Cistanche Tubulosast pärit kalkooni süntaasi kloonimine, funktsionaalne tuvastamine ja ekspressioonianalüüs

Kokkuvõte: Eesmärk uurida kaltooni süntaasi funktsiooni Guanhuaroucongrongist (Cistanche tubulosa) ja CtCHS geeni ekspressioonimuster valgetes, punastes ja lillades õites.

Meetodid CtCHS geen klooniti RT-PCR abil ja viidi läbi bioinformaatika analüüs. Plasmiid pET-28a-CtCHS kanti üle Escherichia colisse, et indutseerida valguekspressiooni IPTG abil. CtCHS rekombinantset valku inkubeeriti substraatidega p-kumaroüül-CoA ja malonüül-CoA ning produktid tuvastati HPLC ja MS-ga. Plasmiid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS kanti üle Arabidopsis thaliana protoplasti, et jälgida CtCHS valgu subtsellulaarset lokaliseerumist. CtCHSgeeni ekspressioonimuster lilledesC. tubulosaqRT-PCR abil tuvastati kolme värviga.

Tulemused Klooniti CtCHS geen. Avatud lugemisraami (ORF) pikkus oli 1173 aluspaari, kodeerides 390 aminohapet, ja valgu molekulmass oli 42 8000. CtCHS sisaldas katalüütilisi jääke Cys164, His303, Asn336, mis konserveeriti kalkoonsüntaasis. CtCHSproteiin ekspresseeriti E. coli-s ja puhastati rekombinantse valgu saamiseks. CtCHS valk võib katalüüsida p-kumaroüül-CoA-d ja malonüül-CoA-d, et toota naringeniini kaltooni. CtCHS valk paiknes peamiselt tsütoplasmas. CtCHS geen ekspresseeriti tugevalt lillades ja punastes lilledes ning suhtelised ekspressioonitasemed olid vastavalt 8, 44 ja 3, 21 korda kõrgemad kui valgetel lilledel.

Järeldus CtCHS geen klooniti õiestC. tubulosaja valk ekspresseeriti. CtCHSproteiinil on kalkooni süntaasi funktsioon ja CtCHS geeni ekspressioon on suurem tumedamates õites, mis näitab, et CtCHSgeen võib reguleerida C. tubulosa õievärvi, mis loob aluse edasistele uuringutele selle kohta.C. tubulosa õievärvi reguleerimise mehhanism.

Märksõnad:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; kalkooni süntaas; ensüümi aktiivsuse analüüs; subtsellulaarne lokaliseerimine; ekspressioonianalüüs

30% EHHINAKOOSIIDI JA 12% AKTEOSIIDIGA LOODUSLIKU ORGAANILISE TESTANŠIEKSTRAKTI SAAMISEKS KLIKI SIIA

Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-pood

Biosünteetiline aineflavonoidide radaalgab fenüülpropanoidi rajaga.Fenüülalaniinall muundatakse esmalt kaneelhappeksfenüülalaniini ammonialüüsi toime(PAL) ja kaneelhape 4-hüdroksüülib kaneelhappega. Ensüüm (kaneelhappe-4-hüdroksülaas, C4H) ja 4-kumaraatkoensüüm A ligaas (4-kumaratekoensüüm A ligaas, 4CL) katalüüsivad reaktsiooni, tekitades 4-kumaroüül-CoA [11 ]. Kalkoonisüntaas (CHS) katalüüsib ühte 4-kumaroüül-CoA molekuli ja kolme malonüül-CoA molekuli, et tekitada naringeniini kalkoon, mis sisaldab flavonoidühendeid. Kalkoonisomeraasi, flavanoon-3-hüdroksülaasi põhiskelett, dihüdroflavonooli 4-reduktaas jne genereerib mitmesuguseid flavonoide, nagu isoflavoonid, flavonoolid, antotsüaanid jne [12]. Flavonoidide biosünteesiraja võtmeensüümina reguleerib CHS flavonoidide sisaldust taimedes ja mängib olulist rolli ka taimede õite värvuse reguleerimisel [13]. Näiteks Gentiana scabra Bunge CHS-i transkriptsioonijärgne geenivaigistamine võib pärssida antotsüaniinide biosünteesi ja põhjustada korollasagarate spetsiifilist valgenemist [14]. Actinidia erianthaBenth CHS geeni vaigistamine. CHS vähendab antotsüaniini sisaldust kroonlehtedes ja muudab kroonlehed punaseks. Kroonlehed muutuvad heledamaks[15]. Seetõttu klooniti selles uuringus CtCHS geen Cistanche tubulosa lilledest ning sellel viidi läbi bioinformaatika analüüs, prokarüootne ekspressioon ja puhastamine, ensüümi aktiivsuse analüüs, subtsellulaarne lokalisatsiooni analüüs ja ekspressioonianalüüs kolme värvi lilledega, et uurida CtCHS funktsiooni. valku ja CtCHS geeni ekspressioonimustrit kasutati CtCHS ja Cistanche tubulosa õievärvi vahelise seose esialgseks uurimiseks, mis pani aluse regulatiivse mehhanismi uurimisele.Cistanche tubulosa õievärv.

1 Materjalid ja instrumendid

1.1 Materjalid

Cistanche tubulosa lilled koguti Yutiani maakonnast Hotani prefektuurist Xinjiangist mais 2018. Proovide võtmisel järgiti juhuslikku põhimõtet ning valiti välja hea füsioloogilise seisundi ja ühtlase taimekõrgusega Cistanche tubulosa õied. Pekingi ülikooli farmaatsiakooli professor Tu Pengfei võttis kolm Cistanche tubulosa tüve kolme õievärviga valge, punane ja lilla ja tuvastas need kui Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Need külmutati kiiresti vedelas lämmastikus ja transporditi seejärel kuivjää hoidlas Pekingisse. E. coli DH5 keemiliselt pädevad rakud osteti ettevõttelt Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd. ja E. coli BL21 (DE3) keemiliselt pädevad rakud osteti ettevõttelt Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor osteti ettevõttest Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonüül-CoA osteti ettevõttelt Sigma Company, 4-kumaroüül-CoA, naringeniin -kalkoon osteti ettevõttelt Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. ja naringeniin osteti ettevõttelt Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumendid

Nanodrop 2000C spektrofotomeeter (Thermo Fisher Company, USA); gradient-PCR instrument (Eppendorf Company, Saksamaa); CFX 96 fluorestsents-kvantitatiivne PCR-seade, UVP-geelkuvar, geelelektroforeesi seade, valguelektroforeesi instrument (BioRad Company, USA); EnSpire

Mikroplaadi lugeja (PerkinElmer Company, USA); konstantse temperatuuriga inkubaator (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D suure võimsusega täistemperatuuri ostsillaator (Taicangi katseseadmete tehas); THZ-82Veevanni konstantse temperatuuriga ostsillaator (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ülipuhas töölaud (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); kõrgsurveauru sterilisaator (TOMY Company, Jaapan); Milli Q puhta vee instrument (Millipore, Ameerika Ühendriigid); LC-20Kõrgetõhus vedelikfaasi kromatograaf (Shimadzu Company, Jaapan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap kõrglahutusega massispektromeetria (Thermo Fisher Company, USA); FV1200 laserkonfokaalne mikroskoop (Olympus Company, Jaapan).

2 Eksperimentaalsed meetodid

2.1 RNA ekstraheerimine ja cDNA süntees.

Cistanche tubulosa lilled jahvatati vedelas lämmastikus ja seejärel viidi läbi RNA ekstraheerimise test.

Kogu RNA ekstraheeriti komplekti (Norgen, Cat 17200) abil, RNA kontsentratsioon ja kvaliteet tuvastati NanoDrop 2000C abil ning cDNA sünteesimiseks valiti pöördtranskriptsiooniks RNA proovid, mille A260/A280 suhe oli vahemikus 1,8 kuni 2,1. Kvalifitseeritud kogu-RNA cDNA-ks pöördtranskribeerimiseks kasutati M-MLV pöördtranskriptaasi (Promega, M170B). Eksperimentaalsed toimingud viidi läbi vastavalt juhistele.

2.2 CtCHS geeni kloonimine

Meie uurimisrühma Cistanche tubulosa lillede transkriptsiooniandmete põhjal [16] sõeluti välja täieliku avatud lugemisraamiga CtCHS ja SnapGene tarkvara kasutati spetsiifiliste praimerite kujundamiseks geenijärjestuse põhjal (tabel 1). PCR amplifikatsioon viidi läbi, kasutades matriitsina Cistanche tubulosa lille cDNA-d. Amplifikatsioonisüsteem oli 2 × Phanta Max Buffer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, üles- ja allavoolu praimerid (10 μmol/L) kumbki 2 μL, cDNA 2 μL, Phanta Max Super- Fidelity DNA Polymerase, 1 μL ddH2O 17 μL. Reaktsioonitingimused olid järgmised: eeldenatureerimine 95 kraadi juures 3 minutit; 25 denatureerimistsüklit 95 kraadi juures 15 sekundit, lõõmutamist 55 kraadi juures 15 sekundit ja pikendamist 72 kraadi juures 1 min; reaktsiooni pikendamine 72 kraadi juures 5 minutit. PCR saadus tuvastati 1% agaroosgeelelektroforeesiga ja geeli taastamiseks kasutati DNA puhastuskomplekti (Novizan, Cat DC301-01) ning seejärel puhastati kogutud DNA kiirkloonimiskomplektiga (Novizan, Cat). C601-01). DNA fragment ligeeriti pCE2TA/Blunt-Zero vektoriga, transformeeriti Escherichia coli DH5 kompetentsetesse rakkudesse ja pärast üleöö kultiveerimist 37 kraadi juures valiti välja üksikud kloontüved ja saadeti ettevõttele sekveneerimiseks.

Tabel 1 Praimeri järjestused

2.3 Bioinformaatika analüüs

Kasutage ProtParami võrgutarkvara valgu füüsikaliste ja keemiliste omaduste analüüsimiseks; kasutage valgu hüdrofiilsuse/hüdrofoobsuse analüüsimiseks võrgutööriista Prot Scale; kasutada võrgutööriista SOPMA, et ennustada valkude sekundaarset struktuuri; kasutada veebipõhise analüüsi tarkvara SWISS-MODEL valgu tertsiaarse struktuuri ennustamiseks; kasutada võrgutarkvara TMHMM Ennusta valgu transmembraanset struktuuri; kasutada DNAMAN tarkvara, et võrrelda CtCHS-i homoloogiat teiste liikide CHS-i aminohappejärjestustega; kasutage fülogeneetilise puu konstrueerimiseks MEGA-X tarkvara, kasutades naaberliitumist (NJ) ja Poissoni korrektsiooni. Evolutsiooniline kaugus arvutatakse Bootstrapi meetodil ja Bootstrapi korduste arv on 1000 korda.

2.4 CtCHS prokarüootne ekspressioon ja puhastamine

Disainige CtCHS järjestuse põhjal restriktsioonisaitidega BamHⅠ ja XhoⅠ praimerid ning PCR võimendab vastavaid sihtfragmente. pET-28a vektor ja sihtfragment lõigati, kasutades endonukleaase BamHI ja Kloonitud tüvi sekveneeriti ja plasmiid ekstraheeriti pärast õiget sekveneerimist. Sekveneerimisega kontrollitud pET-28a-CtCHS plasmiid kanti üle Escherichia coli BL21 (DE3) kompetentsetesse rakkudesse. Vaadake Ding Ning jt meetodit. [17] isopropüüliga

-D-tiogalaktopüranosiidi (IPTG) kasutati valgu ekspressiooni esilekutsumiseks madalal temperatuuril ja seda puhastati läbi Ni2+ afiinsuskromatograafia kolonni (Cytiva, Cat 17531901). Valk kontsentreeriti tsentrifuugimisega ultrafiltratsioonitorus (Millipore, 30 000) ja soolast eemaldati. Hoida 20 mmol/L KPB puhvris (pH 8,0, sisaldab 1 mmol/LEDTA) ja pikaajaliseks säilitamiseks –80 kraadises külmikus.

2.5 CtCHS ensüümi aktiivsuse analüüs

CtCHS ensüümi reaktsioonisüsteem: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonüül-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroüül-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantne valk 20 μL, in Pärast 12-tunnist reageerimist veevannis temperatuuril 37 kraadi, ekstraheeriti segu kolm korda 800 μL etüülatsetaadiga, kuivatati lämmastikuvooluga ja lahustati seejärel 100 μL metanoolis. Kasutage toote tuvastamiseks kõrgjõudlusega vedelikkromatograafiat. Tingimused on Ultimate LP-C18 kolonn (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), kolonni temperatuur 30 kraadi, proovi maht 10 μL ning vooluna vesi (A) ja atsetonitriil (B). Faas, elueerimise gradient: 0-10

min, 30% B; 10-20 min, 30-60% B; 20-25 min, 60-70% B; 25-30 min, 70-80% B; 30-35 min, 80-100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Mahuline voolukiirus on 1 ml/min ja tuvastamine toimub lainepikkusel 290 nm.

Edasiseks tuvastamiseks kasutati UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS-i. Vedelfaasi tingimused olid Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolonn (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonni temperatuur 40 kraadi, naringeniin- kaltooni ja naringeniini kontrollid. Toote laadimismaht on 4 μL ja ensüümi reaktsiooniprodukti laadimismaht on 7 μL. Liikuva faasina kasutatakse vett (A)-atsetonitriili (B). Elueerimisgradient on: 0 kuni 5 min, 30% B; 5 kuni 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Mahuline voolukiirus on 0,3 ml/min. Massispektromeetria tingimused on elektropihustusiooni allikas, kandegaasina lämmastik, mantligaasi rõhk 3,5 MPa, lisagaasi rõhk 1,0 MPa, pihustusrõhk 3500 V, kapillaari temperatuur 350 kraadi, lisagaasi kuumutamise temperatuur 200 kraadi, positiivsete ja negatiivsete ioonide režiimid, skaneerimine ioonivahemik m/z on 100-1500, MS täiseraldusvõime on 35 000, dd-MS2 eraldusvõime on 17 500, (N)

CE/astmeline nce on seatud väärtusele 35, 60.

2.3 Bioinformaatika analüüs

Kasutage ProtParami võrgutarkvara valgu füüsikaliste ja keemiliste omaduste analüüsimiseks; kasutage valgu hüdrofiilsuse/hüdrofoobsuse analüüsimiseks võrgutööriista Prot Scale; kasutada võrgutööriista SOPMA, et ennustada valkude sekundaarset struktuuri; kasutada veebipõhise analüüsi tarkvara SWISS-MODEL valgu tertsiaarse struktuuri ennustamiseks; kasutada võrgutarkvara TMHMM Ennusta valgu transmembraanset struktuuri; kasutada DNAMAN tarkvara, et võrrelda CtCHS-i homoloogiat teiste liikide CHS-i aminohappejärjestustega; kasutage fülogeneetilise puu konstrueerimiseks MEGA-X tarkvara, kasutades naaberliitumist (NJ) ja Poissoni korrektsiooni. Evolutsiooniline kaugus arvutatakse Bootstrapi meetodil ja Bootstrapi korduste arv on 1000 korda.

2.4 CtCHS prokarüootne ekspressioon ja puhastamine

Disainige CtCHS järjestuse põhjal restriktsioonisaitidega BamHⅠ ja XhoⅠ praimerid ning PCR võimendab vastavaid sihtfragmente. pET-28a vektor ja sihtfragment lõigati, kasutades endonukleaase BamHI ja Kloonitud tüvi sekveneeriti ja plasmiid ekstraheeriti pärast õiget sekveneerimist. Sekveneerimisega kontrollitud pET-28a-CtCHS plasmiid kanti üle Escherichia coli BL21 (DE3) kompetentsetesse rakkudesse. Vaadake Ding Ning jt meetodit. [17] isopropüüliga

-D-tiogalaktopüranosiidi (IPTG) kasutati valgu ekspressiooni esilekutsumiseks madalal temperatuuril ja seda puhastati läbi Ni2+ afiinsuskromatograafia kolonni (Cytiva, Cat 17531901). Valk kontsentreeriti tsentrifuugimisega ultrafiltratsioonitorus (Millipore, 30 000) ja soolast eemaldati. Hoida 20 mmol/L KPB puhvris (pH 8,0, sisaldab 1 mmol/LEDTA) ja pikaajaliseks säilitamiseks –80 kraadises külmikus.

2.5 CtCHS ensüümi aktiivsuse analüüs

CtCHS ensüümi reaktsioonisüsteem: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonüül-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroüül-CoA 2 μL, CtCHS rekombinantne valk 20 μL, in Pärast 12-tunnist reageerimist veevannis temperatuuril 37 kraadi, ekstraheeriti segu kolm korda 800 μL etüülatsetaadiga, kuivatati lämmastikuvooluga ja lahustati seejärel 100 μL metanoolis. Kasutage toote tuvastamiseks kõrgjõudlusega vedelikkromatograafiat. Tingimused on Ultimate LP-C18 kolonn (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), kolonni temperatuur 30 kraadi, proovi maht 10 μL ning vooluna vesi (A) ja atsetonitriil (B). Faas, elueerimise gradient: 0-10

min, 30% B; 10-20 min, 30-60% B; 20-25 min, 60-70% B; 25-30 min, 70-80% B; 30-35 min, 80-100% B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Mahuline voolukiirus on 1 ml/min ja tuvastamine toimub lainepikkusel 290 nm.

Edasiseks tuvastamiseks kasutati UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS-i. Vedelfaasi tingimused olid Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolonn (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonni temperatuur 40 kraadi, naringeniin- kaltooni ja naringeniini kontrollid. Toote laadimismaht on 4 μL ja ensüümi reaktsiooniprodukti laadimismaht on 7 μL. Liikuva faasina kasutatakse vett (A)-atsetonitriili (B). Elueerimisgradient on: 0 kuni 5 min, 30% B; 5 kuni 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Mahuline voolukiirus on 0,3 ml/min. Massispektromeetria tingimused on elektropihustusiooni allikas, kandegaasina lämmastik, mantligaasi rõhk 3,5 MPa, lisagaasi rõhk 1,0 MPa, pihustusrõhk 3500 V, kapillaari temperatuur 350 kraadi, lisagaasi kuumutamise temperatuur 200 kraadi, positiivsete ja negatiivsete ioonide režiimid, skaneerimine ioonivahemik m/z on 100-1500, MS täiseraldusvõime on 35 000, dd-MS2 eraldusvõime on 17 500, (N)

CE/astmeline nce on seatud väärtusele 35, 60.

2.6 CtCHS valgu subtsellulaarne lokaliseerimine

CtCHS järjestuse ja õmblusteta kloonimise põhimõtte alusel kavandati praimerid ensüümi lõikamissaitidega Kpn Ⅰ ja BamH Ⅰ ning vastavad sihtfragmendid amplifitseeriti PCR abil. Plasmiid pCAMBIA1300-35S-GFP lõigati restriktsiooni endonukleaasidega Kpn Ⅰ ja BamH Ⅰ ning sihtfragment ja vektor ühendati läbi õmblusteta kloonimiskomplekti (Novizan, Cat C115-01) ning seejärel kanti üle. E. coli DH5 kompetentsetesse rakkudesse. , valige järjestamiseks üksikud kloonitüved ja ekstraheerige plasmiidid õigetest tüvedest. Plasmiidid pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS ja pCAMBIA 1300-35S-GFP transformeeriti Arabidopsis thaliana protoplastideks, kasutades PEG4000, ja kultiveeriti nõrgas valguses 8–10 tundi. CtCHS valgu subtsellulaarset lokaliseerimist täheldati laserkonfokaalse mikroskoobi all.

2.7 CtCHS ekspressioonimustri analüüs

Reaalajas fluorestseeruvad kvantitatiivsed praimerid kavandati DNAMAN-i abil, mis põhineb CtCHS-järjestusel, kusjuures sisemise võrdlusgeenina oli F-box. Praimeri järjestused on näidatud tabelis 1. CtCHS suhteline ekspressioon erinevat värvi Cistanche tubulosa lilledes tuvastati reaalajas fluorestseeruva kvantitatiivse PCR-ga. Mõõtmiseks SYBRGreeni fluorestsentsvärvimeetodiga kasutage TransStart Green qPCR SuperMixi (täiskuldne, AQ101-02). Reaktsioonisüsteem: 2 × TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, üles- ja allavoolu praimerid (10 μmol/L) 0,2 μL kumbki, cDNA matriits 0,5 μL, kasutati 4,1 μL nukleotidaasivaba vett reaktsiooni jaoks kaheetapilise meetodi abil. Reaktsiooniprotseduur põhines Dong Xianjuani et al. [18]. Iga proov sisaldas 3 bioloogilist kordust ja katset korrati kolm korda. Eksperimentaalseid andmeid analüüsiti Exceli abil, CtCHS suhteline ekspressioon arvutati 2−ΔΔCt meetodil ning GraphPadPrism 8 kasutati olulisuse analüüsi tegemiseks ja histogrammide joonistamiseks.