efektorid manipuleerivad ja kujundavad ümber mikro- ja mikrobiome [66, 67].
Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi
NDK virulentsuse võtmerolli tuvastamine on siiski oluline. Neid valke on omistatud erinevate prokarüootsete ja eukarüootsete organismide mitmele funktsioonile. Seente puhul on üks aruanne, mis omistab rolli taimede immuunsuse moduleerimisele [68], samas kui mõnel teisel liigil (A. fumigatus) on näidatud eluks vajalikku funktsiooni [69]. Nende valkude esmane ja konserveerunud funktsioon on aga nukleosiiddifosfaatide fosforüülimine, kasutades tavaliselt substraadina ATP-d, et tekitada teisi nukleosiidtrifosfaate (NTP), mis on vajalikud erinevate rakuprotsesside käivitamiseks [70, 71]. See on eriti oluline, kui piiratud ressursid muudavad teatud NTP-de loomise muul viisil keerulisemaks. Tus, NDK-d on NTP-de regenereerimiseks võtmetähtsusega päästetee tegevus, mis on tõenäoliselt oluline, kui rakuvälised ressursid on piiratud. Paljude teiste päästeteede ja eriti biosünteesiteede olulised rollid on hiljuti esile kerkinud teistes Z. tritici geenifunktsiooni uuringutes. Näiteks on lüsiini biosüntees hädavajalik nakkuse ja hüüfide kasvu jaoks kehvadel toitainetel [72], nagu ka puriinide biosüntees [73]. Need funktsioonid on täielikul söötmel kasvamiseks üleliigsed. Varasemad transkriptsiooniandmed lehtede pinna koloniseerimise väga varase staadiumi kohta on näidanud, et seen on toitainetevaese keskkonnas ja sõltub rakusiseste varude kasutamisest [33]. Võttes arvesse varasemaid funktsionaaluuringuid ja NDK võtmerolli, on selge, et Z. tritici on lehepinnal varajase kolonisatsiooni ajal äärmiselt haavatav peamiste biosünteesi- ja päästeradade pärssimise suhtes ning potentsiaalselt kuni viiruse esilekutsumiseni. taimeraku surm 7–10 päeva pärast. Seega võivad uued taimekaitsevahendid või -strateegiad olla suunatud nende protsesside pärssimisele, mis võib olla nõrkus Z. tritici puhul ja potentsiaalselt paljude teiste sarnaste nakkusviisidega seotud seente puhul.
Järeldused
See uuring pakub esialgset tuge pangenoomika ja transkriptoomika kombineeritud kasutamiseks, et määratleda geenid, mis esindavad kiiresti arenevate patogeenide põhilisi ja potentsiaalselt kasutatavaid nõrkusi. Põhimõtteliselt saab neid lähenemisviise kasutada geenide prioritiseerimiseks igas bioloogilises süsteemis, kus on saadaval mitu genoomi ja transkriptoomi. Eeldame, et need lähenemisviisid võivad edendada põhiliste bioloogiliste protsesside avastamist paljudes erinevates bioloogilistes süsteemides.
Viited
1. Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D, Gurr SJ. Ülemaailmne resistentsuse tekkimine seenevastaste ravimite suhtes seab väljakutse inimeste tervisele ja toiduga kindlustatusele. Teadus. 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999.
2. Fisher MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL jt. Tekkivad seenohud loomade, taimede ja ökosüsteemide tervisele. Loodus. 2012;484. https://doi.org/10.1038/nature10947.
3. Lucas JA, Hawkins NJ, Fraaije BA. Fungitsiidiresistentsuse kujunemine. Adv Appl Microbiol. 2015;90. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001.
4. Heitman J. Seksuaalne paljunemine ja mikroobsete patogeenide evolutsioon. Curr Biol. 2006;16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064.
5. Dong S, Raffaele S, Kamoun S. Filamentsete patogeenide kahekiiruselised genoomid: valss taimedega. Curr Opin Genet Dev. 2015;35:57–65. https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001.
6. Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, Donati C, Medini D, Ward NL jt. Streptococcus aga-lactiae mitmete patogeensete isolaatide genoomianalüüs: mõju mikroobide "pan-genoomile". Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102. https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102.
7. Lefébure T, Stanhope MJ. Streptokokkide tuuma ja pan-genoomi areng: positiivne valik, rekombinatsioon ja genoomi koostis. Genome Biol. 2007;8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.
8. Tian CF, Zhou YJ, Zhang YM, Li QQ, Zhang YZ, Li DF jt. Rhizoobia noduleerivate sojaubade võrdlev genoomika viitab liinispetsiifiliste geenide ulatuslikule värbamisele kohandustes. Proc Natl Acad Sci US A. 2012;109. https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109.
9. Syme RA, Tan KC, Rybak K, Friesen TL, McDonald BA, Oliver RP jt. Panparastagonospora võrdlev genoomianalüüs-efektori ennustamine ja genoomi evolutsioon. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/ gbe/evy192.
10. McCarthy CGP, Fitzpatrick DA. Mudelseeneliikide pan-genoomi analüüsid. Microb. Genoomika. 2019;5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243.
11. Yang X, Li Y, Zang J, Li Y, Bie P, Lu Y jt. Pan-genoomi analüüs Brucella spp. põhigeenide ja oluliste geenide tuvastamiseks. Moli genoomika. 2016;291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.
12. Barber AE, Sae-Ong T, Kang K, Seelbinder B, Li J, Walther G jt. Aspergillus-lus fumigatus pan-genoomi analüüs tuvastab inimese nakatumisega seotud geneetilised variandid. Nat Microbiol. 2021;6. https://doi.org/10.1038/ s41564-021-00993-x.
13. Zhang X, Liu B, Zou F, Shen D, Yin Z, Wang R jt. Kogu genoomi resekveneerimine näitab Phytophthora sojae loomulikku varieerumist ja adaptiivset arengut. Eesmine mikrobiol. 2019;10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019. 02792.
14. Torriani SFF, Melichar JPE, Mills C, Pain N, Sierotzki H, Courbot M. Zymoseptoria tritici: suur oht nisu tootmisele, integreeritud lähenemisviisid kontrollile. Fungal Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.010.
15. Zhan J, Mundt CC, McDonald BA. Immigratsiooni ja seksuaalse paljunemise mõõtmine Mycosphaerella graminicola põldpopulatsioonides. Fütopatoloogia. 1998;88. https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330.
16. Zhan J, Kema GHJ, Waalwijk C, McDonald BA. Nisu patogeeni Mycosphaerella graminicola paaritustüüpi alleelide jaotus ruumilistel skaaladel kahjustustest mandriteni. Fungal Genet Biol. 2002;36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0.
17. Stukenbrock EH, Banke S, Java-Nikkhah M, McDonald BA. Seene nisu patogeeni Mycosphaerella graminicola päritolu ja kodustamine sümpaatilise spetsifikatsiooni kaudu. Mol Biol Evol. 2007;24. https://doi.org/10. 1016/S1087-1845(02)00013-0.
18. Linde CC, Zhan J, McDonald BA. Mycosphaere-lla graminicola populatsiooni struktuur: kahjustustest mandriteni. Fütopatoloogia. 2002;92. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946.
19. Croll D, McDonald BA. Põllumajanduslike ökosüsteemide patogeensete seente kohaliku kohanemise geneetiline alus. Mol Ecol. 2017;26. https://doi.org/ 10.1111/mec.13870.
20. Croll D, Lendenmann MH, Stewart E, McDonald BA. Rekombinatsiooni levialade mõju seente taimepatogeeni genoomi arengule. Geneetika. 2015;201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968.
21. Dutta A, Croll D, McDonald BA, Barrett LG. Põllumajandusliku taimepatogeeni populatsioonide virulentsuse ja paljunemise varieeruvuse säilitamine. Evol Appl. 2021;14. https://doi.org/10.1111/eva.13117.
22. Feurtey A, Stevens DM, Stephan W, Stukenbrock EH, Stajich J. Liikidevaheline geenivahetus toob kaasa põllukultuuride patogeeni kõrge geneetilise varieeruvuse. Genome Biol Evol. 2019;11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224.
23. Hartmann FE, Sánchez-Vallet A, McDonald BA, Croll D. Seennisupatogeen arendas peremeesorganismi spetsialiseerumist ulatuslike kromosoomide ümberkorraldustega. ISME J. 2017;11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196.
24. Fouché S, Plissonneau C, McDonald BA, Croll D. Meioos põhjustab nisu patogeeni Zymoseptoria tritici lisakromosoomi koopiate arvu ulatuslikku varieerumist ja moonutatud pärimist. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100.
25. Stephens C, Ölmez F, Blyth H, McDonald M, Bansal A, Burcu Turgay E jt. Märkimisväärsed hiljutised muutused avirulentsusgeeni AvrStb6 geneetilises mitmekesisuses nisu patogeeni Zymoseptoria tritici globaalsetes populatsioonides. Moli taimepatool. 2021. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.
26. Goodwin SB, M'Barek S, Dhillon B, Wittenberg AHJ, Crane CF, Hane JK jt. Seennisu patogeeni Mycosphaerella graminicola valmis genoom näitab väljastusstruktuuri, kromosoomide plastilisust ja varjatud patogeneesi. PLoS Genet. 2011;7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070.
27. Badet T, Oggenfuss U, Abraham L, McDonald BA, Croll D. 19-Isoleerige võrdluskvaliteediga globaalne pangenoom seente nisu patogeeni Zymoseptoria tritici jaoks. BMC Biol. 2020;18. https://doi.org/10.1186/ s12915-020-0744-3.
28. Plissonneau C, Hartmann FE, Croll D. Nisu patogeeni Zymoseptoria tritici Pangenoomi analüüsid paljastavad väga plastilise eukarüootse genoomi struktuurse aluse. BMC Biol. 2018;16. https://doi.org/10.1186/ s12915-017-0457-4.
29. Wittenberg AHJ, van der Lee TAJ, M'Barek SB, Ware SB, Goodwin SB, Kilian A jt. Meioos põhjustab haploidse seentaimede patogeeni Mycosphaerella graminicola genoomi erakordset plastilisust. PLoS One. 2009;4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863.
30. Steinberg G. Zymoseptoria tritici rakubioloogia: patogeeni rakkude organiseerimine ja nisuinfektsioon. Fungal Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.002.
31. Kema GHJ, Yu DZ, Rijkenberg FHJ, Shaw MW, Baayen RP. Mycosphaerella graminicola patogeneesi histoloogia nisus. Fütopatoloogia. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777.
32. Rudd JJ, Kanyuka K, Hassani-Pak K, Derbyshire M, Andongabo A, Devon-Shire J jt. Zymoseptoria tritici nisu nakkustsükli transkriptoomi ja metaboliitide profileerimine näitab kahefaasilist koostoimet taime immuunsusega, mis hõlmab erinevat patogeeni kromosomaalset panust ja variatsiooni hemibiotroofse elustiili määratluses. Plant Physiol. 2015;167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927.
33. Keon J, Antoniw J, Carzaniga R, Deller S, Ward JL, Baker JM jt. Mycosphaerella graminicola transkriptsiooniline kohanemine selle tundliku nisu peremehe programmeeritud rakusurmaga (PCD). Mol Plant-Microbe Interact. 2007;20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178.
34. Rudd JJ, Keon J, Hammond-Kosack KE. Nisu mitogeeniga aktiveeritud proteiinkinaase TaMPK3 ja TaMPK6 reguleeritakse erinevalt mitmel tasemel Mycosphaerella graminicolaga ühilduvate haiguste koostoime ajal. Plant Physiol. 2008;147. https://doi.org/10.1104/pp.108. 119511.
35. Friesen TL, Faris JD. Efektor-sihtmärgi interaktsioonide iseloomustamine nekrotroofsetes patosüsteemides näitab peremeesorganismi manipuleerimise suundumusi ja variatsioone. Annu Rev Phytopathol. 2021;59. https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807.
36. Friesen TL, Faris JD, Solomon PS, Oliver RP. Peremees-spetsiifilised toksiinid: nekrotroofse patogeensuse efektorid. Cell Microbiol. 2008;10. https://doi.org/10. 1111/j.{6}}.2008.01153.x.
37. Ben M'Barek S, Cordewener JHG, Tabib Ghafary SM, van der Lee TAJ, Liu Z, Mirzadi Gohari A jt. FPLC ja vedelikkromatograafia massispektromeetria tuvastavad nekroosi indutseerivad kandidaatvalgud seennisu patogeeni Zymoseptoria tritici kultuurifiltraatidest. Fungal Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015.
38. Wyka S, Mondo S, Liu M, Nalam V, Broders K. Suur lisagenoom ja kõrge rekombinatsioonimäär võivad mõjutada seente taimepatogeeni Claviceps purpurea globaalset levikut ja laia peremeesorganismi valikut. PLoS One. 2022;17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
39. Moolhuijzen PM, Vt PT, Shi G, Powell HR, Cockram J, Jørgensen LN jt. Nisu seente patogeeni Pyrenophora triticirepentis globaalne pangenoom ja efector-valgu struktuurihomoloogia ennustamine. Microb. Genoomika. 2022;8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
40. Kema GHJ, Sayoud R, Annone JG, Van Silfhout CH. Geneetiline varieeruvus virulentsuse ja resistentsuse osas nisu-Mycosphaerella graminicola teesüsteemis II. Patogeeni isolaatide ja peremeeskultuuride vaheliste interaktsioonide analüüs. Fütopatoloogia. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213.
41. Kema GHJ, Annone JG, Sayoud R, Van Silfhout CH, Van Ginkel M, De Bree J. Geneetilised variatsioonid virulentsuse ja resistentsuse jaoks nisu Mycosphaerella graminicola patosüsteemis I. interaktsioonid patogeeni isolaatide ja peremeeskultuuride vahel. Fütopatoloogia. 1996;86. https://doi.org/ 10.1094/Phyto-86-200.
42. Zhan J, Pettway RE, McDonald BA. Nisu patogeeni Mycosphaerella graminicola globaalset geneetilist struktuuri iseloomustab suur tuumade mitmekesisus, madal mitokondriaalne mitmekesisus, regulaarne rekombinatsioon ja geenivoog. Fungal Genet Biol. 2003;38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8.
43. Palma-Guerrero J, Torriani SFF, Zala M, Carter D, Courbot M, Rudd JJ jt. Zymoseptoria tritici tüvede võrdlevad transkriptoomilised analüüsid näitavad keerulisi elustiili üleminekuid ja transkriptsiooniprofiilide spetsiifilist varieeruvust. Mol. Taimepatool. 2016;17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333.
44. Kellner R, Bhattacharyya A, Poppe S, Hsu TY, Brem RB, Stukenbrock EH. Nisu patogeeni Zymoseptoria tritici ekspressiooniprofiil näitab transkriptsiooni genoomseid mustreid ja peremeesorganismispetsiifilisi regulatsiooniprogramme. Genome Biol Evol. 2014;6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101.
45. Steinhauer D, Salat M, Frey R, Mosbach A, Luksch T, Balmer D jt. Suktsinaatdehüdrogenaasi subühiku C asendamatu paraloog vahendab Zymoseptoria tritici püsivat resistentsust SDHI fungitsiidide alamklassi suhtes. PLoS patog. 2019;15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1007780.
46. Marshall R, Kombrink A, Motteram J, Loza-Reyes E, Lucas J, Hammond Kosack KE jt. Seene Mycosphaerella graminicola kahe planta-ekspresseeritud LysM efector homoloogi analüüs näitab uudseid funktsionaalseid omadusi ja erinevat panust nisu virulentsusesse. Plant Physiol. 2011;156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
47. Lee WS, Rudd JJ, Hammond-Kosack KE, Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola list efector-mediated stealth patogenees õõnestab äratundmist nii cerk1 kui ka cebipi homoloogide kaudu nisus. Mol Plant-Microbe Interact. 2014;27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
48. Tian H, MacKenzie CI, Rodriguez-Moreno L, van den Berg GCM, Chen H, Rudd JJ jt. Kolm Zymoseptoria tritici LysM-i efektorit desarmeerivad ühiselt kitiini poolt käivitatud taime immuunsuse. Moli taimepatool. 2021;22. https:// doi.org/10.1104/pp.111.176347.
49. Zhong Z, Marcel TC, Hartmann FE, Ma X, Plissonneau C, Zala M jt. Zymoseptoria tritici väike sekreteeritud valk vastutab Stb6 resistentsuse geeni kandvate nisukultuuride avirulentsuse eest. Uus Phytol. 2017;214. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
50. Kema GHJ, Mirzadi Gohari A, Aouini L, Gibriel HAY, Ware SB, Van Den Bosch F jt. Stress ja seksuaalne paljunemine mõjutavad soojuspatogeeni efektori AvrStb6 ja strobiluriini resistentsuse dünaamikat. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
51. Saintenac C, Lee WS, Cambon F, Rudd JJ, King RC, Marande W jt. Nisu retseptori kinaasi sarnane valk Stb6 kontrollib geeni-geeni vastupanuvõimet seenpatogeeni Zymoseptoria tritici suhtes. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/ 10.1038/s41588-018-0051-x.
52. Tan KC, Oliver RP, Solomon PS, Mofat CS. Valgulised nekrotroofsed mõjurid seente virulentsuses. Funct Plant Biol. 2010;37. https://doi.org/10. 1071/FP10067.
53. Bouton C, King RC, Chen H, Azhakanandam K, Bieri S, Hammond-Kosack KE jt. Foxtail mosaiic viirus: viirusvektor valkude ekspressiooniks teraviljades. Plant Physiol. 2018;177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679.
54. Motteram J, Küfner I, Deller S, Brunner F, Hammond-Kosack KE, Nürnberger T jt. MgNLP, ainsa NPP1 domeeni sisaldava valgu, molekulaarne iseloomustus ja funktsionaalne analüüs seente nisu lehtede patogeenist mycosphaerella graminicola. Mol Plant-Microbe Interact. 2009;22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
55. Faris JD, Zhang Z, Lu H, Lu S, Reddy L, Cloutier S jt. Unikaalne nisuhaiguse resistentsuse sarnane geen reguleerib efektori poolt käivitatud vastuvõtlikkust nekrotroofsete patogeenide suhtes. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107. https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
56. Lu Y, Deng J, Rhodes JC, Lu H, Lu LJ. Oluliste geenide ennustamine potentsiaalsete ravimi sihtmärkide tuvastamiseks Aspergillus fumigatus'es. Comput Biol Chem. 2014;50. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011.
57. Osmani AH, Oakley BR, Osmani SA. Oluliste Aspergillus nidulansi geenide tuvastamine ja analüüs heterokarüoni päästetehnika abil. Nat Protoc. 2006;1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406.
58. Hu W, Sillaots S, Lemieux S, Davison J, Kaufman S, Breton A jt. Oluline geenide identifitseerimine ja ravimite sihtmärgi prioritiseerimine Aspergillus fumigatus'es. PLoS patog. 2007;3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 0030024.
59. Habig M, Quade J, Stukenbrock EH. Edasine geneetiline lähenemine näitab peremeesorganismi genotüübist sõltuvat lisakromosoomide tähtsust nisu seente patogeenis Zymoseptoria tritici. MBio. 2017;8. https://doi. org/10.1128/mBio.{6}}.
60. Fouché S, Badet T, Oggenfuss U, Plissonneau C, Francisco CS, Croll D. Stress-driven transponable element de-repressiooni dünaamika ja virulentsuse evolutsioon seenpatogeenis. Mol Biol Evol. 2020;37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216.
61. Möller M, Habig M, Freitag M, Stukenbrock EH. Erakordne genoomi ebastabiilsus ja laialt levinud kromosoomide ümberkorraldused vegetatiivse kasvu ajal. Geneetika. 2018;210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050.
62. Bertazzoni S, Williams AH, Jones DA, Syme RA, Tan KC, Hane JK. Aksessuaarid teevad rõivastuse: lisakromosoomid ja muud taimepatogeensete seente asendamatud DNA piirkonnad. Mol Plant-Microbe Interact. 2018;31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
63. Krishnan P, Meile L, Plissonneau C, Ma X, Hartmann FE, Croll D jt. Ülekantavad elementide insertsioonid kujundavad nisu seenpatogeenis geeniregulatsiooni ja melaniini tootmist. BMC Biol. 2018;16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
64. Sánchez-Vallet A, Tian H, Rodriguez-Moreno L, Valkenburgi DJ, Saleem Batcha R, Wawra S jt. Sekreteeritud LysM efector kaitseb seente hüüfisid kitiinist sõltuva homodimeeri polümerisatsiooni kaudu. PLoS patog. 2020;16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652.
65. Breen S, Williams SJ, Winterberg B, Kobe B, Solomon PS. Nisu PR-1 valkude sihtmärgiks on nekrotroofsed patogeeni efektorvalgud. Taim J. 2016;88. https://doi.org/10.1111/tpj.13228.
66. Snelders NC, Petti GC, van den Berg GCM, Seidl MF, Thomma BPHJ. Iidne antimikroobne valk, mille on kasutanud seentaimede patogeen planta mükobioomidega manipuleerimiseks. Proc Natl Acad Sci US A. 2021;118. https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118.
67. Snelders NC, Rovenich H, Petti GC, Rocafort M, van den Berg GCM, Vorholt JA jt. Mikrobioomi manipuleerimine mullas leviva seentaimede patogeeni poolt efektorvalkude abil. Nat Taimed. 2020. https://doi.org/10. 1038/s41477-020-00799-5.
68. Rocha RO, Wilson RA. Magnaporthe oryzae nukleosiiddifosfaatkinaas on vajalik metaboolseks homöostaasiks ja redoks-vahendatud peremeesorganismi kaasasündinud immuunsuse pärssimiseks. Mol Microbiol. 2020;114. https://doi.org/ 10.1111/mmi.14580