Cistanche Tubulosa kaitseb dopamiinergilisi neuroneid apoptoosi ja gliiarakkudest pärineva neurotroofse faktori reguleerimise kaudu: in vivo ja in vitro-Ⅰ

SISSEJUHATUS

Parkinsoni tõbi (PD) on levinud neurodegeneratiivne haigus, mis esineb eakatel inimestel ja mille patoloogilised ilmingud on degeneratsiooni tõttu dopamiinergiliste neuronite kadumine mustas aines (SN). Haiguse raskusaste on korrelatsioonis dopamiini (DA) neuronaalsete rakkude kadumisega SN-s, mis on kooskõlas seisukohaga, et neurodegeneratiivne protsess kulgeb paljude aastate jooksul enne sümptomite ilmnemist.Sawle ja Myers, 1993). Haiguse progresseeruv olemus viitab huvitavatele võimalustele terapeutiliseks sekkumiseks, blokeerides selle aluseks oleva neurodegeneratiivse protsessi. Seetõttu pakub märkimisväärset huvi teraapiast põhjustatud neurotroofsete tegurite tugeva ja spetsiifilise toime otsimine DA neuronite ellujäämisele.

LOODUSLIK TUBULOOS DOPAMINERGILISTE NEURONITE KAITSMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Neurotroofsed tegurid on olulised valgud, sealhulgas närvikasvufaktor (NGF), ajust tuletatud neurotroofne faktor (BDNF) ja gliiarakkudest pärinev neurotroofne faktor (GDNF), mis soodustavad närvikasvu, neuroloogilist arengut, aksonite juhtimist ja neuronite funktsiooni. Kõigist neurotroofsetest teguritest, mis kaitsevad ja soodustavad dopamiinergiliste neuronite paranemist, on GDNF-il kõige tugevam mõju (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). On näidatud, et GDNF omab tugevat neurotroofset toimet DA neuronitele in vitro (Lin et al., 1993) ja avaldab in vivo neuroprotektiivset toimet. On näidatud, et GDNF päästis nigraalsed DA-neuronid kahjustusest põhjustatud rakusurma eest pärast kirurgilist või toksiinidest põhjustatud aksotoomiat rottidel (Beck et al., 1995; Kearns ja Gash, 1995; Sauer et al., 1995) ja osaliselt ka pärast seda. süsteemne manustamineN-metüül-4-fenüül-1,2,3,6-tetrahüdropüridiin (MPTP)hiirtel (Tomac et al., 1995). Dopamiinergiliste neuronite degeneratsiooni aluseks on neuronaalsete apoptoosi esinemissageduse suurenemine ja neurotroofsete tegurite vähenenud kaitseefekt, mida võivad vallandada mitmesugused patoloogilised tegurid (Holden et al., 2006).

C. tubulosa on taimne ravim, mis pärineb mitmest perekonna Cistanche taimest. See on peamine ravivõimalus neerupuudulikkuse sündroomi korral, mis on traditsioonilises hiina meditsiinis (TCM) tihedalt seotud androgeenhormoonidega. Praeguseks on paljud C. tubulosa kliinilised ja alusuuringud näidanud neurodegeneratiivsete haiguste toimet. TCM-i neeru toniseerivate retseptide tuvastamine PD-ravis võib seega pakkuda PD alternatiivset kliinilist ravi.ehhinakosiid (ECH)on ravimtaime C. tubulosa peamine bioaktiivne komponent. Uuringud on näidanud Cistanche ja ECH glükosiidide terapeutilist toimet,Verbascoside(VER) ja icariin (ICA) Alzheimeri tõve (AD), PD ja teiste vaskulaarse dementsusega patsientide kohta (Urano ja Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) väitsid, et C. tubulosa ekstraktid, mis sisaldasid piisavalt ECH-d ja akteosiidi, leevendasid A -42 põhjustatud kognitiivset düsfunktsiooni, blokeerides amüloidi ladestumist ning pöörates ümber kolinergilise ja hipokampuse dopamiinergilise neuronaalse funktsiooni. Tao jt. (2015) leidis, etfenüületanoidglükosiididpärit C. tubulosa (Ph Gs-Ct) hoidis ära kõrgmäestiku ajuturse, vähendades AQP4 valgu ja mRNA ekspressiooni rotimudelite ajukoes.

LOODUSLIK TUBULOSA EKSTRAKTI SUUPEPID PARANDAVAD MÄLU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Varasemad uuringud on näidanud, et Hiina taimsed ühendid, sealhulgas kolm koostisosa C. tubulosa, epimedium ja rhizoma polygonati, leevendasid dopamiinergiliste neuronite kahjustusi ja suurendasid dopamiini taset, reguleerides neurotroofsete tegurite ekspressiooni (Wu et al., 2013). Seega pole veel teada, kas C. tubulosa poolt indutseeritud neuroprotektiivne toime on pikaajaline ja mil määral võib nigraalsete DA-neuronite päästmine GDNF-i manustamisega võimaldada PD-loomade sümptomatoloogia jaoks oluliste motoorsete käitumiste olulist säilimist. Selles uuringus kasutati TCM-i neerude toniseerivat retsepti, C. tubulosa nanopulbrit, mis on saanud Hiinas riikliku patendi (patendinumber: 2011103028541) ja millel on varem ilmnenud teatud terapeutiline toime PD puhul. Seetõttu oli käesolev uuring kavandatud uurima C. tubulosa ravi neuroprotektiivseid ja regeneratiivseid toimeid ning uurima apoptoosi MES23.5 rakkudel ja käitumuslikel rottidel ning GDNF-i regulatsiooni, mõõdetuna sihtkatsetega. .

MATERJALID JA MEETODID

Materjalid, reaktiivid ja seadmed

C. tubulosa osteti ettevõttelt Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Peking, Hiina. ECH, VER ja ICA pärinesid Hiina riiklikest toidu- ja ravimikontrolliinstituutidest. MES23.5 dopamiinergilise neuronaalse rakuliini kinkis Hiina Pekingi pealinna meditsiiniülikooli neurobioloogia laboratooriumi professor Biao Chen. Viiskümmend C57BL/6 isast hiirt (igaüks kaaluga 20–25 g) osteti ettevõttelt Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (litsentsi number: SCXK2012-0002), Shanghai, Hiina.

MPP+, MTT ja glutamiin osteti firmalt Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA); DMEM/F12 sööde ja veise loote seerum osteti firmalt Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA); ja MPTP, DA standard ja homovanillhappe (HVA) standard osteti firmalt Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). -aktiin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF perekonna retseptori alfa (GFR 1) ja Ret antikehad osteti ettevõttest Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA); 3,3'-diaminobensidiini (DAB) värvimisreaktiivi komplekt osteti ettevõttelt Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, Hiina); ja SDS-PAGE geeli proovide ettevalmistamise komplekt, ülitundlik täiustatud kemoluminestsentsi (ECL) tuvastamise komplekt ja bitsinhoniinhappe (BCA) test osteti ettevõttest Beyotime Institute of Biotechnology (Peking, Hiina).

Selles uuringus kasutati järgmisi instrumente: ELX800 mikroplaadi lugeja (Bio Tek Winooski, VT, USA); CO2 inkubaator (Heraeus, Hanau, Saksamaa); Gel DOC 2000 geelkujutise analüüsisüsteem, elektroforeesirakk ja elektroforeesipaak (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); DU-650 valguanalüsaator (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); 5417R kiire jahutustsentrifuug (Eppendorf, Hamburg, Saksamaa); SXQM kahe planetaarne kuulveski (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, Hiina); MM400 mikserveski (Retsch GmbH, Haan, Saksamaa); Agilent 1200 kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); PowerPac Basic elektroforees, PowerPac Basic transmembraanne ülekandesüsteem, Universal Hood II kemoluminestsentskujutis, S1000 Thermal Cycler RNA pöördtranskriptsioonisüsteem (Bio-Rad); Motic Med 6.0 koe- ja rakukujutise analüüsisüsteem (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, Hiina).

ValmistamineC. tubulosaNanopulber

C. tubulosa kaaluti, seejärel puhastati ja dehüdreeriti. Pärast tavalist peenestamist lasti C. tubulosa peen pulber läbi 200-sõela ja külmkuivatati. C. tubulosa nanopulbri valmistamiseks kasutati kontrollitud temperatuuriga vaakumit ja suure energiaga kuulveski. Esiteks asetati toores C. tubulosa nanopulber vaakumkuuljahvatuspaaki, mis oli laetud karbiidist jahvatuskuulidega. Jahvatuskuulikeste ja C. tubulosa nanopulbri suhe oli vahemikus 15:1 kuni 5:1. Peene pulbri saamiseks seati suure energiaga kuulveski kiiruseks ja kestuseks vastavalt 300 p/min ja 20 min. Peenpulber kaaluti nanomõõtmeliste materjalide töötlemiseks ja töödeldi mikserveskis sagedusega 25/s ja võnkumisega 20s kolme korduse jooksul. PBS-i kasutati 25 mg/ml põhilahuse lahustamiseks ja valmistamiseks, millele järgnes 30-minutiline ultrahelitöötlus, autoklaavimine ja lõpuks säilitamine temperatuuril –20 °C.

Aktiivsete komponentide kvaliteedikontrollC. tubulosaHPLC abil

ECH ja VER sisaldasid gradientelueerimist oktadetsüülsilaaniga seotud ränidioksiidiga täiteainena, metanooliga liikuva faasina A ja 0,1% sipelghappe lahusega liikuva faasina B. Detekteerimise lainepikkus oli 330 nm. ICA sisaldas gradientelueerimist, kasutades täiteainena oktadetsüülsilaaniga seotud ränidioksiidi ja liikuva faasina atsetonitriili-vett (30:70). Tuvastuslainepikkus oli 270 nm. Testi jaoks mõõdeti proovi, kontrolli ja negatiivse kontrolli jaoks 10 µl.

Rakukultuur ja MTT analüüs MPP elujõulisuse mõõtmiseks+- Töödeldud rakud

MES23.5 rakke inokuleeriti 5% vasika loote seerumi, 1% glutamiini, 2% 50 × Sato lahusega ja DMEM/F12 söötmega, mis sisaldas 2% penitsilliini/streptomütsiini. Neid inkubeeriti temperatuuril 37 °C 5% CO2 inkubaatoris küllastunud niiskusega. Rakud eraldati ja passeeriti 0,25% trüpsiiniga ning rakususpensioon koguti logaritmilises kasvufaasis. Eraldatud rakud tihedusega 1 × 105 külvati polülüsiiniga kaetud 96-süvendiga plaatidele, millele järgnes erinevate lõppkontsentratsioonide (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ja 800 µmol/L) lisamine. ) MPP+ meediast. In vitro katsetes kasutati negatiivsete kontrollidena MES23.5 rakke, mida inkubeeriti normaalse söötmega 24 tundi ja 48 tundi. Erinevate ravirühmade rakke inkubeeriti MTT reagendiga 4 tundi. Seejärel visati süvendites olev lahus ära ja lisati 150 µl DMSO-d ja võnguti 10 minutit. Iga proovi neeldumist lainepikkusel 570 nm mõõdeti automaatse mikroplaadilugeja abil. Rakkude elujõulisuse protsent (%)=keskmine neelduvus katserühmas / negatiivne kontrollrühma keskmine neelduvus × 100%.

MPP+ söötme asjakohased kontsentratsioonid lisati 24-tunniseks töötlemiseks MES23.5 rakkudes, kasutades sama lähenemisviisi nagu in vitro kultuuri puhul. Pärast töötlemist süvendis olnud lahus visati ära. Erinevates reservuaarides olevatele MES23.5 rakkudele lisati C. tubulosa nanopulbrit erineva kontsentratsiooniga (10, 50, 100, 200, 250, 500 ja 1000 µg/mL) sisaldav sööde ning jäeti 24 tunniks ja 48 tunniks inkubeerima. Negatiivsete kontrollidena kasutati MES23.5 rakke, mida inkubeeriti normaalse söötmega 24 tundi ja 48 tundi. Vehiikulina kasutati MES23.5 rakke, mida inkubeeriti MPP+ söötmega. Mõõtmised tehti iga proovi jaoks kolmes eksemplaris. Rakkude elujõulisuse arvutamiseks mõõdeti vastavate ravi- ja kontrollrühmade neeldumist.

LOODUSLIK TUBULOOSA EKSTRAKT VÄSIMUSVASTANE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TH ekspressioon, mõõdetud immunotsütokeemiaga

Kui C. tubulosa nanopulbri sisaldus oli 100, 200 ja 250 µg/ml, suurenes rakkude ellujäämise määr oluliselt (joonis 2G). Seega katsetasime järgnevates katsetes kolme kontsentratsiooni: väikese annuse, keskmise annuse ja suure annuse rühma. Iga C. tubulosa rühma puhul testiti kolme replikatsiooni. Steriliseeritud polülüsiiniga kaetud katteklaasid asetati 6-süvendiplaatidele. Järgmisena külvati igasse süvendisse 5 × 104 rakku ja inkubeeriti 24 tundi. Tavaline värske sööde asendati normaalses kontrollrühmas ja lõppkontsentratsiooniga 100 µmol/L MPP+ söödet asendati ülejäänud ravirühmades, et inkubeerida 24 tundi. Seejärel asendati tavaline värske sööde normaalsetes kontroll- ja vehiikulite rühmas ning lõppkontsentratsioone 100, 200 ja 250 µg/ml C. tubulosa nanopulbrit inkubeeriti rakkudega 24 tundi madala, keskmise ja suure annusega. C. tubulosa ravirühmad. Erinevate rühmade MES23.5 rakke pesti kolm korda PBS-is, et eemaldada supernatant ja fikseeriti seejärel 4% paraformaldehüüdis 15 minutit. Pärast PBS-ga pesemist inkubeeriti rakke peroksidaasi blokaatoriga temperatuuril 37 °C 30 minutit ja seejärel pesti uuesti PBS-iga. Rakkude permeabiliseerimiseks kasutati 10 minuti jooksul 0,2% Triton X{30}} lahust, millele järgnes pesemine PBS-ga. Igale proovile lisati tavalist kitse seerumit ja inkubeeriti toatemperatuuril 30 minutit. Seejärel eemaldati normaalne kitse seerum ja igale proovile lisati PBS-is 1:400 lahjendatud primaarne antikeha ja inkubeeriti temperatuuril 4 °C üleöö. Negatiivse kontrollrühma rakke inkubeeriti PBS-ga temperatuuril 4 °C üleöö. Pärast PBS-ga pesemist inkubeeriti rakke biotiiniga märgistatud sekundaarsete antikehadega niiskuskambris temperatuuril 37 °C 20 minutit. Seejärel pesti iga proovi PBS-s ja märgistati mädarõika peroksidaas-streptavidiini konjugaatidega (töölahus C) temperatuuril 37 °C 20 minutit. Pärast PBS-ga pesemist värviti rakke pimedas DAB-reagendiga umbes 1–10 minutit ja pruuni värvi kujunemist jälgiti valgusmikroskoopia abil. Seejärel pesti iga proovi kaks korda destilleeritud vees 1–2 minutit ja tuumad värviti hematoksüliini lahusega 0, 5–1 minutit. Pärast iga proovi põhjalikku loputamist vees sukeldati rakud diferentseerumiseks 1% vesinikkloriidhappe alkoholi ja 1% ammoniaagi vesilahusesse, millele järgnes rakkude põhjalik pesemine vees. Seejärel dehüdreeriti iga proovi rakke 70% etanoolis 2 minutit, 80% etanoolis 2 minutit, 90% etanoolis 2 minutit kaks korda, 95% etanoolis 2 minutit kaks korda ja 100% etanoolis 2 minutit kaks korda. Seejärel sukeldati rakud kaks korda 2 minutiks ksüleeni lahusesse ja paigaldati neutraalsete vaikudega slaidile. Valgusmikroskoopias tehti iga proovi kujutise jäädvustamine ja juhuslik valik 5–10 efektiivset nägemisvälja, et määrata valitud valkude ekspressioon dopamiinergilistes neuronites, mida näitab pruunide osakeste intensiivsus, ja valgusisalduse poolkvantifitseerimiseks selle keskmise halli väärtuse järgi. .

MES23.5 rakkude apoptoosi määr voolutsütomeetriaga mõõdetuna

Adherentseid rakke pesti üks kord PBS-ga. Rakkude isoleerimiseks lisati toatemperatuuril sobiv kogus EDTA-vaba trüpsiini lahust ja lahust pipeteeriti õrnalt, et võimaldada kleepunud rakkude eraldumist. Seejärel lisati trüpsiniseerumise peatamiseks rakukultuuri söödet. Segu kanti üle uude tsentrifuugituubi ja seejärel tsentrifuugiti 5 minutit kiirusel 1500 p/min, et koguda eraldatud rakud. Pärast supernatandi äraviskamist resuspendeeriti rakusade ettevaatlikult PBS-i kasutades ja rakud loendati. Ligikaudu 1 × 105 kuni 5 × 105 resuspendeeritud rakku tsentrifuugiti 5 minutit kiirusel 1500 p / min ja supernatant visati ära. Rakkude õrnaks resuspendeerimiseks lisati rakupelletile viis mikroliitrit anneksiin V-FITC sidumislahust. Lisati veel 5 µl anneksiin V-FITC-d ja segati hoolikalt. Rakkude värvimiseks kasutati viit mikroliitrit propiidiumjodiidi lahust, inkubeerides toatemperatuuril 10 minutit vahetult enne voolutsütomeetriat.

Western Blot analüüs jaoksin vitro

Rakud jagati normaalseks rühmaks, MPP+ ravirühmaks, väikese annusegaC. tubulosaravirühma, mõõduka annusega C. tubulosa ravirühma ja suure annusega C. tubulosa ravirühma. Mõlemas mõõdeti Bcl2 ja Baxi ekspressiooni. Enne rakkude kogumist kasutati igas rühmas modelleerimiseks ja töötlemiseks kokku 1 × 105 rakku süvendi 6-augu kohta. Lisati segalüsaat, mis sisaldas RIPA puhvrit, proteaasi inhibiitorit ja fosfataasi inhibiitorit, et lüüsida rakud 3 0 minuti jooksul jääl. Pärast tsentrifuugimist kasutati supernatanti valgu analüüsiks. Kogu valk kvantifitseeriti BCA analüüsi abil ja eraldati 10% SDS-PAGE-ga. Eraldatud valgud kanti üle membraanile ja inkubeeriti 5% lõssi blokeeriva puhvriga toatemperatuuril 2 tundi. Seejärel inkubeeriti membraani primaarses antikehas (Bcl-2 0,34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, lahjendus 1:200) temperatuuril 4 °C üle öö. Pärast pesemisetappi inkubeeriti membraani sekundaarses antikehas (0,5 mg/ml, lahjendus 1:5000) 4 °C juures 1 tund ja seejärel ECL ilmutis 2 minutit tavapäraseks arendamiseks. Valgu ekspressiooni poolkvantitatiivseks analüüsiks kasutati Quantity One tarkvara.

LOODUSLIK CISTANCHE TUBULOSA VÄSIMUSVASTANE MAKSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperimentaalne loomade modelleerimine ja ravimite administratsioon

Viiskümmend spetsiifilise patogeenivaba 8-nädalast isast hiirt jagati juhuslikult viide rühma: tavaline rühm, MPTP-ravi rühm (vehicle), väikese annusega C. tubulosa ravirühm, mõõduka annusega C. tubulosa ravirühm. rühmas ja suurte annustega C. tubulosa ravirühmas. Loomi hoiti temperatuuril 20–22 ◦C vaba juurdepääsuga toidule ja veele. Normaalse rühma hiirtele süstiti intraperitoneaalselt võrdne kogus tavalist soolalahust seitsmel järjestikusel päeval. Teiste ravirühmade hiirtele süstiti intraperitoneaalselt MPTP-d (30 mg/kg/päevas) seitsmel järjestikusel päeval, et luua kandjaid.

PD modelleerimise ajal manustati väikese, mõõduka ja suure annusega C. tubulosa ravirühmade hiirtele maosiseselt ekvivalentsed kliinilised kogused 4 g/kg/päevas, 8 g/kg/päevas ja 16 g/päevas. kg/dC. tubulosa nanopulber, vastavalt 14 päeva järjest. Kontroll- ja vehiiklirühma hiirtele manustati 14 järjestikuse päeva jooksul maosiseselt ekvivalentsed kogused tavalist soolalahust. Kõik katseprotseduurid kiitis heaks TCM-i Fujiani ülikooli eetikakomitee ja need viidi läbi vastavalt rahvusvaheliselt tunnustatud laboriloomade kasutamise ja hooldamise põhimõtetele. Selles uuringus tehti kõik jõupingutused loomade kannatuste minimeerimiseks.