Clec12a leevendab põletikku, piirates samal ajal kolitogeense kommensaali laienemist

KOKKUVÕTE

Mikrobioota reguleerimine on soolestiku tervise jaoks kriitiline, kuid kaasasündinud immuunsuse mehhanismid jäävad ebaselgeks. Siin näitame, et hiirtel, kellel puudus C-tüüpi lektiini retseptor Clec12a, tekkis tõsine koliit, mis sõltus mikrobiotast. Iduvabadel hiirtel tehtud fekaal-mikrobiota siirdamise (FMT) uuringud näitasid Clec12a-/- hiirtes moodustunud kolitogeenset mikrobiootat, mida iseloomustas grampositiivse organismi, Faecalibaculum näriliste, laienemine. Ravi F. rodentiumiga oli piisav koliidi süvendamiseks metsiktüüpi hiirtel. Soolestiku makrofaagid ekspresseerivad kõrgeimat Clec12a taset. Tsütokiinide ja sekveneerimise analüüs Clec12a-/- makrofaagides näitas suurenenud põletikku, kuid fagotsütoosiga seotud geenide märgatavat vähenemist. Tõepoolest, Clec12a-/- makrofaagide võime omastada F. rodentiumi on halvenenud. Puhastatud Clec12a seondumine oli suurem grampositiivsete organismidega, nagu F. rodentium. Seega tuvastavad meie andmed Clec12a kui kaasasündinud immuunseiremehhanismi, mis kontrollib potentsiaalselt kahjulike kommensaalide laienemist ilma ilmse põletikuta.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

SISSEJUHATUS

Mikrobioota koostisel ja funktsioonil võib olla sügav mõju imetajate tervisele ja haigustele (Fassarella et al., 2021). See on hästi dokumenteeritud põletikulise soolehaiguse (IBD) puhul, kus enamik IBD hiiremudeleid on tundlikud mikrobiota koostise muutuste suhtes (Gkouskou et al., 2014). Mikrobiootal põhinevate ravimeetodite väljatöötamisel on oluline mõista mikrobioota stabiilsust mõjutavaid ja juhendavaid tegureid (Sharma et al., 2020; Sorbara ja Pamer, 2022). Mikrobiootat mõjutavad mitmed parameetrid, sealhulgas toitumine, ravimid ja immuunsüsteem. Viimastel aastatel on näidatud, et adaptiivsed immuunkomponendid, eriti IgA, mõjutavad mikrobiota koostist (Nakajima et al., 2018; Okai et al., 2016; Yang ja Palm, 2020). Siiski on vähem teada, kuidas spetsiifilised kaasasündinud immuunretseptorid mõjutavad homöostaatilist mikrobiota koostist.

Mikroobide äratundmist ja limaskesta immuunsust reguleerivate geenide geneetilised polümorfismid on IBD, sealhulgas autofagia valgu ATG16L1 olulised riskialleelid (Cadwell et al., 2008; Liu et al., 2015; Rioux jt, 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007 ). Hiljutises uuringus, milles uuriti müeloidse geeni ekspressiooni muutusi ATG16L1T300A polümorfismiga indiviididel, tuvastati, et inhibeeriv C-tüüpi lektiini retseptor (CLR) Clec12a on nendes rakkudes oluliselt alla surutud (Begun et al., 2015). See sama uuring näitas, et Clec12a kaitseb autofagia rajaga seotud patogeense infektsiooni eest. Need andmed viitavad sellele, et Clec12a alareguleerimine IBD-ga inimestel võib mõjutada haiguse tõsidust ja/või arengut. Vaatamata nendele tõenditele on vähe teada immuunregulatsiooni mehhanismidest, mida Clec12a avaldab koliidi ajal.

C-tüüpi lektiinid on mitmekesine lahustuvate või membraaniga seotud molekulide rühm, mis on võimelised siduma nii peremeesorganismist kui ka mikroobidest pärinevaid lipiide, valke ja süsivesikuid (Brown et al., 2018). Mincle (Clec4e) ja Dectin-1 (Clec7a) on kaks CLR-i, mis mõjutavad mikrobiota spetsiifilisi liikmeid, et säilitada soolestiku homöostaasi (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez jt, 2019). Enam kui 1,000 erineva C-tüüpi lektiiniga on aga selles valguperekonnas veel palju avastamist. Clec12a kuulub looduslike tapjaretseptorite perekonda ja on üks kahest C-tüüpi lektiinist, mis sisaldavad immuuntürosiini inhibeerivat motiivi (ITIM), mis on võimeline piirama põletikulisi signaaliülekandeteid (Brown et al., 2018; Marshall et al., 2004). . Clec12a tunneb ära kusihappe, mis on signaal rakukahjustusest (Neumann et al., 2014). Clec12a ekspresseerub kõige enam kaasasündinud immuunrakkudes ja neutrofiilides vähendab see kusihappe tuvastamisel aktivatsiooni ja reguleerib põletikuliste tsütokiinide tootmist (Neumann et al., 2014). Seevastu Clec12a soodustab põletikku, võimaldades mononukleaarsetel fagotsüütidel (MNP) transmigratsiooni läbi hematoentsefaalbarjääri hulgiskleroosi autoimmuunmudeli ajal ja võimendades I tüüpi interferooni signaaliülekannet vastuseks viirusinfektsioonile (Li et al., 2019; Sagar et al. ., 2017). Clec12a on samuti võimeline ära tundma plasmodiaalset produkti hemosoiini, mis on näidanud, et pärast Plasmodium'i nakatumist suurendab CD8+ T-rakkude arvu ajus (Raulf et al., 2019). Seega esindab Clec12a valimatut CLR-i, millel on erinevad rollid immuunsuse ja ainulaadsete signaalimisvõimete osas, kuid selle roll soolestikus jääb teadmata.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Oleme varem näidanud, et spetsiifilised sooleseened süvendavad koliiti, indutseerides puriini metaboliiti, kusihapet (Chiaro et al., 2017). Veelgi enam, puriini metabolismi seostati hiljuti inimese soolehaigusega (Zhu et al., 2019). Need andmed viitavad ühiselt sellele, et kusihappe tuvastamine võib olla oluline IBD puhul. Selle põhjal asusime uurima Clec12a funktsiooni soolestikus. Leidsime, et Clec12a puudulikkusega loomad on väga vastuvõtlikud koliidile, mis sõltub Clec12a puudumisel moodustunud mikrobiota koostisest. Clec12a-/- mikrobiota FMT WT mikroobivabadesse loomadesse oli piisav koliidi ägenemiseks ja kolitogeense mikrobiota moodustumine Clec12a-/- loomadel ei sõltu adaptiivsest immuunsusest. Koliiti süvendada võivate asjakohaste mikroobide tuvastamiseks raviti Clec12a-/- loomi erinevate antibiootikumidega ja need, mis olid suunatud grampositiivsetele bakteritele, leevendasid haigusi. 16S rDNA sekveneerimine tuvastas, et Faecalibaculum rodentium esineb Clec12a-/- loomadel oluliselt rohkem ja F. rodentium'i suukaudsest sondist piisas haiguse patoloogia süvenemiseks WT loomadel. Clec12a-/- loomade immuunprofiilide koostamine näitas homöostaatiliste müeloidrakkude märgatavat vähenemist käärsooles. F. rodentiumiga töödeldud makrofaagide RNA sekveneerimine näitas, et Clec12a soodustab fagotsütoosi. Kuna on näidatud, et Clec12a seob mitut ligandit, küsisime, kas Clec12a seostub mikrobiota erinevate liikmetega. Kasutades Clec12a-Fc sulandvalku, tuvastame, et Clec12a seondub kõige tugevamalt mikrobiota grampositiivsete liikmetega. Need andmed viitavad ühiselt mudelile, mille kohaselt Clec12a kontrollib mikrobiota kolitogeenseid liikmeid otsese seondumise ja fagotsütoosi kaudu, vältides samal ajal põletikulisi reaktsioone. Stsenaariumide korral, kus Clec12a ekspressioon väheneb, võivad grampositiivsed patobionid laieneda ja põletikku soodustada. Seega tuvastavad meie uuringud Clec12a olulise põletiku supressorina, et tagada homöostaas ja tervisliku mikrobiota säilitamine.

TULEMUSED

Clec12a-/- loomad on väga vastuvõtlikud koliidile, sõltumata adaptiivsest immuunsüsteemist

IBD-ga inimestel on teatatud Clec12a ekspressiooni vähenemisest ja oleme näidanud, et ühe Clec12a ligandi, kusihappe, tootmise blokeerimine võib leevendada koliiti (Begun et al., 2015; Chiaro et al., 2017; Liu et al. ., 2015). Siiski ei ole Clec12a-d koliidi loommudelites veel uuritud. Selleks nakatati WT ja Clec12a-/- C57BL/6 hiiri ägeda DSS-koliidiga. Clec12a-/- loomad kaotasid oluliselt rohkem kaalu, neil olid lühemad käärsooled ja nende põletikumarkeri LCN2 sisaldus väljaheites suurenes oluliselt võrreldes WT loomadega, mis näitab põletiku ja haiguse süvenemist (joonis 1A-C). Seda toetades näitas histoloogiline analüüs suurenenud epiteeli kahjustusi, krüptide kadu ja immuunrakkude sissevoolu Clec12a-/- loomadel võrreldes WT-ga (joonis 1D, E). Kooskõlas DSS koliidi mudeli tulemustega CD4+ CD45RBhi rakkude ülekandmine TCRb-/-; Clec12a-/- topeltknockout hiired tõid aja jooksul kaasa väiksema kaalutõusu ja lühemad käärsooled võrreldes TCRb-/- hiirtesse üle kantud T-rakkudega (joonis 1F, G). Need tulemused näitavad ühiselt, et Clec12a kadumine põhjustab soolehaiguse süvenemist.

On teatatud, et Clec12a ekspresseerub suures osas kaasasündinud immuunrakkudes ja CD8+ T-rakkudes on väga madal ekspressioon. Seetõttu, et teha kindlaks, kas adaptiivne immuunsus on seotud Clec12a-/- loomadel täheldatud halvenenud haigusega, ristati Clec12a-/- loomad Rag-/- loomadega, et eemaldada nii T- kui ka B-rakud. Jällegi arenes Clec12a-/- loomadel haigus WT loomadega võrreldes halvemaks, kuna nad kaotasid rohkem kaalu ja neil oli lühemad käärsooled kui WT kontrollidel (joonis 1H, I). Samamoodi Clec12a-/-; Rag-/- arenes soolehaiguse ägenemine võrreldes Rag-/- kontrollidega ja ta kaotas sama palju kaalu ja jämesoole lühem kui WT ja Rag-/- kui Clec12a-/- (joonis 1H, I). Oleme varem teatanud, et suukaudne ravi S. cerevisiae'ga suurendab kusihappe taset ja süvendab koliiti. Siiski ei täheldatud erinevusi kusihappe tasemes seerumis või väljaheites WT versus Clec12a-/- loomadel, mis viitab sellele, et Clec12A-/- puhul täheldatud suurenenud haigus ei ole tingitud kusihappe suurenemisest (joonis S1). Seega ei sõltu Clec12a-/- loomadel täheldatud koliidi halvenemine adaptiivsest immuunsüsteemist.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Clec12a-/- loomade süvenenud koliit sõltub mikrobiotast

On teada, et koliit on osaliselt tingitud muutustest mikrobiota koostises (Kubinak et al., 2015; Ray ja Dittel, 2015). Et teha kindlaks, kas Clec12a-/- loomadel on mikrobiota, mis soodustab koliidi ägenemist, viidi WT või Clec12a-/- hiirtelt läbi FMT-d iduvabadeks WT loomadeks. Neli nädalat pärast siirdamist majutati pooled loomadest koos, teine ​​pool aga eraldi. Seejärel indutseeriti igas rühmas äge DSS-koliit (joonis 2A). Loomad, kes said Clec12a-/- FMT ja koos peeti loomad, kaotasid oluliselt rohkem kaalu (joonis 2B) ja neil oli oluliselt lühemad käärsooled (joonis 2C) kui loomad, kes said FMT WT hiirtelt. Lisaks näitas histoloogiline analüüs suuremat epiteeli kahjustust ja põletikulist sissevoolu pärast siirdamist Clec12a-/- mikrobiotaga (joonis 2D, E). Väljakujunenud mikroobikooslused erinesid rühmade vahel, mis määrati kindlaks 16S rRNA geenide järjestamisel, kasutades Bray-Curtist (PERMANOVA, p=0.0001), kaalumata (PERMANOVA, p=0.0062) ja kaalutud- Unifrac vahemaad (PERMANOVA, p=0.0001). Rühmasisene mikrobiota erinevus oli suurim koospeetavatel loomadel samade näitajate järgi, mis näitavad mikroobide omandamist igast FMT genotüübist (joonis 2 FH). Need andmed näitavad, et süvenenud koliit Clec12a-/- loomadel on põhjustatud spetsiifilistest mikroobidest, mis on rikastatud Clec12a puudumisel; ja nendest mikroobidest said kolitogeense fenotüübi domineerivad tegurid isegi väljakujunenud WT mikrobiota juuresolekul.

Clec12a-/- loomadel moodustunud mikrobiota koostis ei sõltu adaptiivsest immuunsusest

Immuunsüsteem on oluline mikrobiota koostise määramisel. FMT eksperiment näitas, et Clec12a-/- põhjustab muutusi mikrobiota koostises, mis soodustab koliidi halvenemist. Kõigepealt tahtsime kindlaks teha, kas immuunkambris esinev Clec12a-/- defitsiit on võimeline soolestiku mikrobiota ümber kujundama. Sel eesmärgil viidi WT või Clec12a-/- hiirte luuüdi surmavalt kiiritatud WT SPF-i retsipienthiirtele, et standardida mikrobiota, millele järgnes 8-nädalane immuunsüsteemi taastamise periood (joonis 3A). Selle aja jooksul on siirdatud immuunsüsteemil aega retsipiendi sees areneda, kujundades erinevalt mikrobiota koostist. Et teha kindlaks, kas sellest immuunskulptuurist tulenevad prokolitogeensed muutused mikrobiotas, teostasime FMT-d, kasutades kas WT või Clec12a-/- kimäärsete hiirte väljaheiteid ja indutseerisime DSS-i koliiti (joonis 3A). Kuigi kaalukaotuses olulisi muutusi ei toimunud (joonis 3B), olid Clec12a-/- kimäärsete hiirte FMT-d saanud loomade käärsooled oluliselt lühemad, võrreldes loomadega, kes said FMT-d WT-hiirtelt (joonis 3C), mis viitab haiguse ägenemisele. Veelgi enam, kui WT ja Clec12a-/- FMT retsipiente majutati koos, olid käärsooled oluliselt lühemad, võrreldes loomadega, kes said WT FMT (joonis 3C). Seega põhjustab Clec12a-/- puudulikkus hematopoeetilises sektsioonis domineeriva kolitogeense mikrobiota moodustumist.

Et täiendavalt kinnitada, et adaptiivne immuunsüsteem on Clec12a-/- loomadel kolitogeense mikrobiota moodustamiseks hädavajalik, teostasime FMT, kasutades Rag-/- või Rag-/- väljaheiteid; Clec12a-/- -, nagu eelnevalt kirjeldatud. Loomad, kes said Rag-/-; Clec12a-/- FMT kaotas rohkem kaalu ja neil olid oluliselt lühemad käärsooled kui loomadel, kes olid saanud FMT Rag-/- loomadelt, pealegi arenes koos peetavatel loomadel haigus süvenes (joonis 3D, E). Need andmed näitavad, et Clec12a puudulikkus kaasasündinud immuunsüsteemis on piisav, et tekitada mikrobiota, mis on võimeline süvendama koliiti.

Clec12a pärsib Faecalibaculum rodentium'i laienemist

Kasutasime Clec12a-/- loomade haigusi põhjustavate asjakohaste organismide tuvastamiseks mitmeid erinevaid antibiootikume. Esiteks, ravi tugevatoimelise laia toimespektriga antibiootikumide kokteiliga, mis sisaldab erütromütsiini, ampitsilliini, neomütsiini ja gentamütsiini, vähendas märkimisväärselt haiguse tõsidust nii Clec12a-/- kui ka WT loomadel, mis viitab sellele, et mikrobiota bakteripopulatsioon oli haiguse jaoks oluline. joonis fig 4A; joonis S2). Järgmisena piirasime veelgi, millised bakteripopulatsioonid olid haiguse jaoks kõige olulisemad, kasutades erinevaid antibiootikume, mis on suunatud ainulaadsetele bakteritaksonitele. Täpsemalt valisime gentamütsiini, aminoglükosiidi, mis on suunatud gramnegatiivsetele bakteritele, ja tsefalotiini, tsefalosporiini, mis on suunatud peamiselt grampositiivsetele bakteritele. Neid ravimeid manustati Clec12a-/- loomadele DSS-i koliidi ajal. Kuigi ravi gentamütsiiniga ei muutnud haiguse tõsidust, säilitasid tsefalotiini saanud loomad oma kehakaalu ja nende käärsooled olid oluliselt pikemad kui näidisravi saanud loomadel (joonis 4B, C), mis näitab, et Clec12a-/- mikrobiootas elavad grampositiivsed organismid mängivad. oluline roll haiguse patoloogia süvenemisel.

Järgmisena teostasime SPF WT ja Clec12a-/- väljaheidete 16S rRNA geenide sekveneerimise, et profiilida mikrobiota koostise muutusi. WT ja Clec12a-/- loomad rühmitasid oluliselt erinevalt nii mitte-fülogeneetiliste kui ka fülogeneetilise arvukuse kaalutud mõõdikute, vastavalt Bray-Curtise ja kaalutud UniFrac järgi (joonis S3A-C). Alfa mitmekesisuse mõõdikud ei näidanud olulisi erinevusi rikkuses (täheldatud tunnused), mis näitab, et Clec12a-/- ei sisaldanud rohkem liike (joonis 4D). Clec12a puudumisel suurenesid aga ühtluse ja Shannoni mitmekesisuse indeksid, mis näitab, et bakterite proportsionaalne jaotus Clec12a-/- hiirtel oli muutunud (joonis 4E, F) ja toetab veelgi, et Clec12a on oluline mikrobiota struktuuri reguleerimiseks soolestikus.

Mikrobioomide koostise (ANCOM) analüüs näitas, et erinevalt arvukate ASV-de (amplikonjärjestuse variandid) hulgas oli Faecalibaculum perekonda (Erysipelotrichaceae perekond) klassifitseeritud ASV Clec12a-/- väljaheidetes oluliselt laienenud, võrreldes WT-ga (joonis). 4G, H). Meie analüüsi USA tüüpilist järjestust kasutav BLAST näitas 100% identsust bakteri Faecalibaculum rodentium järjestustega. Need andmed tõendavad, et Clec12a-/- looma grampositiivsed bakterid vastutavad kolitogeense fenotüübi eest ja seostavad grampositiivset organismi F. rodentium haiguse ägenemises.

Selle põhjal kontrollisime hüpoteesi, et F. rodentium võib koliiti ägendada. Me eeltöötlesime WT SPF loomi 1 x 108 CFU kas elus või fikseeritud F. rodentiumiga suukaudse sondiga ja jätkasime ravi iga päev DSS akuutse mudeli ajal, et tagada F. rodentium'i kolonisatsiooni kõrge tase. Loomad, kes said nii elusat kui ka fikseeritud F. rodentium'i, kaotasid rohkem kaalu ja nende käärsooled olid oluliselt lühemad kui kandjaga töödeldud loomadel (joonis 4I, J), mis näitab, et F. rodentiumi suurenenud tase võib haigust halvendada.

Clec12a piirab makrofaagide põletikulist vastust, suurendades samal ajal fagotsütoosi

Clec12a raku ekspressiooni määratlemiseks haiguse puudumisel profileerisime kaasasündinud ja adaptiivsed immuunrakud lamina proprias (LP), kasutades mitmevärvilist voolutsütomeetriat. Kooskõlas varasemate aruannetega piirdub Clec12a valdavalt müeloidse liiniga, millel puudub ekspressioon lümfotsüütidel (joonis 5A) (Han et al., 2004; Pyz jt, 2008; Sobanov et al., 2001). Soole neutrofiilid, makrofaagid ja dendriitrakud näitasid sarnaseid Clec12a ekspressioonitasemeid (joonis S4A), samas kui makrofaagidel oli Clec12a ekspresseerivates soolestiku kudedes suurim protsent (joonis 5A). Arvestades makrofaagide kahekordset rolli põletiku soodustamisel klassikalise aktiveerimise kaudu, aga ka reparatiivsete mehhanismide käivitamisel vastuseks koekahjustustele, küsisime, kuidas Clec12a võib koliidi ajal seda dihhotoomiat mõjutada. Kuigi makrofaagid on üsna mitmekesised, saab need vastavalt CD38 ja EGR2 ekspressiooni järgi jagada M1 põletikulisteks ja M2 reparatiivseteks makrofaagideks. Näitame, et Clec12a-/- loomadel on koliidi ajal käärsoole LP-s M1 makrofaagide arv ja M2 makrofaagide arv vähenenud (joonis 5 B, C, joonis S4B). Need andmed näitavad, et Clec12a reguleerib makrofaagide vastuseid soolestikus.

Et paremini mõista, kuidas Clec12a mõjutab makrofaagide bioloogiat vastusena mikroobsetele ligandidele, töödeldi WT-st või Clec12a-/- loomadest eraldatud luuüdist pärinevaid makrofaage (BMDM) mitmesuguste tavaliste mikroobsete liganditega, sealhulgas LPS, Pam3CysK ja Flagellin. Kõigi nende proovidega viidi läbi tsütokiinide analüüs. Paljud testitud tsütokiinid ei indutseeritud nendes tingimustes, kuid nendes kultuurides tuvastati pidevalt MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a ja IL{10}} ( Joonis 5D). Clec12a-/- BMDM-idel oli nende tsütokiinide ekspressioon oluliselt kõrgem vastusena paljudele mikroobsetele liganditele ja suurimaid diferentsiaalseid vastuseid täheldati vastusena TLR2 agonistile Pam3CysK. Need andmed on kooskõlas Clec12a teadaoleva rolliga põletikuliste reaktsioonide leevendamisel steriilse põletiku ajal (Neumann et al., 2014).

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

RNA-seq viidi läbi F. rodentiumiga töödeldud WT või Clec12a-/- BMDM-idega, et teha kindlaks, kuidas Clec12a reguleerib nende rakkude vastuseid sellele spetsiifilisele bakteriorganismile. Hindasime erinevat reaktsiooni, võrreldes F. rodentiumiga kokku puutunud Clec12a-/- BMDM-e vehiikuli kontrollide suhtes WT BMDM-idega. Diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide rikastusanalüüs näitas, et Clec12a puudulikkusega makrofaagidel oli F. rodentiumiga nakatamisel oluline rakutsükli kontrolliga seotud geenide arv (joonis S5A). Rakutsükkel on olemuslikult seotud fagotsütoosiga ning ka fagotsütoosi ja põletikulise vastusega seotud geenide arv vähenes oluliselt (joonis 5E) (Luo et al., 2005). Kooskõlas hiljutise Clec12a ja Salmonella uuringuga viitavad need andmed sellele, et fagotsütoos on Clec12a puudumisel puudulik vastuseks normaalsele soolestiku elanikule F. rodentium (Begun et al., 2015). Selle testimiseks koguti WT- ja Clec12a-/- loomadelt kõhukelme makrofaagid ja kultiveeriti koos Sybr®-rohelise märgistusega F. rodentiumiga. Clec12a-/- makrofaagidel oli raku kohta oluliselt vähem mikroobe (joonis 5F, G; joonis S5B), mis näitab, et Clec12a puudulikkus põhjustab vähemate organismide omastamist ja on kooskõlas vähenenud fagotsütoosiga RNA-seq andmestikus. Need andmed näitavad ühiselt, et Clec12a mängib kahekordset rolli, leevendades ilmseid põletikulisi reaktsioone tavalistele mikroobsetele liganditele, soodustades samal ajal makrofaagide bakterite omastamist.

Clec12a seostub eelistatult grampositiivsete kommensaalidega

Kuna fagotsütoosi käivitab mikroobide seondumine, millele järgneb internaliseerimine ja tapmine, oletasime, et Clec12a suutis seostuda mikrobiota spetsiifiliste liikmetega, nagu F. rodentium. Selle võimaluse käsitlemiseks loodi sulandvalk, mis sisaldab hiire Clec12a ekstratsellulaarset sidumisdomeeni ja inimese IgG1 Fc osa (Clec12a-Fc) (joonis 6A) (Maglinao et al., 2014; Neumann et al., 2014; Raulf jt, 2019). Valk puhastati ja skriiniti seondumise suhtes erinevate grampositiivsete ja gramnegatiivsete bakterite paneeliga, mis teadaolevalt esinevad homöostaatilises soolestikus, sealhulgas F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes uniformis, ja seente kommensaalne Candida albicans voolutsütomeetria abil. Kaasati ka Salmonella enterica, kuna varasemad uuringud näitasid, et Clec12a võib olla seotud S. enterica sisenemisega rakku (Begun et al., 2015). Clec12a seostus erineval määral mitmete fülogeneetiliselt erinevate bakteritega, sealhulgas F. rodentium, kuid mitte seentega C. albicans (joonis 6B). Clec12a seostus kõige enam grampositiivsete organismidega F. rodentium ja Lachnospiraceae perekonna Roseburia sp. liikmega ning interakteeris kõige vähem B. animalis'e, B. uniformis'e ja S. enterica'ga (joonis 6B), mis näitab Clec12a purki seonduvad mikrobiota spetsiifiliste liikmetega, eelistades grampositiivseid organisme. Kokkuvõttes tuvastavad meie andmed Clec12a kui mehhanismi, mida immuunsüsteem kasutab soolestiku mikroobide kogukonna uurimiseks ja mikrobiota kärpimiseks otsese seondumise ja fagotsütoosi kaudu, vältides samal ajal ilmseid põletikulisi reaktsioone rohketele grampositiivsetele mikroobidele, mis on soolestiku tervise säilitamiseks kriitilise tähtsusega.

ARUTELU

Homöostaas soolestikus nõuab mehhanisme kommensaalsete mikroobide piiramiseks, põhjustamata kahjustavat põletikku (Macpherson et al., 2000). IgA on viimastel aastatel kujunenud üheks kriitiliseks viisiks, kuidas soolestiku immuunsus võib mikrobiota üle kontrollida (Pabst ja Slack, 2020). Tõepoolest, IgA on võimeline otseselt seonduma mikroobide ja/või nende saadustega ning eemaldama need soolestikust ilma prototüüpse põletiku esilekutsumiseta. Teisi immuunmolekule, millel on need kahesugused omadused, ei ole siiani uuritud. C-tüüpi lektiinid hõlmavad mitmekesist valkude klassi, mis suudavad ära tunda mitmesuguseid mikroobi- ja peremeesproduktidest pärinevaid valke, süsivesikuid ja lipiidimolekule (Brown et al., 2018; Drouin et al., 2020). Siiski on vähe uuritud soolestiku immuunsuse ja mikrobiota kontekstis (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez jt, 2019). Seega on meie teadmiste kohaselt see esimene tõestus, et Clec12a puudulikkus muudab haiguse tõsidust põhjustava mikrobiota koostist.

cistanche on kasulikud - tugevdab immuunsüsteemi

Clec12a on suures osas uuritud mononaatriumuraadi (MSU) või kusihappe äratundmise kontekstis, mis on sageli rakusurma tunnuseks (Kono et al., 2010; Neumann et al., 2014). Kusihape on võimeline aktiveerima põletikulisi reaktsioone läbi NLRP3 põletiku, seega tuleb seda põletikku kontrollida, et vältida kudede hävimist rakusurma ajal (Martinon et al., 2006). Näidati, et Clec12a tasakaalustab seda põletikulist vastust Syk signaaliülekande allareguleerimise kaudu (Marshall et al., 2004). Sellega kooskõlas põhjustab Clec12a deletsioon steriilse põletiku mudelis ja artriidi autoinflammatoorses mudelis neutrofiilide aktiveerimist ja haiguse süvenemist, muutes Clec12a oluliseks põletikupiduriks (Redelinghuys et al., 2016). Kuid hiljuti näidati, et Clec12a suurendab ka I tüüpi interferooni signaaliülekannet vastuseks viirusinfektsioonile ja vahendab Salmonella omastamist antibakteriaalse autofagia raja kaudu (Begun et al., 2015; Li et al., 2019). See näitab, et Clec12a ei toimi ainult põletiku piiramiseks, vaid võib sõltuvalt kontekstist mängida erinevaid rolle. Soolestik erineb selle poolest, et isegi haiguse puudumisel on palju immuunrakke. See on tingitud mikrobiota olemasolust, millel on oluline roll immuunsüsteemi arengu juhendamisel ja patogeensete organismide koloniseerimise ennetamisel. Mikrobiootal on samad pinnamustrid, mille tuvastavad TLR-id, mis tunnevad ära ka patogeenid, ja seetõttu peavad soolestiku immuunsüsteemil olema ranged regulatiivsed mehhanismid, et piirata nende võõrorganismide põletikku (Blander et al., 2017).

Algselt hakkasime Clec12a vastu huvi tundma, kuna tuvastasime, et sooleseened Saccharomyces cerevisiae indutseerivad kusihapet koliidi süvenemiseks (Chiaro et al., 2017). Lisaks on teistes uuringutes tuvastatud, et mikrobiota võib mõjutada soolehaigusi puriinide metabolismi indutseerimise kaudu, mille lõppsaadus imetajatel on kusihape (Zhu et al., 2019). Need andmed viitavad sellele, et kusihappe tajumise mehhanismid, nagu Clec12a, võivad mõjutada soolestiku homöostaasi. Siiski ei täheldanud me muutusi kusihappe tasemes seerumis ega väljaheites, mis näitab, et Clec12a-/- looma suurenenud kusihappesisaldus ei põhjustanud haiguse tõsidust. Kuid koliidi suurenenud raskusaste Clec12a-/- puhul on tingitud mikrobiota koostisest. Seega võib meie andmete põhjal Clec12a-/- vähenenud ekspressioon mõjutada IBD patsientide mikrobiota koostist (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar et al., 2010). Huvitaval kombel leidsime, et grampositiivsetele organismidele suunatud antibiootikumid suutsid Clec12a-/- loomadel koliidi raskust leevendada. See on vastupidine mitmetele aruannetele, mis on tuvastanud soolepõletiku ajal laienenud gramnegatiivseid Enterobacteriaceae, seega on see üks väheseid uuringuid, mis on tuvastanud koliidi arenguga seotud grampositiivsete organismide suurenemise. Kuigi see ei ole tõenäoliselt ainus organism, mis selles mudelis koliidi raskusastet mõjutab, täheldati Clec12a-/- loomadel F. rodentium'i dramaatilist laienemist. F. rodentium on Firmicutes (Bacillota) phila grampositiivne, oksüdaas- ja katalaasnegatiivne liige (Chang et al., 2015). F. rodentium'i igapäevane sissetoomine isegi WT hiirtele suurendab koliiti, kinnitades, et F. rodentium'i suurenenud tase soolestikus on kahjulik ja põhjustab tõenäoliselt koliidi raskust Clec12a-/-. Hiljutine aruanne näitas, et F. rodentium võib suurendada epiteeli ringlust ja pärssida ensüümide ekspressiooni epiteelis, mis vähendavad põletikulisi reaktsioone ning on seega kooskõlas haiguse ägenemisega, mida näeme, kui F. rodentium laieneb soolestikus (Cao et al., 2022). Kuna inimesi koloniseerib F. rodentiumiga sarnane organism (Zagato et al., 2020), peaksid edasised uuringud selgitama nende F. rodentiumi-sarnaste bakterite mõju koliidiga seotud inimese füsioloogia aspektidele.

Toetades Clec12a rolli kaasasündinud immuunrakkude seas, täheldasime, et kolitogeenne mikrobiota moodustub endiselt Clec12a-/- loomadel, kellel puudub adaptiivne immuunsüsteem. Suurim protsent Clec12a ekspresseerivatest rakkudest soolestikus oli makrofaagid, mille tõttu keskendusime nendes rakkudes Clec12a funktsioonile. Varasemad uuringud on näidanud, et Clec12a on I tüüpi interferooni tootmise oluline vahendaja vastuseks viirusinfektsioonile (Li et al., 2019). Siiski ei ole hinnatud, kuidas Clec12a mõjutab vastuseid paljudele bakteriaalsetele liganditele; see on väga oluline soolestikus, kus on palju TLR ligande. Siin näitame, et Clec12a aitab leevendada makrofaagide reaktsioone soolestikus ja toimib tõenäoliselt homöostaasi tagamiseks vastusena mikrobiootale. F. rodentiumiga inkubeeritud makrofaagide RNA-seq tõi esile, et Clec12a puudulikkus põhjustab vastusena nendele kommensaalsetele bakteritele rakutsükli ja fagotsütoosi defekte. Hiljutine uuring näitas, et Clec12a-/- makrofaagid vähendasid vastusena salmonellale autofaagiat (Begun et al., 2015). Meie andmed kiidavad ja laiendavad neid leide, et hõlmata seda, et Clec12a toimib ka mitteinvasiivsete kommensaalsete organismide tõrjeks. Teised on näidanud, et F. rodentium mõjutab epiteeli bioloogiat, mis viitab sellele, et F. rodentium asub peremeesorganismi vahetus läheduses ja seega peab immuunsüsteem seda kindlalt kontrollima. Meie andmed kinnitavad, et Clec12a kontrollib F. rodentiumit fagotsütoosi reguleerimise kaudu. Fagotsütoosi algatab ligandi või mikroobi füüsiline seondumine ja C-tüüpi lektiinid võivad seostuda mitme ligandiga, mis viis meid testima, kas Clec12a võib seostuda otseselt soolestikus elavate bakteritega. Huvitav on see, et Clec12a seostus kõige tugevamalt grampositiivsete organismidega F. rodentium ja Roseburia ning palju vähem gramnegatiivsete organismidega A. muciniphila ja B. uniformis ning mitte üldse C. albicansiga. Need andmed näitavad, et Clec12a-l on kalduvus siduda mikrobiota spetsiifilisi liikmeid. See võimaldab meil luua mudeli, mille abil Clec12a seotus ja sellele järgnev fagotsütoos võivad kontrollida mikrobiota teatud liikmeid ja vältida nende laienemise potentsiaalselt kahjulikke mõjusid. See tõstab esile Clec12a topeltfunktsiooni, mis võib pidurdada põletikku mikroobsete ligandide vastu, samas tuvastades ja kontrollides mikrobiota spetsiifilisi liikmeid. Seega esindab Clec12a ainulaadset viisi, mida kaasasündinud immuunsüsteem kasutab seedetrakti homöostaasi tagamiseks.

JOONISLEGENDID

Joonis 1. Clec12a pidurdab soolehaigusi, sõltumata adaptiivsest immuunsüsteemist

(A) Koliidi raskusastme hindamiseks töödeldi WT või Clec12a-/- C57BL/6 spetsiifilisi patogeenivabasid (SPF) hiiri 2,5% dekstraannaatriumsulfaadiga (DSS) ad libitum 7 päeva joogivees. Kaalukaotuse protsenti hinnati iga päev. Keskmine +/- SEM, andmed koondatakse kolmest sõltumatust katsest, kasutades kahesuunalist ANOVA-d ja Śídáki mitmekordset võrdlustesti.

(B) Näidatud loomade käärsoole pikkus (cm) mõõdeti surmamisel. Hajumisdiagramm on keskmine +/- SEM, andmed ühendatakse kolmest sõltumatust katsest, kasutades paaritu t-testi. Iga punkt tähistab ühte hiirt

(C) Näidatud loomade väljaheite lipokaliini-2 (ng/mL) sisaldus mõõdeti põletikunäiduna. Tulpdiagramm on keskmine +/- SEM, andmed on ühendatud kahest sõltumatust katsest, kasutades paarimata t-testi. Iga punkt tähistab ühte hiirt

(D) Tüüpilised H&E värvitud käärsoole lõigud näidatud loomadelt pärast DSS-indutseeritud koliiti.

(E) Näidatud loomade histoloogilised skoorid saadi käärsoolelõikudest

(D). Tulpdiagramm on keskmine +/- SEM, mida võrreldakse sidumata t-testi abil. Iga punkt tähistab ühte hiirt.

(F) Kroonilise koliidi hindamiseks viidi läbi koliidi T-rakkude ülekandemudel. TCRb-/- ja Clec12a-/-;TCRb-/- loomade kaalu mõõdeti kord nädalas. Graafik kujutab näidatud loomade kaalukaotuse protsenti kogu katse jooksul. Keskmine +/- SEM, võrreldes 2-viisi ANOVA-ga.

(G) Näidatud loomade (I) koloonia pikkust mõõdeti surmamisel. Tulpdiagramm on keskmine +/- SEM, mida võrreldakse sidumata t-testi abil. Iga punkt tähistab ühte hiirt.

(H) WT, Clec12a-/-, Rag-/- või Rag-/-; Clec12a-/- C57BL/6 SPF hiirtel hinnati ägeda koliidi suhtes. Näidatud loomadele anti 2,5% DSS-i ad libitum 7 päeva jooksul. Kaalukaotuse protsenti hinnati iga päev. Keskmine +/- SEM, andmed esindavad kahte sõltumatut katset. Kahesuunaline ANOVA ja Śídáki mitmekordne võrdlustest.

(I) Näidatud loomade käärsoole pikkus (cm) mõõdeti surmamisel. Tulpdiagramm on keskmine +/- SEM, andmed esindavad kahte sõltumatut katset, milles kasutati sidumata t-teste. Iga punkt tähistab ühte hiirt * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Joonis 2. Clec12a-/- loomadel moodustunud mikrobioota põhjustab koliidi süvenemist

A) Fekaalse mikrobiota siirdamine (FMT) viidi läbi, viies väljaheite supernatandid WT või Clec12a loomadelt iduvabadesse WT hiirtesse. Mikrobiootidel lasti neli nädalat homogeniseerida, pärast mida majutati pooled WTFMT hiirtest ja pooled Clec12a-/-FMT hiirtest ja lasti veel neli nädalat seguneda. Seejärel said kõik rühmad oma joogivees 2,5% DSS-i ad libitum ja nad ohverdati 7. päeval.

B) Näidatud loomade kaalukaotuse protsenti hinnati iga päev. Graafik kujutab keskmist +/- SEM-i, andmed on ühendatud kahest sõltumatust katsest, kasutades kahesuunalist ANOVA-d ja Śídáki mitmekordset võrdlustesti.

C) Näidatud loomade käärsoole pikkus (cm) mõõdeti surmamisel. Hajumisdiagramm on keskmine +/- SEM, mida võrreldakse tavalise ühesuunalise ANOVA ja Dunnetti mitme võrdluse testiga. Iga punkt tähistab ühte hiirt.

D) Näidatud loomade tüüpilised H&E värvitud käärsoole lõigud pärast FMT ja DSS-indutseeritud koliiti.

E) Histoloogilised skoorid saadi (D) käärsoolelõikudest. Tulpdiagramm on keskmine +/- SEM, mida võrreldakse sidumata t-testi abil. Iga punkt tähistab ühte hiirt.

F) Kaalutud Unifraci kaugused WTFMT, Clec12a-/- FMT või koos peetavate loomade 16S rRNA geenide sekveneerimisest. Kasti ja vurrude graafikud, mis näitavad kõiki punkte (paaripõhise kauguse võrdlus) ja võrreldakse Kruskal-Wallise testiga.

G) Kaalumata Unifraci kaugused WTFMT, Clec12a-/- FMT või koos peetavate loomade 16S rRNA geeni järjestamisest. Kasti ja vurrude graafikud, mis näitavad kõiki punkte (paaripõhise kauguse võrdlus) ja võrreldakse Kruskal-Wallise testiga.

H) Bray-Curtise kaugused WTFMT, Clec12a-/- FMT või koos peetavate loomade 16S rRNA geenide sekveneerimisest. Kasti ja vurrude graafikud, mis näitavad kõiki punkte (paaripõhise kauguse võrdlus) ja võrreldakse Kruskal-Wallise testiga.

Joonis 3: Clec12a-/- loomadel moodustunud mikrobiota koostis ei sõltu adaptiivsest immuunsusest

A) Skemaatiline diagramm, mis näitab luuüdi taastamist koos järgneva FMT-ga. C57Bl/6 WT hiired kiiritati surmavalt ja taastati kas WT või Clec12a-/- luuüdiga. 8 nädala pärast võeti neilt hiirtelt väljaheited ja viidi need WT mikroobivabadesse hiirtesse, nagu on selgitatud punktis (A). Seejärel lisati algselt taastatud kimäärsetele loomadele nende joogivees 2,5% DSS-i ad libitum.

B) FMT hiirte kaalukaotuse protsenti (F) hinnati iga päev. Keskmine +/- SEM, kasutades kahesuunalist ANOVA ja Tukey mitmekordset võrdlustesti.

C) Näidatud loomade käärsoole pikkus (cm) mõõdeti surmamisel. Hajumisdiagramm on keskmine +/- SEM, paaritu t-test. Iga punkt tähistab ühte hiirt

D) FMT-d, et hinnata adaptiivse immuunsüsteemi rolli mikroobide kujunemisel ja koliidi raskusastmel, viidi läbi fekaalsete supernatantide ülekandmisega Rag-/- või Rag-/-; Clec12a-/- SPF loomad WT iduvabadesse hiirtesse, nagu on kirjeldatud punktis (A). Hiiri töödeldi 2,5% DSS-iga 7 päeva. Kaalukaotuse protsenti hinnati iga päev. Graafik on keskmine +/- SEM, kasutades kahesuunalist ANOVA-d ja Tukey mitmekordset võrdlustesti.

E) (F) näidatud loomade käärsoole pikkus (cm) mõõdeti surmamisel. Keskmine +/-, SEM võrreldi tavalise ühesuunalise ANOVA ja Dunneti mitmekordse võrdlustesti abil. Iga punkt tähistab ühte hiirt. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Joonis 4. Clec12a piirab koliiti süvendava mikroobi Faecalibaculum näriliste levikut

A) WT või Clec12a-/- C57BL/6 SPF hiirtele anti antibiootikumi kokteili (A) (neomütsiin, gentamütsiin, ampitsilliin, erütromütsiin), tsefalotiini või gentamütsiini (B, C) kontsentratsioonis 0. 5 g/l neljateistkümne päeva jooksul. Seitsme päeva pärast anti loomadele kuni surmamiseni 2,5% DSS-i joogivees. Näidatud loomade käärsoole pikkus (cm) mõõdeti surmamisel. Hajumisdiagramm on keskmine +/- SEM, paaritu t-test. Iga punkt tähistab ühte hiirt.

B) Näidatud loomade kaalukaotuse protsenti hinnati iga päev. Graafik on keskmine +/- SEM, kasutades kahesuunalist ANOVA-d ja Tukey mitmekordset võrdlustesti

C) Näidatud loomade käärsoole pikkus (cm) mõõdetuna surmamisel. Hajumisdiagramm on keskmine +/- SEM, paaritu t-test. Iga punkt tähistab ühte hiirt.

D) WT või Clec12a-/- väljaheidete täheldatud tunnused, 16S rRNA järjestuse alfa mitmekesisus. Keskmine +/- SEM, võrreldes Mann-Whitney testiga.

E) Pielou ühtlus WT või Clec12a-/- väljaheidetest, 16S rRNA järjestuse alfa mitmekesisus. Keskmine +/- SEM, võrreldes Mann-Whitney testiga.

F) Shannoni entroopia keskmine +/- SEM, võrreldes Mann-Whitney testiga.

G) ANCOMi analüüs WT ja Clec12a-/- väljaheidetest. Taksonoomilised nimed on parimad ASV-de klassifikatsioonid, kasutades genoomi taksonoomia andmebaasi (GTDB).

H) Faecalibaculum rodentium ASV suhteline arvukus. Võrreldes Mann Whitney * p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

I) C57Bl/6 WT SPF hiiri töödeldi suukaudse sondiga kolm päeva 1x108 CFU F. rodentiumiga. Seejärel said loomad 7 päeva jooksul 2,5% DSS-i oma joogivees, jätkates samal ajal F. rodentium'i igapäevast sondimist. Kaalukaotuse protsenti hinnati iga päev. Keskmine +/- SEM, Andmed ühendatakse neljast erinevast katsest, kasutades kahesuunalist ANOVA-d ja Tukey mitmekordset võrdlustesti.

J) Näidatud loomade käärsoole pikkus (cm) mõõdeti surmamisel. Tulpdiagramm on keskmine +/- SEM. Andmed on ühendatud neljast erinevast katsest, mida võrreldi tavalise ühesuunalise ANOVA ja Dunnet'i mitme paranduse testiga. Iga punkt tähistab ühte hiirt. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Joonis 5. Clec12a piirab põletikku ja soodustab fagotsütoosi makrofaagides.

A) Immunofenotüpiseerimine viidi läbi voolutsütomeetria abil rakkudel, mis eraldati käärsoole lamina propriast (cLP) WT ja Clec12a-/- loomadel. Heatmap näitab Clec12a ekspressiooni sagedust kaasasündinud ja adaptiivsetel immuunrakkudel

B) Tulpdiagramm näitab väravaeelsete CD38+ rakkude (M1 makrofaagide) sagedust näidatud loomade cLP-st. Keskmine +/- SEM, võrreldud paaritu t-testiga. Iga punkt tähistab ühte hiirt.

C) Tulpdiagramm näitab väravaeelsete EGR2+ rakkude (M2 makrofaagide) sagedust näidatud loomade cLP-st. Keskmine +/- SEM, võrreldud paaritu t-testiga. Iga punkt tähistab ühte hiirt.

D) BMDM-id koguti WT ja Clec12a-/- pikkadest luudest ja kultiveeriti M-CSF (20 ng/ml) juuresolekul 7 päeva. 8. päeval pulseeriti BMDM-e 24 tunni jooksul LPS-iga (100 ng/ml), MDP-ga (10 mg/ml), Pam3cyskiga (1 mg/ml) või Flagelliiniga (1 mg/ml). Sööde koguti ja analüüsiti tsütokiinide tootmise suhtes. Soojuskaart näitab näidatud tsütokiinide Log2-kordset muutust Clec12a-/- võrreldes WT-ga.

E) WT ja Clec12a-/- hiirte BMDM-id isoleeriti ja kultiveeriti nagu punktis (A) ning seejärel kultiveeriti koos F. rodentiumiga MOI 10 juures 24 tundi. Pärast BMDM-de pesemist koguti RNA ja valmistati ette RNA sekveneerimiseks. 10 parimat lihtsustatud GO termini (bioloogiline protsess) kategooriat, mida on rikastatud Clec12a-/- allareguleeritud

F) Kõhukelme makrofaagid isoleeriti WT ja Clec12a-/- hiirtelt ning seejärel kultiveeriti fagotsütoosi hindamiseks Sybr roheliseks värvitud F. rodentium'iga. Vasakul: WT makrofaagid. Paremal: Clec12a-/- makrofaagid. Kujutatud on esinduslikud kujutised eredast väljast (vasakpoolsed veerud), fluorestsentsist (keskmised veerud) ja ühendatud (parempoolsed veerud). Kollased nooleotsad tähistavad makrofaagide poolt neelatud F. rodentiumi rakkude näiteid. skaala riba=20 µm. Pildid esindavad kahte erinevat katset.

G) Tulpdiagramm näitab organisme raku kohta, nagu on näha (F). F. rodentium'i koguse määramiseks raku kohta loendati 250 WT rakku ja 269 Clec12a-/- rakku.

Joonis 6: Clec12a seondub otseselt mikrobiota spetsiifiliste liikmetega.

A) Skemaatiline diagramm, mis kujutab Clec12a-inimese IgG1-Fc liitvalku või tühja vektorit (ainult Fc osa) B) Voolutsütomeetrilise analüüsi histogrammid, mis näitavad Clec12a-Fc erinevat seondumist erinevate bakterite või C. albicans'iga.

TÄIENDAVAD KUJUNDID

Täiendav joonis 1. Clec12a puudumine ei häiri kusihappe taset.

A) WT ja Clec12a-/- C57Bl/6 hiirte vahelise puriini metabolismi hindamiseks mõõdeti näidatud loomade seerumi kusihappesisaldust (uM). Hajumisdiagramm on keskmine +/- SEM, andmed ühendatakse kolmest sõltumatust katsest, kasutades paarimata t-testi. Iga punkt tähistab ühte hiirt.

B) Mõõdeti näidatud loomade kusihappe väljaheide (uM), et hinnata kusihappe eritumist soolestikust WT ja Clec12a-/- C57Bl/6 hiirte vahel. Hajumisdiagramm on keskmine +/- SEM, andmed ühendatakse kolmest sõltumatust katsest, kasutades paarimata t-testi. Iga punkt tähistab ühte hiirt.

Täiendav joonis 2. WT ja Clec12a-/- mikrobiotid põhjustavad diferentsiaalhaigusi

Neomütsiinist, gentamütsiinist, ampitsilliinist ja erütromütsiinist koosneva antibiootikumi kokteiliga ravitud WT ja Clec12a-/- loomade kaalulangus protsentides.

Täiendav joonis 3. Mikrobioota koostist mõjutab Clec12a.

A) Esimese 3 telje PCoA graafikud, mis põhinevad Bray-Curtise vahemaadel, mis näitavad üldisi mikrobiota suhteid ning vastavad kasti ja vurrude graafikud, mis kvantifitseerivad erinevusi igas rühmas ja võrreldakse Mann-Whitney testiga.

B) PCoA graafikud, mis põhinevad kaalutud Unifraci vahemaadel ja vastavatel kasti- ja vurrugraafikutel, mis kvantifitseerivad rühmasisest erinevust, võrreldes paaritu Mann-Whitney testiga.

C) Tabel, mis näitab PERMANOVA testi tulemusi WT vs. Clec12a-/- fekaalse mikrobiota kohta koos Bray-Curtisega ja kaalutud Unifrac vahemaad.

Täiendav joonis 4: Clec12a makrofaagides piirab põletikku.

A) Viiuli graafikud kujutavad immuunrakkude geomeetrilist keskmist fluorestsentsi intensiivsust (MFI), mis on näidatud (A). Keskmine +/- SEM, Kruskal-Wallise test Dunni parandusega mitme võrdluse jaoks. Tähed tähistavad rühmi, mis on oluliselt erinevad.

B) M1 ja M2 makrofaagide tüüpilised voolutsütomeetria diagrammid WT või Clec12a-/- hiirte cLP-st pärast DSS koliiti. Rakud on eelseadistatud reaalajas, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ ja CD64+ puhul. Jooniselt 5A

Täiendav joonis 5. Clec12a stabiliseerib rakutsükli kontrolli ja reguleerib fagotsütoosi makrofaagides.

A) Kümme parimat lihtsustatud GO termini (bioloogiline protsess) kategooriat, mis on rikastatud Clec12a-/- ülesreguleeritud geenide seas, võrreldes WT-ga vastusena F. rodentium'ile. F. rodentiumiga koos kultiveeritud WT ja Clec12a-/- hiirte BMDM-id isoleeriti ja analüüsiti nagu joonisel 7A.

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >Loendati 200 makrofaagi. Tulpdiagramm näitab F. rodentiumi keskmist arvu neljast üksikust süvendist, et näidata loenduse ja mõju järjepidevust süvendite lõikes. Keskmist +/- SEM-i võrreldi sidumata t-testiga.

TUNNUSTUS

Soovime tänada Gordon Browni selle projekti jaoks Clec12a-/- loomade pakkumise eest. Seda tööd toetasid Helen Hay Whitney fond (KSO), Utahi ülikooli NRSA mikroobide patogeneesi T32 koolitustoetus (KSO), CCFA vanemuuringute auhind (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 ja NCCAM R01124317 ja NCCAM R01AT01LR4221AT01LR. Jr. Foundation (JLR), NSF CAREER auhind (IOS-1253278) (JLR), Packardi stipendium teaduse ja tehnika alal (JLR), Burroughsi patogeneesi auhind (JLR), Ameerika astmafond (JLR), Margolis Foundation (JLR), MS Society Centeri stipendium (JLR) ja WM Keck Foundationi (JLR) NIH New Innovator Award DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), American Cancer Society Research Grant (RMO), Kimmeli stipendiaadi auhind (RMO), R01AG047956 (RMO) ja NIAID R01AI141202 (ASI). Seda tööd toetas lisaks riiklikule vähiinstituudile auhinnanumbriga 5P30CA042014-24 ka Utahi ülikooli voolutsütomeetriakeskus. Täname Utah’ ülikooli kõrgjõudlusega andmetöötluse keskuse toetust ja ressursse.

AUTORI KAASALAD

TRC aitas uuringut ette kujutada, tegi enamiku hiire- ja immunoloogiakatsetest, pani andmed kokku joonisteks ja aitas kirjutada käsikirja. RB korraldas mikroobivabad katsed ja säilitas kõik mikroobivabad loomad. ESV aitas läbi viia immunoloogia soolestiku lamina propria katseid. KSO aitas hiirte korjamisel ning andis ülevaate ja suuna. KMB aitas hiire kogumise ja voolutsütomeetriaga. MCN aitas hiirte korjamisel. WV pakkus abi liitvalgu konstruktsiooni ehitamisel ja puhastamisel. TJ andis abi fagotsütoosi analüüsides. JH analüüsis fagotsütoosi mikroskoopia slaide. MH pakkus abi liitvalgu puhastamisel ja kasutamisel. KAK pakub bakterite isolaate. ROC andis immunoloogiaalased teadmised ja ülevaate. WZS aitas välja töötada bioinformaatilisi analüüse, aitas koostada jooniseid ja statistikat ning aitas kirjutada käsikirja. JLR aitas uuringut välja mõelda ja juhtida, jälgida eksperimentaalset ülesehitust ja tulemusi, organiseeris kaastöötajaid ja reaktiive, kogus uuringu jaoks rahalisi vahendeid ja aitas kirjutada käsikirja.

MEETODID

Hiire tüved

Kõik siin kasutatud hiireliinid olid C57BL/6 taustal. Clec12a-/- hiired pakkus lahkelt Gordon Brown (Medical Research Council Center for Medical Mycology, University of Exeter) ja neil oli genotüüp vastavalt nende eelnevalt kirjeldatud protokollile (Redelinghuys et al. 2016). Rag2-/- ja TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) saadi firmast Jackson Laboratories ja neid hoiti meie hiirekoloonias mitu põlvkonda. Kõigis in vivo koliidikatsetes kasutati 8- kuni 12-nädala vanuseid sobiva sooga hiiri. Kasutati nii isaseid kui emaseid hiiri. Hiiri hoiti spetsiifilistes patogeenivabades tingimustes.

Bakterite ja seente tüved

Järgmised organismid saadi firmast DSMZ-German Collection of Microorganism and Cell Cultures GmbH: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM# 26127); Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM# 26074). Bacteroides uniformis saadi Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist (ATCC® 8492™). Roseburia sp (tüve tähistus JLR.KK002) isoleeriti Schaedleri agaril C57BL/6 hiirtelt, kellel oli eosmoodustajaga rikastatud mikrobioot. Eoste moodustamise rikastamine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud ja hiiri hoiti selle mikrobiotaga mitu põlvkonda meie gnotobiootilises rajatises, enne kui JLR.KK002 eraldati väljaheitest (Browne et al., 2016). Me PCR-amplifitseerisime ja Sanger sekveneerisime 16S rRNA geeni ning seejärel klassifitseerisime selle teenuse SILVA ACT ja SILVA andmebaasiga (Pruesse et al., 2012). Kasutati Salmonella typhimurimum ST2 tüve. Kasutati Candida albicansi tüve sc5314. PhyLo11b sünteetilises kogukonnas kasutatavaid bakteritüvesid kirjeldatakse allpool.

DSS-indutseeritud eksperimentaalne koliit

Koliit kutsuti esile 2,5% või 3% (w/v) 36,000-50,000MW dekstraannaatriumsulfaadi (DSS) (MP Biomedicals) lisamisega joogivette 7 päeva jooksul. Koliidi raskust jälgiti iga päev kehakaalu, väljaheite konsistentsi ja väljaheite vere muutuste kaudu. Monotsüütide päästmise katse jaoks said kõik hiired 5 päeva jooksul 2,5% DSS-i, seejärel anti tavalist vett; kaalu jälgimine jätkus kuni 10. päevani, mil loomad koguti. Raskusläveks kehtestati üle 20% kaalukaotuse raskuspiirid. Eksperimentaalsetes lõpp-punktides eemaldati MLN-id ja käärsool. Käärsoole pikkuse määramiseks mõõdeti umbsoolest pärasooleni. Seejärel töödeldi kudesid histoloogia, RNA ekstraheerimise või voolutsütomeetrilise analüüsi jaoks.

Käärsoole histoloogia ja punktiarvestus

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

Lipokaliini-2 (LCN-2) ELISA

Protokoll viidi läbi vastavalt tootja protokollile (Fischer Scientific DY1857-05). Lühidalt, väljaheited koguti, kaaluti ja püreestati 1X HBSS-is kontsentratsiooniga 100 mg/ml. Seejärel tsentrifuugiti proove 50 x g juures 5 minutit, et eemaldada suur praht. Seejärel eemaldati supernatant ja asetati uude katsutisse ning tsentrifuugiti 8000 xg juures 5 minutit, et bakterid pelleteerida. Seejärel lahjendati supernatanti vastavalt loomade haigusele, kuid üldiselt oli see 1:100- 500 (terve) kuni 1:500-1000 (DSS-iga töödeldud). Kusihappe mõõtmine Kusihappe kontsentratsioon viidi läbi vastavalt tootja juhistele (Invitrogen™ Amplex™ Red Uric/Uricase aktiivsuse analüüsi komplekt, kat nr A22181). Lühidalt, WT või Clec12a-/- hiirtelt koguti verd südame punktsiooniga kullaga kaetud seerumieraldustorudesse. Katseklaasidel lasti 30 minutit hüübida ja seejärel tsentrifuugiti 1300 xg juures 10 minutit. Seerum eemaldati ja pandi 1,5 ml Eppendorfi tuubidesse, kiirkülmutati ja säilitati kuni testimiseni temperatuuril -80 Celsiuse järgi. Kusihappe väljaheite määramiseks saadi WT ja Clec12-/- hiirtelt värsked fekaaligraanulid. Pelletid kaaluti ja registreeriti ning seejärel purustati 1 ml 1x reaktsioonipuhvris. Pärast füüsilist muljumist tsentrifuugiti torusid 50 x g juures 5 minutit, et eemaldada suur praht. Ülejäänud väljaheite lägas analüüsiti kusihappe sisaldust.

T-rakkude ülekande eksperimentaalne koliit

WT põrnad eraldati ja purustati RPMI-s, mis sisaldas 10% veise loote seerumit, penitsilliini ja streptomütsiini. Rakud tsentrifuugiti 367 xg juures, et eraldada rakud. Saadud pellet suspendeeriti seejärel 1x RBC lüüsipuhvris 5 minutiks pimedas toatemperatuuril. Saadud valged verelibled lasti seejärel läbi Miltenyi CD4+ MACS kolonni, et eraldada CD4+ T-rakud. Seejärel värviti T-rakud CD4 ja CDRB-ga ning sorteeriti FACS Aria Fusion (BD Biosciences) abil. CD4+ CDRBhi rakud koguti ja manustati TCRb-/- või TCRb-/-; Clec12a-/- hiired intraperitoneaalselt (IP). Iga hiir sai 5 x 105 rakku. Koliidi raskust ja arengut jälgiti igal nädalal, hinnates kaalulangust. Katse lõpp-punktis eemaldati MLN-id ja käärsooled ning haiguse tõsiduse hindamiseks mõõdeti käärsoole umbsoolest pärasooleni.

Leukotsüütide eraldamine käärsoole lamina propriast

Hiire käärsooled koos kinnitunud umbsoolega koguti ja asetati 1X PBS-i 6-süvendiga plaatidele jääle. Kõik nähtavalt järelejäänud rasv- ja sidekude eemaldati ning jämesoolest lõigati ära pimesool. Käärsooled lõigati lahti ning lima ja väljaheited eemaldati hoolikalt käärsoolest, enne kui need asetati tagasi 6-süvendiga plaadile. Kui kõik käärsooled olid hajutatud ja kraabitud, lõigati iga käärsool habemenuga Petri tassi kaanel kuubikuteks ja pandi eraldi 50 ml katsutisse. Lisati 10 ml eelsoojendatud dissotsiatsioonilahust (1X HBSS ilma Ca+ ja Mg+, 1,5 mM DTT, 10 mM HEPES ja 30 mM EDTA) ja tuube keerutati korraks keerisega. Käärsoole inkubeeriti umbes 25 minutit. 37 kraadi juures loksutades kiirusel 150 p/min, kuni lahused muutusid IEC eraldamisest häguseks. Proove loksutati 3x ja segati vorteksiga 15 sekundit, seejärel valati 100 mM filtrile 50 ml koonilisele alusele, et eemaldada mitteimmuunsed rakud, näiteks IEC-d, ja filtreid loputati korraks 2 ml jääkülma 1X PBS-ga. Ülejäänud kude koguti tangidega filtrile ja viidi uude 50 ml koonilisse. 15 ml eelsoojendatud seedimislahust (1X HBSS Ca+ ja Mg-ga, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, kat nr 4942078001], 0,5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical, kat # LS002139] ja lisati 0,5 mg/ml kollagenaas D [Millipore-Sigma, kat. nr 11088866001]), proove segati korraks vorteksiga ja seejärel inkubeeriti 45 minutit. 37 kraadi juures loksutades kiirusel 150 p/min või kuni lahus muutub häguseks. Seejärel loksutati proove 3x ja segati vorteksiga 15 sekundit. Ülejäänud immuun-cLP-rakkude kogumiseks valati lagundatud kude seejärel 40 mM filtrisse 50 ml koonilisele torule, mis sisaldas 10 ml 1X PBS-i. Seejärel loputatakse proove ja filtreeritakse 2 ml jääkülma 1X PBS-ga ning tsentrifuugitakse 800 x g juures 10 minutit 4 kraadi juures. Järgmisena eemaldati supernatant ja visati vaakumiga minema. Seejärel resuspendeeriti rakud 500 ml täielikus RPMI-s ja loendati trüpaansinise välistusvärvimisega.

Voolutsütomeetria

cLP-st eraldatud leukotsüüdid värviti elujõulisuse tagamiseks zombie värviga 510 (AmCyan) 10 minutit toatemperatuuril pimedas. Seejärel blokeeriti proovid Fc-retseptor CD-16/32-ga 20 minutiks pimedas 4 kraadi juures. Pärast 5-minutilist pöörlemist 367 xg juures värviti dekanteeritud rakke 30 minutit pimedas 4 kraadi juures. Kõiki antikehi kasutati lahjenduses 1:250, kui pole märgitud teisiti. Myleloid paneel koosnes CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (rakusisene, 1:50). T-rakke eristati: Zombie dye 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (rakusisene 1:50), IL{{ 50}}PE (rakusisene 1:50), IFN-g (BV605) (rakusisene 1:50), RORgt-PE610 (rakusisene 1:50), IL-17A-BV785 (rakusisene 1:50). Pärast värvimist pesti rakke 2 korda 5 minutit kolonnipuhvriga (1X HBSS ilma Ca2+, Mg2+ ja HEPES, EDTA, FBS). Rakud fikseeriti O/N 2% PFA-ga, kui rakusisest värvimist polnud vaja, ja pesti seejärel 2x kolonnipuhvris enne voolutsütomeetril töötamist. Kui rakusisene värvimine oli vajalik, järgiti FoxP3 / transkriptsioonifaktori värvimispuhvri komplekti (Tonbo Biosciences) ja protokolli. Seejärel resuspendeeriti kõik proovid 300 ul kolonni puhvris ja töödeldi BD LSR Fortessaga pärast kompenseerimist UltraComp eBeadsiga (ThermoFisher Scientific) ja üksikute plekkide kontrollide kasutamist.

IgA-d värvivad bakterid

Bakterid eraldati fekaaligraanulitest, purustades need HBSS-i koos Ca2+ ja Mg2+-ga, kontsentratsiooniga 100 mg väljaheiteid ml HBSS-i kohta. Seejärel tsentrifuugiti suure prahi eemaldamiseks püreestatud väljaheiteid 50 x g juures 5 minutit. Supernatant eemaldati ja asetati uude katsutisse. Seejärel tsentrifuugiti seda 8000 xg juures 5 minutit bakterite pelleteerimiseks. Supernatant eemaldati ja pelleteid pesti HBSS-s, mis sisaldas Ca2+ ja Mg{8}}. Lõpuks suspendeeriti pelletid uuesti HBSS-is kontsentratsiooniga 100 mg/ml ja 10 uL sellest asetati 96-süvendiga plaadile ja blokeeriti HBSS-iga, mis sisaldas Ca2+ ja Mg{13}}. 10% FBS 20 minutit toatemperatuuril. Seejärel lisati otse proovile 100 uL anti-IgA (PE) ja inkubeeriti 30 minutit 4 °C juures pimedas. Seejärel pesti rakke 2 korda HBSS+FBS lahuses ja viimasena resuspendeeriti HBSS+1x Sybr®-rohelises ja inkubeeriti 20 minutit pimedas toatemperatuuril. Seejärel loeti proove otse voolutsütomeetril.

Luuüdi isoleerimine

Luuüdi isoleeriti, nagu eelnevalt kirjeldatud. Lühidalt, C57Bl/6 metsiktüüpi või Clec12a-/- loomade pikad luud ekstraheeriti ja puhastati õrnalt hõõrudes paberrätikuga. Loomade töötlemise ajal hoiti puhtaid luid jääl. Luude otsad olid luuüdi paljastamiseks veidi kärbitud. Luu sisestati (avatud ots allapoole) 0,5 ml Eppendorfi tuubi, mis oli läbistatud 18 g nõelaga. See 0,5 ml Eppendorfi katsuti asetati seejärel 1,5 ml Eppendorfi katsutisse ja tsentrifuugiti kiirusel 13,000 x g 1 minut. Seejärel tsentrifuugiti läbi luuüdi RBC-lüüsiti, kasutades RBC-lüüsipuhvrit (Biolegend) vastavalt tootja soovitustele. Pärast punaste vereliblede lüüsimist resuspendeeriti rakud täielikus Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmes (DMEM), mis sisaldas: 10% FBS, 1 mg/ml Pen/Strep, HEPES 10 mM, 1 x mitteessentsiaalne aminohape, naatriumpüruvaat 1 mM. Seejärel tsentrifuugiti rakke 367 xg juures viis minutit rakkude pelleteerimiseks. Seejärel kasutati eraldatud rakke BMDM-ide arendamiseks või monotsüütide edasiseks isoleerimiseks.

Luuüdist pärinevad makrofaagid

Leukotsüüdid eraldati luuüdi isoleerimisest, suspendeeriti täielikus DMEM-is ja loendati hemotsütomeetril trüpaansinise välistusvärvimisega. Rakud plaaditi koekultuuriga töödeldud 10 cm tassidele kontsentratsiooniga 5-8 x 106 rakku/plaat 10 ml täissöötmes + M-CSF (20 ng/ml). Värske sööde, sealhulgas M-CSF, lisati olemasolevale söötmele 4. ja 7. päeval. Täielikult diferentseeritud BMDM-e kasutati katseliseks kasutamiseks vahemikus 7-9.

Monotsüütide eraldamine

Luuüdi koguti WT ja Clec12a-/- loomadelt, nagu eelnevalt kirjeldatud. Monotsüüdid isoleeriti Monocyte Isolation Kit (BM), hiire (Miltenyi Biotec) ja LS MACS kolonniga vastavalt tootja juhistele.

F. rodentium BMDM ühiskultuur ja RNAseq

F. rodentiumi kultuurid kvantifitseeriti OD 600 nm järgi (kasutades 1 OD 600 nm=1 x 10^8 rakku/ml), pesti 2 korda steriilses PBS-is ja koos kultiveeriti 1 x 106 rakku/ml täielikult diferentseerunud BMDM-ga. MOI 10 6-kaevu koekultuuriplaatidel. Pärast 24-tunnist kooskultuuri söödet koguti ja säilitati kuni edasise kasutamiseni temperatuuril -20 C. BMDM-e pesti külma, steriilse PBS-ga 2 korda. Seejärel lisati otse igasse süvendisse Qiazol (Qiagen cat# 79306) RNA-d stabiliseeriv reaktiiv. Süvendid kaabiti rakukaabitsaga, koguti 1,5 Eppendorfi tuubi ja külmutati -20 kraadi juures kuni RNA ekstraheerimiseni. RNA ekstraheerimine viidi läbi, kasutades Direct-zol RNA minipreparaadi komplekti (Zymo Research kat # R2070) vastavalt tootja juhistele ja Huntsman Cancer Institute suure läbilaskevõimega genoomika tuumarajatis valmistas sekveneerimisraamatukogud. Kogu RNA hübridiseeriti esmalt NEBNext rRNA Depletion komplektiga v2 (NEB, cat# E7400), et vähendada proovide rRNA-d. Stranded RNA sekveneerimisraamatukogud valmistati, kasutades NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, kat # E7760L). Puhastatud raamatukogud kvalifitseeriti Agilent Technologies 4150 TapeStationiga, kasutades D1000 ScreenTape testi (Agilent, cat# 5067-5582 ja 5067-5583). Adapteriga modifitseeritud molekulide molaarsus määrati kvantitatiivse PCR abil, kasutades Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit (Roche, kat nr 07960140001). Individuaalsed raamatukogud normaliseeriti Illumina järjestuse analüüsiks valmistudes väärtuseni 5 nM ja sekveneeriti NovaSeq 6000 abil paarisotsa 150-tsüklilise sekveneerimisega.

Tsütokiinide analüüs

BMDM eraldati ja kasvatati nagu eelnevalt kirjeldatud. Täielikult diferentseerunud BMDM-id plaaditi 12-süvendiga koekultuuriplaatidele tihedusega 1 x 105 rakku süvendi kohta. BMDM-e stimuleeriti 100 ng/ml LPS-ga; 1 ug/ml Pam3Cysk; või 1 ug/ml flagelliini. Rakke stimuleeriti 24 tundi, sööde koguti ja salvestati analüüsimiseks temperatuuril -20 C. Tsütokiine analüüsiti LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, kat. nr 740150) abil. Andmeid analüüsiti andmeanalüüsi tarkvara LEGENDplex™ abil.

16s rRNA geenide sekveneerimine

Väljaheite graanulid või niudesoole sisu koguti üksikutelt hiirtelt ja külmutati kohe {{0}} kraadi juures 2 ml keeratava korgiga tuubides, mis sisaldasid 250 mg 0,15 mm granaathelmeid (MoBio, cat# {{5). }}). DNA ekstraheeriti Power Fecal DNA isolatsioonikomplekti (MoBio või QIAGEN) abil vastavalt komplekti juhistele ja see sisaldas 2 tsüklit 1-minutilist helmeste peksmist 4 kraadi juures seadmel Mini-Bead-Beater 16 (BioSpec Products). 16S rRNA geeni V3 ja V4 piirkondi amplifitseeriti ühe PCR vooruga, kasutades praimereid, mis sisaldasid (kirjeldatud 3' kuni 5') V3/4 piirkonna 16S rRNA geeni sihtjärjestust, millele järgnes 2-nukleotiidpadja. Illumina praimeri järjestuste, 8- nukleotiidse indeksi järjestuse ja ülejäänud Illumina adapterjärjestuse järgi. V3/4 16S-sihtivad järjestused võeti Takahashilt (Takahashi et al., 2014) ja indeksid Kozichilt (Kozich et al., 2013). Kasutatud täielikud oligonukleotiidjärjestused olid (indeksid tähistatud X-dega): Prok16SV34_Selle jaoks: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Rev: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. PCR tsükli tingimused olid järgmised: 98 kraadi esialgne denatureerimine 2 minutit; 26 tsüklit 20 sekundit 98-kraadist denaturatsiooni, 20 sekundit 51,5-kraadist lõõmutamist, 20 sekundit 72-kraadist pikendamist; ja üks lõplik 72-kraadine pikendus 2 minutiks. Iga PCR (sooritati iga proovi jaoks kolmes korduses) viidi läbi 25 ul mahus, kasutades Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, kat. nr M0492L), 5 pmol iga praimerit ja 50 ng matriitsi DNA-d. Pärast amplifikatsiooni ühendati igast proovist kolm PCR-i, 5 ul töödeldi amplifikatsiooni kinnitamiseks agaroosgeeliga ja ülejäänud maht puhastati Axygen AxyPrep MAG PCR puhastushelmestega (Corning, cat# MAG-PCR-CL{53). }}) lahjendati vees 62,5%-ni, et eemaldada tõhusalt kõik eelistatult sekveneeritavad praimeri dimeerid. PCR reaktsioonidele lisati lahjendatud helmed 1,8-kordses mahus, puhastati vastavalt tootja juhistele ja puhastatud amplikonid elueeriti 25 ul 10 mM Tris-Cl-ga, pH 8,0. Seejärel kvantifitseeriti amplikonid pico-rohelise dsDNA testiga (ThermoFisher, kass nr P11495) mikroplaadilugejal ning seejärel puhastatud ja indekseeritud individuaalsed sekveneerimisraamatukogud multipleksiti ühtlaselt (ng DNA abil) ja sekveneeriti Illumina MiSeq instrumendil paarisotsas. 300 tsükli režiim Huntsmani vähiinstituudi suure läbilaskevõimega genoomika jagatud ressursside rajatises.

Järjestuste andmete bioinformaatika töötlemine

16S rRNA geeni töötlemata lugemised demultipleksiti, võimaldades 0 mittevastavust indeksites, seejärel töödeldi ja analüüsiti QIIME2 raamistikus (Bolyen et al., 2019), nagu oleme eelnevalt kirjeldanud (Stephens et al., 2021). Lühidalt, demultipleksitud ja kvaliteetselt filtreeritud järjestused kärbiti esmalt praimeri- ja linkerijärjestustest Cutadapti pistikprogrammiga, seejärel denoiseeriti DADA2-ga (Callahan et al., 2016; Martin, 2011). Seejärel määrati taksonoomiad ASV-dele Classifysklearn meetodiga funktsioonide klassifikaatori pistikprogrammis, võrreldes GTDB viitekomplektiga (release89), mis oli kärbitud võimendatud V3/4 piirkonnale ja koolitati fit-classifier-naive-bayes meetodiga (Bokulich et al. , 2018; Parks et al., 2018; Pedregosa jt, 2011). Permanova järgi beeta mitmekesisuse rühmituste mitmekesisuse mõõdikud, kaugused ja statistiline olulisus arvutati QIIME2 raames (Anderson, 2001).

BMDM-ide RNA-järjestuse puhul määrati toornäidud esmalt kvaliteetseks ja kärpiti adapteriga, kasutades rohkelt trimmimist, seejärel kvantifitseeriti transkriptide arvud, kasutades Salmoni koostu GRCm38 transkriptoomiga (mm10) (Patro et al., 2{{). 16}}17). Transkripti taseme kvantifitseerimised loeti ajapaketi abil R-i ja summeeriti geenitasemete loendusteni enne diferentsiaalse ekspressiooni analüüsi DESeq2-ga, kasutades kujundusvalemit "~ genotüüp + ravi + genotüüp: ravi" (Love et al., 2014; Love et al., 2020). Erinevad vastused F. rodentiumile esindasid erinevust iga genotüübi vastuse vahel elusa F. rodentium'i ravile võrreldes vehiikuliga töödeldud rakkudega. Oluliselt erinevalt ekspresseeritud geenideks loeti geenid, mille korrigeeritud p-väärtus oli < 0,05 ja log2-kordne muutus > |0,58| (1,5-kordne muutus). Seejärel kasutati oluliselt alla- ja ülesreguleeritud geeniloendeid geeniontoloogia (GO) terminite rikastamise testimiseks, kasutades paketti clusterProfiler, mis sisaldas lihtsustamisfunktsiooni GO termini liiasuse vähendamiseks ja peamiste bioloogiliste protsesside tuvastamiseks (S, 2020; Wu et al. ., 2021).

F. rodentium DSS väljakutse

F. rodentiumit kasvatati nagu eelnevalt kirjeldatud ja kvantifitseeriti 1 x 109 CFU/mL steriilses PBS-is. F. rodentium fikseeriti, pestes esmalt 2 korda steriilses PBS-is ja seejärel resuspendeerides 10 minutit 1 ml 10% Fomalin-PBS-is. Seejärel pesti rakke veel kaks korda 10 ml steriilses PBS-is, et valmistuda oraalseks sondiks. Fikseerimata rakke pesti nagu fikseeritud rakke ja hoiti jääl kuni sondini. WT C57BL/6 SPF hiired määrati suu kaudu 100 uL lahusega, mis sisaldas kas ainult PBS-i (vehiikul), F. rodentiumit (elus) või F. rodentiumit (fikseeritud) päevadel -3 kuni 10. Loomadele anti 3,0% DSS päevadel 0-7; värsket DSS vett vahetati ülepäeviti. Raskusläveks kehtestati üle 20% kaalukaotuse raskuspiirid. Eksperimentaalsetes lõpp-punktides eemaldati MLN-id ja käärsool. Käärsoole pikkuse määramiseks mõõdeti umbsoolest pärasooleni. Seejärel töödeldi kudesid histoloogia, RNA ekstraheerimise või voolutsütomeetrilise analüüsi jaoks.

Fagotsütoosi analüüs

Peritoneaalsed makrofaagid eraldati, süstides kõhuõõnde 5 ml steriilset PBS-i. PBS-i loksutati õõnsuses olles õrnalt iga paari sekundi järel. 2 minuti pärast eemaldati PBS 28 G nõela abil ja jaotati külma täielikku DMEM-i. Rakke tsentrifuugiti 367 xg juures ja pesti täissöötmes. Seejärel loendati rakud hemotsütomeetriga ja plaaditi 12-süvendiga koekultuuriplaatidele kontsentratsiooniga 2,5 x 105 rakku/ml. Rakkudel lasti üleöö kleepuda. Järgmisel päeval segati kaevu õrnalt keerutades ja sööde aspireeriti. Adherentseid rakke pesti seejärel kaks korda 500 ui külma, steriilse PBS-ga. Seejärel lisati adherentidele (makrofaagidele) eelsoojendatud täielik DMEM, mis sisaldas F. rodentiumit MOI-ga 10. Seejärel tsentrifuugiti plaate õrnalt 200 x g juures toatemperatuuril kolm minutit ja seejärel inkubeeriti standardsetes rakukultuuri tingimustes (37 °C, 5% CO2) 90 minutit. F. rodentium valmistati nii, nagu on kirjeldatud ainult RNA sekveneerimiseks mõeldud BMDM-de kaaskultuuri puhul, pärast pesemist resuspendeeriti rakud 20 minutiks toatemperatuuril 1x Sybr® rohelises (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Seejärel bakterirakud sadestati kiirusel 4000 p/min 5 minutit, resuspendeeriti täieliku DMEM-iga ja eelsoojendati peritoneaalsete makrofaagide jaoks. Pärast 90-minutilist kooskultuuri aspireeriti sööde ja rakke pesti kaks korda külma, steriilse PBS-ga. Sybr® roheliseks värvitud F. rodentiumit sisaldavad kleepuvad rakud fikseeriti 2% paraformaldehüüdiga (PFA) 10 minutit. PFA aspireeriti ja rakkudele pandi steriilne PBS. Seejärel pildistati rakud F. rodentiumi fagotsütoosi suhtes

Makrofaagide kujutise analüüs

F. rodentiumiga töödeldud makrofaagikultuuride erevälja- ja fluorestsentskujutised tehti EVOS m7000 Imaging Systemiga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Iga kultuuri kohta tehti kolm kuni viis erinevat randomiseeritud pilti, mis viidi läbi kolmes eksemplaris.

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

CLEC12A-Fc sulandvalgu konstrueerimine and puhastaminepeal

Hiire Clec12a ekstratsellulaarseid domeene kodeerivad cDNA-d amplifitseeriti PCR-iga C57Bl/6 WT SPF luuüdist eraldatud valgetest verelibledest ja kinnitati sekveneerimisega. cDNA-d liideti inimese IgG1-Fc C-otsaga ekspressioonivektoris pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen). Clec12a või tühja vektorit sisaldavad konstruktid transfekteeriti Lx293 rakkudesse, mida kultiveeriti DMEM +10% FBS ja Pen/strep (1 mg/ml). Sekreteeritud sulandvalgud koguti söötmest 24-48 pärast transfektsiooni. Söödet tsentrifuugiti 367 xg juures 5 minutit, et eemaldada praht/surnud rakud, ja supernatant külmutati kuni kasutamiseni temperatuuril -20 C. Clec12a-Fc või ainult Fc sulandvalgud eraldati Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP komplektiga (Thermo Fisher Scientific, katalooginumber: 88804), kvantifitseeriti Pierce™ BCA valguanalüüsi komplektiga (Thermo Fisher Scientific katalooginumber: 23227). ja kinnitati Western blot'iga, kasutades antiClec12a antikeha (Novus Biologicals NBP2-27346SS).

Clec12a-Fc seondumise test

Puhastatud konstruktsioonid lahjendati kuni 0,4 mg/ml HBSS-is koos Ca2+ ja Mg{3}}-ga. Baktereid kasvatati vastavates söötmetes ja aeroobsetes tingimustes ning normaliseeriti OD 600 nm järgi. Baktereid pesti HBSS-ga, milles oli Ca2+ ja Mg{6}}, ning blokeeriti HBSS-iga, mis sisaldas Ca2+ ja Mg{8}}% FBS-i, 20 minutit toatemperatuuril. Kõik värvimisprotseduurid toimusid atmosfääritingimustes. 1 x 107 bakterirakku asetati ümara põhjaga 96-süvendiga plaadile, tsentrifuugiti 3,000 xg ja dekanteeriti. 50 uL konstrukte asetati bakterirakkudele, segati õrnalt ja inkubeeriti 4 °C juures 1 tund. Bakterirakke pesti HBSS-ga, mis sisaldas Ca2+ ja Mg2+ + 10% FBS-i, 2x. Rakkudele lisati 50 uL kitse inimesevastast Fc-d (PE) (ebioscience Catalog # 12-4998-82) ja inkubeeriti 4 °C juures 1 tund pimedas. Seejärel pesti rakke nagu varem ja pandi HBSS-i koos Ca2+ ja Mg2+-ga, mis sisaldas 1x Sybr® rohelist (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Rakke inkubeeriti toatemperatuuril 20 minutit pimedas ja loeti kohe BD LSR Fortessa voolutsütomeetriga.

Kiiritus ja luuüdi taastamine

Luuüdi koguti WT ja Clec12a-/- loomadelt, nagu eelnevalt kirjeldatud. Retsipienthiired kiiritati surmavalt 500 Radiga päeval -1, millele järgnes päeval 0 400 Radi. Neli tundi pärast viimast kiiritamist viidi retsipienthiired isofluraaninesteesi alla ja 100 uL eraldati Steriilses PBS-is (1 x 108 rakku/ml) suspendeeritud luuüdi rakud viidi läbi 28,5 G nõela retroorbitaalsesse ruumi. Meid huvitas mikrobiota, seega ei pandud loomi antibiootikumidele ja 8 nädala pärast koguti väljaheitegraanulid mikrobiota ülekandmiseks GF-loomadele.

VIITED

Anderson, MJ (2001). Uus meetod mitteparameetriliseks mitmemõõtmeliseks dispersioonanalüüsiks. Austral Ecol. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.{6}}.2001.01070.pp.x.

Begun, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ jt. (2015). Crohni tõve riskivariandi integreeritud genoomika

tuvastab CLEC12A rolli antibakteriaalses autofagias. Lahtri rep. 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.

Blader, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF ja Artis, D. (2017). Põletiku reguleerimine mikrobiota interaktsioonide kaudu peremeesorganismiga. Nat. Immunol. 18, 851-860. 10.1038/ni.3780.

Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA ja Caporaso, JG (2018). Markergeeni amplikonjärjestuste taksonoomilise klassifikatsiooni optimeerimine QIIME 2 ''sq2-funktsiooni klassifikaatori pistikprogrammiga. Mikrobioom 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Alexander, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F. jt. (2019). Reprodutseeritav, interaktiivne, skaleeritav ja laiendatav mikrobioomiandmete teadus, kasutades QIIME 2. Nat. Biotehnoloogia. 37, 852-857. 10,1038/s41587-019-0209-9.

Brown, GD, Willment, JA ja Whitehead, L. (2018). C-tüüpi lektiinid immuunsuses ja homöostaasis. Nat. Rev. Immunol. 18, 374-389. 10,1038/s41577-018-0004-8.

Browne, HP, Forster, SC, Anonye, ​​BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D. ja Lawley, TD (2016). "Kultuurimatu" inimese mikrobiota kultiveerimine paljastab uudsed taksonid ja ulatuslik sporulatsioon. Loodus 533, 543-+. 10.1038/loodus17645.

Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S. jt. (2008). Autofagia ja autofagia geeni Atg16l1 võtmeroll hiire ja inimese soole Panethi rakkudes. Loodus 456, 259-263. 10.1038/loodus07416.

Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA ja Holmes, SP (2016). DADA2: kõrge eraldusvõimega proovi järeldus Illumina amplikoni andmetest. Nat. Meetodid 13, 581-+. 10.1038/Nmeth.3869.

Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L. ja Garrett, WS (2022). Faecalibaculum rodentium kujundab ümber retinoehappe signaaliülekande, et reguleerida eosinofiilidest sõltuvat sooleepiteeli homöostaasi. Rakuperemees ja mikroob 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.

Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK ja Kim, BC (2015). Faecalibaculum rodentium gen. nov., sp. nov., isoleeritud laborihiire väljaheitest. Antonie Van Leeuwenhoek 108, 1309-1318. 10,1007/s10482-015-0583-3.

Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W. jt. (2017). Soolestiku mükobioota liige moduleerib peremeesorganismi puriini metabolismi, süvendades hiirtel koliiti. Sci. Tõlk. Med. 9, .

Drouin, M., Saenz, J. ja Chiffoleau, E. (2020). C-tüüpi lektiinitaolised retseptorid: pea või saba rakusurma immuunsuses. Esiosa. Immunol. 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H. ja Zoetendal, EG (2021). Soolestiku mikrobioomi stabiilsus ja vastupidavus: häiretele reageerimise selgitamine soolestiku tervise moduleerimiseks. Gut 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.

Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C. ja Eliopoulos, AG (2014). Soolestiku mikrobiota põletikulise soolehaiguse hiiremudelites. Piirid raku- ja nakkusmikrobioloogias 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T. ja Cao, XT (2004). KLRL1, uudne tapjarakkude lektiinilaadne retseptor, pärsib tapjarakkude loomulikku tsütotoksilisust. Blood 104, 2858-2866. DOI 10,1182/veri-2004-03-0878.

Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M. jt. (2012). Koostoimed kommensaalsete seente ja C-tüüpi lektiini retseptori Dectin-1 vahel mõjutavad koliiti. Science 336, 1314-1317. 10.1126/teadus.1221789.

Jason L. Kubinak, WZS, Ray Soto, Charisse Petersen, Tyson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rickesha Bel1, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino, Linda Morrison4, Wayne K. Potts, Peter E. Jensen, Ryan M. O' Connell ja June L. voor (2015). MHC variatsioon kujundab individuaalseid mikroobikooslusi, mis kontrollivad vastuvõtlikkust enteraalse infektsiooni suhtes. Loodussuhtlus. 0,1038/ncomms9642.

Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F. ja Rock, KL (2010). Kusihape soodustab hiirtel ägedat põletikulist reaktsiooni steriilsele rakusurmale. J. Clin. Investeeri. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.

Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK ja Schloss, PD (2013). Kahe indeksiga sekveneerimisstrateegia ja kureerimise torustiku väljatöötamine amplikonjärjestuse andmete analüüsimiseks MiSeq Illumina sekveneerimisplatvormil. Rakendus- ja keskkonnamikrobioloogia 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.{6}}.

Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM ja Round, JL (2015). MyD88 signaaliülekanne T-rakkudes suunab tervise edendamiseks IgA-vahendatud mikrobiota kontrolli. Peremeesraku mikroob 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.

Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namineni, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS ja Ruland, J. (2019). Kusihappekristallide retseptor Clec12A võimendab I tüüpi interferooni vastuseid. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.

Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T. jt . (2015). Assotsiatsioonianalüüsid tuvastavad 38 vastuvõtlikkust põletikulise soolehaiguse suhtes ja toovad esile jagatud geneetilise riski populatsioonide vahel. Nat. Genet. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.

Love, MI, Huber, W. ja Anders, S. (2014). RNA-seq andmete korduvuse ja dispersiooni mõõdukas hinnang DESeq2-ga. Genome Biol. 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8.

Love, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M. ja Patro, R. (2020). Tximeta: võrdlusjärjestuse kontrollsummad lähtekoha tuvastamiseks RNA-seq. Plos Computational Biology 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Luo, Y., Tucker, SC ja Casadevall, A. (2005). Fc- ja komplemendi retseptori aktiveerimine stimuleerib makrofaagirakkude rakutsükli progresseerumist G1-st SJ Immunolini. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.

Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H. ja Zinkernagel, RM (2000). Primitiivne T-rakkudest sõltumatu mehhanism soole limaskesta IgA vastusteks kommensaalsetele bakteritele. Teadus 288, 2222-+. DOI 10.1126/teadus.288.5474.2222.

Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH ja Lepenies, B. (2014). Platvorm C-tüüpi lektiini retseptoriga seonduvate süsivesikute ja nende rakuspetsiifilise sihtimise ja immuunmodulatsiooni potentsiaali skriinimiseks. Journal of Controlled Release 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.

Marshall, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Williams, DL, Gordon, S. ja Brown, GD (2004). Inimese uudse müeloidi inhibeeriva c-tüüpi lektiinitaolise retseptori (MICL) identifitseerimine ja iseloomustus, mida ekspresseeritakse valdavalt granulotsüütidel ja monotsüütidel. J. Biol. Chem. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.

Martin, M. (2011). Cutadapt eemaldab adapteri jadad suure läbilaskevõimega järjestuste lugemistest. EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Mann, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro , M., Lorenzo, MP, et al. (2019). Mincle-Syk telje mikrobiota tuvastamine dendriitrakkudes reguleerib interleukiini-17 ja -22 tootmist ning soodustab soolebarjääri terviklikkust. Immuunsus 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020.

Martinon, F., Petrilli, V., Mayor, A., Tardivel, A. ja Tschopp, J. (2006). Podagraga seotud kusihappekristallid aktiveerivad NALP3 põletiku. Nature 440, 237-241. 10.1038/loodus04516.

Nakajima, A., Vogelzang, A., Maruya, M., Miyajima, M., Murata, M., Son, A., Kuwahara, T., Tsuruyama, T., Yamada, S., Matsuura, M., et al. (2018). IgA reguleerib soolestiku mikrobiota koostist ja metaboolset funktsiooni, soodustades bakterite vahelist sümbioosi. J. Exp. Med. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.

Neumann, K., Castineiras-Vilarino, M., Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. jt. (2014). Clec12a on kusihappekristallide inhibeeriv retseptor, mis reguleerib põletikku vastusena rakusurmale. Immuunsus 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Okai, S., Usui, F., Yokota, S., Hori, IY, Hasegawa, M., Nakamura, T., Kurosawa, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E. jt al. (2016). Kõrge afiinsusega monoklonaalne IgA reguleerib soolestiku mikrobiotat ja hoiab ära koliit hiirtel. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmikrobiool.2016.103.

Pabst, O. ja Slack, E. (2020). IgA ja soolestiku mikrobiota: spetsiifilisuse tähtsus. Limaskestade immunool. 13, 12-21. 10,1038/s41385-019-0227-4.

Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA ja Hugenholtz, P. (2018). Genoomi fülogeneesil põhinev standardiseeritud bakteritaksonoomia muudab oluliselt elupuud. Nat. Biotehnoloogia. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.

Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA ja Kingsford, C. (2017). Lõhe pakub transkripti ekspressiooni kiiret ja eelarvamusteadlikku kvantifitseerimist. Nat. Meetodid 14, 417-+. 10,1038/nmeth.4197.

Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., et al. (2011). Scikit-learn: masinõpe Pythonis. J Mach Learn Res 12, 2825-2830.

Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR ja Brown, GD (2008). Hiire MICL-i (CLEC12A) iseloomustus ja tõendid endogeense ligandi kohta. Eur. J. Immunol. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.

Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., et al. (2019). C-tüüpi lektiini retseptor CLEC12A tunneb ära plasmodiaalse hemosoiini ja aitab kaasa ajumalaaria arengule. Cell Rep. 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.

Ray, A. ja Dittel, BN (2015). Immuunpuudulikkusest tingitud düsbioosi ja koliidi läbitungimise vastastikune seos soolestiku mikrobiotas. Immunology 146, 359-368. 10.1111/imm.12511.

Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrovic, PA jt. (2016). MICL kontrollib põletikku reumatoidartriidi korral. Ann. Rheum. Dis. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.