1. Sissejuhatus

Immunomoduleerivate omadustega toidu koostisosade tuvastamine koos nende vastavate molekulaarsete sihtmärkidega on viimastel aastatel äratanud suuremat huvi. Tänu oma suurele ligandi mitmekesisusele esindab ioonikanalite (TRP-kanalite) mööduv retseptori potentsiaalne superperekond väga huvitavat potentsiaalsete sihtstruktuuride klassi.

Imetajate TRP-kanalite superperekond sisaldab kuut seotud valgu perekonda, nimelt anküriin (TRPA), kanooniline (TRPC), melastatiin (TRPM), mukolipiin (TRPML), polütsüstiini (TRPP) ja vanilloidi (TRPV) perekond, mis kõik jagavad tavaliselt kuut transmembraanset segmenti, mis koosnevad tetrameeride selektsioonivõimega tetrameeride moodustamiseks. TRPV1 kanal võib olla TRP superperekonna kõige intensiivsemalt uuritud liige. Algselt tuvastati TRPV1 kapsaitsiini, tšillipipra terava komponendi, retseptorina.[2] Hiljem näidati, et ka ingveri teravad koostisosad, gingeroolid, aktiveerivad TRPV1.[3]

TRPV1 bioloogiline roll mitteneuronaalsetes rakutüüpides on endiselt ulatusliku uurimise all, kuid saadaolevad tulemused viitavad funktsioonidele, mis on kaugel sensoorsest ja termilisest tajumisest. Näiteks 12-nädalane sekkumine TRPV1 agonisti nonivamiidi, struktuurse kapsaitsiini analoogi, 0,15 mg päevase annusega hoidis ära toidust põhjustatud rasvamassi suurenemise ja tõstis tervetel ülekaalulistel isikutel plasma serotoniinitaset.[4]

3T3-L1 adipotsüütides vähendas TRPV1 aktiveerimine nonivamiidi poolt lipiidide akumulatsiooni diferentseerumise ja küpsemise ajal, pärssides PPAR ekspressiooni.[5] Makrofaagides nõrgendasid kapsaitsiin ja nonivamiid TRPV1-st sõltuval viisil põletikueelsete tsütokiinide, nagu IL6, CXCL8 ja TNF-alfa, LPS-indutseeritud vabanemist.[6] Siiski on TRPV1 konkreetsed funktsioonid inimese vere leukotsüütides ebamäärased. Inimese NK-rakkudes kutsus 10 ja 50 µM kapsaitsiin esile intratsellulaarse Ca2+ kontsentratsiooni tõusu, mis viitab funktsionaalsele TRPV1 kanalile.[7]

Summutatud NK-rakkude efektorfunktsioonid, nagu tsütotoksiline degranulatsioon ja tsütokiinide sekretsioon, mis indutseeriti rakkude eeltöötlemisel kapsaitsiiniga 1 tunni jooksul kontsentratsioonivahemikus 10–100 μM, olid aga suures osas TRPV1-st sõltumatud.[7] T-rakkudes on dokumenteeritud, et TRPV1 osaleb T-raku retseptori signaaliülekande, T-rakkude proliferatsiooni ja diferentseerumise protsessides, samuti tsütokiinide tootmises.[8] Meie rühma eelmine töö näitas ka TRPV1 funktsionaalset ekspressiooni inimese primaarsetes T-rakkudes.[9] Lisaks näitasid annuse-vastuse analüüsid kontsentratsioonides vahemikus 0,03 kuni 300 μmol L-1, et [6]-gingerool inhibeerib inimese primaarsete leukotsüütide tsütokiini sekretsiooni IC50 väärtusega 82,2 μmol L-1.

Kuid [6]-gingerooli kvantifitseerimine tervete katsealuste plasmaproovides näitas, et pärast 1 liitri ingveritee joomist oli keskmine maksimaalne plasmakontsentratsioon ainult 42,0 ± 16,3 nmol L−1. Kuna need [6]-gingerooli kontsentratsioonid ei avaldanud varasemates uuringutes olulist mõju tsütokiinide sekretsioonile,[9] on ebaselge, kas toiduga oluline kontsentratsioon 50 nmol L-1, mis saavutatakse vereplasmas pärast 1 liitri ingveritee tarbimist, on piisav, et moduleerida rakulist immuunvastust teistes inimese primaarsetes leukotsüütides.

Inimese neutrofiilide puhul on teadmised TRPV1 funktsionaalse rolli kohta piiratud. Kui Köse ja Nazıroglu˘ [10] näitasid, et vastusena 10 µM kapsaitsiinile vähenes TRPV1 antagonist kapsasepiin Ca2+- neutrofiilide voogudes, siis teised tulemused ei näidanud, et kapsaitsiin kutsuks esile Ca2+ sissevoolu vaatamata aPV-le, kui seda testiti kontsentratsioonivahemikus 1–1 M PV1,00. väljendus.[11]

Neutrofiilid on kõige levinumad leukotsüüdid inimese veres, moodustades 60–70% kõigist ringlevatest valgelibledest. Need on esimesed immuunrakud, mis värvatakse nakkuskohta; seetõttu nimetatakse neid sageli esimeseks kaitseliiniks.[12] Neutrofiilide värbamise vallandavad muuhulgas bakteriaalne või mitokondritest pärinev peptiid N-formüülmetioniin-leutsüül-fenüülalaniin (fMLF) või kemokiinid nagu CXCL8 (IL-8).[13]

Neutrofiilide kaitsemehhanismide hulka kuuluvad fagotsütoos[14], antimikroobse ensüümi vabanemine degranulatsiooni teel,[15] reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) teke[16] ja neutrofiilide rakuväliste püüniste moodustumine[17]. Lisaks nendele otsestele kaitsemehhanismidele aitavad neutrofiilid erinevate tsütokiinide ja kemokiinide vabastamise kaudu kaasa järgnevatele immuunvastustele.[18] Samuti võivad neutrofiilid läbida algprotsessi, mis võimaldab neil järgnevale täielikule aktiveerimisele tugevamalt reageerida.[16b]

Viimastel aastatel on üha rohkem tõendeid selle kohta, et toidust ja/või ravimtaimedest pärit koostisosad võivad muuta ühte või mitut inimese neutrofiilide mainitud kaitsereaktsiooni. Need modifikatsioonid hõlmavad suurenenud fagotsütootilist aktiivsust[19] ja ROS-i teket,[20] suurenenud kemotaksist fMLF-i suhtes[21] ja neutrofiilide ekstratsellulaarsete püüniste moodustumist[20]. Siiski ei tuvastatud aktiivset ühendit/aineid. Ferula akitschkensis'e koostisosad (-pineen, sabineen, -terpineen, geranüülatsetoon ja isobornüülatsetaat) desensibiliseerisid neutrofiilid fMLF- ja CXCL8-indutseeritud Ca2+ sissevoolu suhtes ning inhibeerisid fMLF-i poolt indutseeritud toimeid, kus atsetooni poolt indutseeritud geranüütaksise kaudu. TRPV1.[22]

Olemasolevatele andmetele tuginedes oletasime, et ligandi poolt indutseeritud TRPV1 aktiveerimine [6]-gingerooli poolt võib mõjutada neutrofiilide üldisi funktsioone kas otse või võimendades nende reaktsioone aktiveerivatele stiimulitele. Selle hüpoteesi raames püüdsime eelkõige selgitada, kas kontrollitud toitumisalane kontsentratsioon on piisav, et moduleerida rakulisi immuunvastuseid inimese primaarsetes neutrofiilides leukotsüütide populatsiooni osana. '

Lisaks püüdsime võrrelda imetajate TRP superperekonna kõigi liikmete RNA ekspressioonitasemeid viies kõige silmatorkavamas rakutüübis inimese veres, et saada kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt põhjalik ülevaade TRP kanali ekspressioonist inimese leukotsüütides.

2. Tulemused

2.1. Inimese leukotsüütide TRP-kanalite arvukus ja suhteline transkriptsioonitase

Selleks, et hinnata TRP kanali RNA ekspressiooni vere leukotsüütides, eraldati tervete doonorite verest viis silmapaistvamat leukotsüütide rakutüüpi ja TRP kanalite RNA ekspressiooni analüüsiti kvantitatiivse RT-PCR abil (joonis 1).

TRPV ja TRPM perekonna spetsiifilised transkriptid tuvastati kõigis analüüsitud rakutüüpides kõrge sagedusega 75–100%. Keskmine üldine esinemissagedus, võttes arvesse kõiki rakutüüpe, oli TRPV perekonna puhul 96% ja TRPM perekonna puhul 98%. TRPC-spetsiifilisi transkripte oli palju vähem, ulatudes 0% -st monotsüütides, NK-rakkudes, T-rakkudes ja B-rakkudes kuni 100% -ni NK-rakkudes ja T-rakkudes, mille üldine keskmine sagedus oli ainult 53% (joonis 1A). TRPC5-spetsiifiline transkript tuvastati ainult neutrofiilides, sagedusega 70%.

Samuti näitas TRPA1-spetsiifiline transkript üldiselt üsna madalat arvukust analüüsitud rakutüüpides sagedusega 100% neutrofiilides, 25% monotsüütides, 80% NK-rakkudes, 100% T-rakkudes ja 60% B-rakkudes. Samuti näitas TRPML3-spetsiifiline transkript neutrofiilides (50%), monotsüütides (25%), NK-rakkudes (40%) ja B-rakkudes (20%) madalat sagedust, kuid T-rakkudes 100%. TRPV1-spetsiifiline transkript tuvastati kõigis rakutüüpides, mille esinemissagedus oli 100% monotsüütides, NK-rakkudes ja T-rakkudes ning sagedus 90% neutrofiilides ja 80% B-rakkudes.

Seoses suhtelise RNA ekspressiooniga, võrreldes vastavate sagedustega, näitasid TRP kanalid rakutüübispetsiifilisemat ekspressioonimustrit, mis ilmneb erinevate analüüsitud rakutüüpide vastavate Δct väärtuste võrdlemisel (joonis 1B). Näiteks tuvastati TRPP3 sagedusega 100% kõigis rakutüüpides, kuid see näitas selgelt kõrgeimat ekspressioonitaset monotsüütides.

Seevastu TRPV2 kanal tuvastati kõigis uuritud rakutüüpides, nii kõrge RNA ekspressioonitaseme kui ka kõrge sagedusega. Samuti olid TRPV1 transkriptsioonitasemed kõigis uuritud rakutüüpides sarnased (joonis 1B).

2.2. TRPV1 pinna ekspressioon neutrofiilidel

Praegused teadmised TRPV1 funktsiooni kohta inimese neutrofiilides on endiselt ebaselged. TRPV1 rollide edasiseks uurimiseks inimese neutrofiilides uurisime järgnevalt, kas TRPV1 kanal ekspresseerub inimese primaarsete neutrofiilide pinnal, kasutades elusrakkude voolutsütomeetriat (joonis 2).

Eraldatud neutrofiilid värviti CD15 jaoks neutrofiilide pinnamarkerina (joonis 2A, B) ja samaaegselt kas TRPV1 valgu esimeses ekstratsellulaarses ahelas oleva epitoobi vastu tekitatud antikehaga (joonis 2B) või vastava isotüübi kontrolliga, viimane toimib mittespetsiifilise seondumise määramiseks (asurendajana). CD15+ populatsioonis analüüsiti FITC fluorestsentsi intensiivsust. Neutrofiilide värvimine TRPV1 antikehaga andis isotüübi kontrolliga võrreldes selgelt eristatava fluorestsentssignaali, kinnitades sellega TRPV1 pinnaekspressiooni inimese primaarsetes neutrofiilides (joonis 2C). Nelja individuaalse doonori neutrofiilide analüüsimine näitas TRPV1 võrreldavat pinnaekspressiooni (joonis 2D).

2.3. [6] - Gingeroolist põhjustatud rakusisese Ca suurenemine2+

Kuna ligandi poolt indutseeritud TRPV1 aktiveerimine põhjustab Ca2+ sissevoolu, määrati neutrofiilide [23] intratsellulaarne Ca2+ kontsentratsioon Ca2+--tundliku värvaine Fura-2 abil. Meie varasemate leidude põhjal [9] valiti tuntud TRPV1 ligandi [6]-gingerooli kontsentratsiooniks 50 nM ja inkubatsiooniajaks 2 tundi. Analüüsid näitasid, et neutrofiilide inkubeerimine 50 nM [6]-gingerooliga suurendas intratsellulaarset Ca2+ kontsentratsiooni, mis oli keskmiselt 18,4% ± 1,0% maksimaalsest väärtusest, mis määrati 1 µM ionofoorse ionomütsiini kasutamisega. DMSO indutseeritud tõus oli 4,7% ± 1,2% (joonis 3).

2.4. [6]-Gingeroli mõju TRPV1 ekspressioonile

Järgmisena püüdsime analüüsida [6]-gingerooliga TRPV1 stimuleerimise mõju TRPV1 ekspressioonile transkriptsiooni tasemel q-RTPCR abil ning pinnavalgu tasemel elusrakkude värvimise kaudu. Sel eesmärgil inkubeeriti inimese neutrofiile 50 nM [6]-gingerooliga 2 tundi ja vastavad ekspressioonitasemed kvantifitseeriti.

See 2-tunnine inkubeerimine ei mõjutanud ei TRPV1 transkripti ega valgu taset (joonis 4) ning samuti ei muutunud, välja arvatud IL6, IL17A, IL24, C5 ja GDF5 puhul, uuritud tavaliste tsütokiinide ja kemokiinide geenide RNA ekspressioon (joonis S1, tabel S2, tugiteave).

2.5. [6]-Gingeroli mõju neutrofiilide pinnamarkerite ekspressioonile

1. Sissejuhatus

Immunomoduleerivate omadustega toidu koostisosade tuvastamine koos nende vastavate molekulaarsete sihtmärkidega on viimastel aastatel äratanud suuremat huvi. Tänu oma suurele ligandi mitmekesisusele esindab ioonikanalite (TRP-kanalite) mööduv retseptori potentsiaalne superperekond väga huvitavat potentsiaalsete sihtstruktuuride klassi.

Imetajate TRP-kanalite superperekond sisaldab kuut seotud valgu perekonda, nimelt anküriin (TRPA), kanooniline (TRPC), melastatiin (TRPM), mukolipiin (TRPML), polütsüstiini (TRPP) ja vanilloidi (TRPV) perekond, mis kõik jagavad tavaliselt kuut transmembraanset segmenti, mis koosnevad tetrameeride selektsioonivõimega tetrameeride moodustamiseks. TRPV1 kanal võib olla TRP superperekonna kõige intensiivsemalt uuritud liige. Algselt tuvastati TRPV1 kapsaitsiini, tšillipipra terava komponendi, retseptorina.[2] Hiljem näidati, et ka ingveri teravad koostisosad, gingeroolid, aktiveerivad TRPV1.[3]

TRPV1 bioloogiline roll mitteneuronaalsetes rakutüüpides on endiselt ulatusliku uurimise all, kuid saadaolevad tulemused viitavad funktsioonidele, mis on kaugel sensoorsest ja termilisest tajumisest. Näiteks 12-nädalane sekkumine TRPV1 agonisti nonivamiidi, struktuurse kapsaitsiini analoogi, 0,15 mg päevase annusega hoidis ära toidust põhjustatud rasvamassi suurenemise ja tõstis tervetel ülekaalulistel isikutel plasma serotoniinitaset.[4]

3T3-L1 adipotsüütides vähendas TRPV1 aktiveerimine nonivamiidi poolt lipiidide akumulatsiooni diferentseerumise ja küpsemise ajal, pärssides PPAR ekspressiooni.[5] Makrofaagides nõrgendasid kapsaitsiin ja nonivamiid TRPV1-st sõltuval viisil põletikueelsete tsütokiinide, nagu IL6, CXCL8 ja TNF-alfa, LPS-indutseeritud vabanemist.[6] Siiski on TRPV1 konkreetsed funktsioonid inimese vere leukotsüütides ebamäärased. Inimese NK-rakkudes kutsus 10 ja 50 µM kapsaitsiin esile intratsellulaarse Ca2+ kontsentratsiooni tõusu, mis viitab funktsionaalsele TRPV1 kanalile.[7]

Summutatud NK-rakkude efektorfunktsioonid, nagu tsütotoksiline degranulatsioon ja tsütokiinide sekretsioon, mis indutseeriti rakkude eeltöötlemisel kapsaitsiiniga 1 tunni jooksul kontsentratsioonivahemikus 10–100 μM, olid aga suures osas TRPV1-st sõltumatud.[7] T-rakkudes on dokumenteeritud, et TRPV1 osaleb T-raku retseptori signaaliülekande, T-rakkude proliferatsiooni ja diferentseerumise protsessides, samuti tsütokiinide tootmises.[8] Meie rühma eelmine töö näitas ka TRPV1 funktsionaalset ekspressiooni inimese primaarsetes T-rakkudes.[9] Lisaks näitasid annuse-vastuse analüüsid kontsentratsioonides vahemikus 0,03 kuni 300 μmol L-1, et [6]-gingerool inhibeerib inimese primaarsete leukotsüütide tsütokiini sekretsiooni IC50 väärtusega 82,2 μmol L-1.

Kuid [6]-gingerooli kvantifitseerimine tervete katsealuste plasmaproovides näitas, et pärast 1 liitri ingveritee joomist oli keskmine maksimaalne plasmakontsentratsioon ainult 42,0 ± 16,3 nmol L−1. Kuna need [6]-gingerooli kontsentratsioonid ei avaldanud varasemates uuringutes olulist mõju tsütokiinide sekretsioonile,[9] on ebaselge, kas toiduga oluline kontsentratsioon 50 nmol L-1, mis saavutatakse vereplasmas pärast 1 liitri ingveritee tarbimist, on piisav, et moduleerida rakulist immuunvastust teistes inimese primaarsetes leukotsüütides.

Inimese neutrofiilide puhul on teadmised TRPV1 funktsionaalse rolli kohta piiratud. Kui Köse ja Nazıroglu˘ [10] näitasid, et vastusena 10 µM kapsaitsiinile vähenes TRPV1 antagonist kapsasepiin Ca2+- neutrofiilide voogudes, siis teised tulemused ei näidanud, et kapsaitsiin kutsuks esile Ca2+ sissevoolu vaatamata aPV-le, kui seda testiti kontsentratsioonivahemikus 1–1 M PV1,00. väljendus.[11]

Neutrofiilid on kõige levinumad leukotsüüdid inimese veres, moodustades 60–70% kõigist ringlevatest valgelibledest. Need on esimesed immuunrakud, mis värvatakse nakkuskohta; seetõttu nimetatakse neid sageli esimeseks kaitseliiniks.[12] Neutrofiilide värbamise vallandavad muuhulgas bakteriaalne või mitokondritest pärinev peptiid N-formüülmetioniin-leutsüül-fenüülalaniin (fMLF) või kemokiinid nagu CXCL8 (IL-8).[13]

Neutrofiilide kaitsemehhanismide hulka kuuluvad fagotsütoos[14], antimikroobse ensüümi vabanemine degranulatsiooni teel,[15] reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) teke[16] ja neutrofiilide rakuväliste püüniste moodustumine[17]. Lisaks nendele otsestele kaitsemehhanismidele aitavad neutrofiilid erinevate tsütokiinide ja kemokiinide vabastamise kaudu kaasa järgnevatele immuunvastustele.[18] Samuti võivad neutrofiilid läbida algprotsessi, mis võimaldab neil järgnevale täielikule aktiveerimisele tugevamalt reageerida.[16b]

Viimastel aastatel on üha rohkem tõendeid selle kohta, et toidust ja/või ravimtaimedest pärit koostisosad võivad muuta ühte või mitut inimese neutrofiilide mainitud kaitsereaktsiooni. Need modifikatsioonid hõlmavad suurenenud fagotsütootilist aktiivsust[19] ja ROS-i teket,[20] suurenenud kemotaksist fMLF-i suhtes[21] ja neutrofiilide ekstratsellulaarsete püüniste moodustumist[20]. Siiski ei tuvastatud aktiivset ühendit/aineid. Ferula akitschkensis'e koostisosad (-pineen, sabineen, -terpineen, geranüülatsetoon ja isobornüülatsetaat) desensibiliseerisid neutrofiilid fMLF- ja CXCL8-indutseeritud Ca2+ sissevoolu suhtes ning inhibeerisid fMLF-i poolt indutseeritud toimeid, kus atsetooni poolt indutseeritud geranüütaksise kaudu. TRPV1.[22]

Olemasolevatele andmetele tuginedes oletasime, et ligandi poolt indutseeritud TRPV1 aktiveerimine [6]-gingerooli poolt võib mõjutada neutrofiilide üldisi funktsioone kas otse või võimendades nende reaktsioone aktiveerivatele stiimulitele. Selle hüpoteesi raames püüdsime eelkõige selgitada, kas kontrollitud toitumisalane kontsentratsioon on piisav, et moduleerida rakulisi immuunvastuseid inimese primaarsetes neutrofiilides leukotsüütide populatsiooni osana. '

Lisaks püüdsime võrrelda imetajate TRP superperekonna kõigi liikmete RNA ekspressioonitasemeid viies kõige silmatorkavamas rakutüübis inimese veres, et saada kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt põhjalik ülevaade TRP kanali ekspressioonist inimese leukotsüütides.

2. Tulemused

2.1. Inimese leukotsüütide TRP-kanalite arvukus ja suhteline transkriptsioonitase

Selleks, et hinnata TRP kanali RNA ekspressiooni vere leukotsüütides, eraldati tervete doonorite verest viis silmapaistvamat leukotsüütide rakutüüpi ja TRP kanalite RNA ekspressiooni analüüsiti kvantitatiivse RT-PCR abil (joonis 1).

TRPV ja TRPM perekonna spetsiifilised transkriptid tuvastati kõigis analüüsitud rakutüüpides kõrge sagedusega 75–100%. Keskmine üldine esinemissagedus, võttes arvesse kõiki rakutüüpe, oli TRPV perekonna puhul 96% ja TRPM perekonna puhul 98%. TRPC-spetsiifilisi transkripte oli palju vähem, ulatudes 0% -st monotsüütides, NK-rakkudes, T-rakkudes ja B-rakkudes kuni 100% -ni NK-rakkudes ja T-rakkudes, mille üldine keskmine sagedus oli ainult 53% (joonis 1A). TRPC5-spetsiifiline transkript tuvastati ainult neutrofiilides, sagedusega 70%.

Samuti näitas TRPA1-spetsiifiline transkript üldiselt üsna madalat arvukust analüüsitud rakutüüpides sagedusega 100% neutrofiilides, 25% monotsüütides, 80% NK-rakkudes, 100% T-rakkudes ja 60% B-rakkudes. Samuti näitas TRPML3-spetsiifiline transkript neutrofiilides (50%), monotsüütides (25%), NK-rakkudes (40%) ja B-rakkudes (20%) madalat sagedust, kuid T-rakkudes 100%. TRPV1-spetsiifiline transkript tuvastati kõigis rakutüüpides, mille esinemissagedus oli 100% monotsüütides, NK-rakkudes ja T-rakkudes ning sagedus 90% neutrofiilides ja 80% B-rakkudes.

Seoses suhtelise RNA ekspressiooniga, võrreldes vastavate sagedustega, näitasid TRP kanalid rakutüübispetsiifilisemat ekspressioonimustrit, mis ilmneb erinevate analüüsitud rakutüüpide vastavate Δct väärtuste võrdlemisel (joonis 1B). Näiteks tuvastati TRPP3 sagedusega 100% kõigis rakutüüpides, kuid see näitas selgelt kõrgeimat ekspressioonitaset monotsüütides.

Seevastu TRPV2 kanal tuvastati kõigis uuritud rakutüüpides, nii kõrge RNA ekspressioonitaseme kui ka kõrge sagedusega. Samuti olid TRPV1 transkriptsioonitasemed kõigis uuritud rakutüüpides sarnased (joonis 1B).

2.2. TRPV1 pinna ekspressioon neutrofiilidel

Praegused teadmised TRPV1 funktsiooni kohta inimese neutrofiilides on endiselt ebaselged. TRPV1 rollide edasiseks uurimiseks inimese neutrofiilides uurisime järgnevalt, kas TRPV1 kanal ekspresseerub inimese primaarsete neutrofiilide pinnal, kasutades elusrakkude voolutsütomeetriat (joonis 2).

Eraldatud neutrofiilid värviti CD15 jaoks neutrofiilide pinnamarkerina (joonis 2A, B) ja samaaegselt kas TRPV1 valgu esimeses ekstratsellulaarses ahelas oleva epitoobi vastu tekitatud antikehaga (joonis 2B) või vastava isotüübi kontrolliga, viimane toimib mittespetsiifilise seondumise määramiseks (asurendajana). CD15+ populatsioonis analüüsiti FITC fluorestsentsi intensiivsust. Neutrofiilide värvimine TRPV1 antikehaga andis isotüübi kontrolliga võrreldes selgelt eristatava fluorestsentssignaali, kinnitades sellega TRPV1 pinnaekspressiooni inimese primaarsetes neutrofiilides (joonis 2C). Nelja individuaalse doonori neutrofiilide analüüsimine näitas TRPV1 võrreldavat pinnaekspressiooni (joonis 2D).

2.3. [6] - Gingeroolist põhjustatud rakusisese Ca suurenemine2+

Kuna ligandi poolt indutseeritud TRPV1 aktiveerimine põhjustab Ca2+ sissevoolu, määrati neutrofiilide [23] intratsellulaarne Ca2+ kontsentratsioon Ca2+--tundliku värvaine Fura-2 abil. Meie varasemate leidude põhjal [9] valiti tuntud TRPV1 ligandi [6]-gingerooli kontsentratsiooniks 50 nM ja inkubatsiooniajaks 2 tundi. Analüüsid näitasid, et neutrofiilide inkubeerimine 50 nM [6]-gingerooliga suurendas intratsellulaarset Ca2+ kontsentratsiooni, mis oli keskmiselt 18,4% ± 1,0% maksimaalsest väärtusest, mis määrati 1 µM ionofoorse ionomütsiini kasutamisega. DMSO indutseeritud tõus oli 4,7% ± 1,2% (joonis 3).

2.4. [6]-Gingeroli mõju TRPV1 ekspressioonile

Järgmisena püüdsime analüüsida [6]-gingerooliga TRPV1 stimuleerimise mõju TRPV1 ekspressioonile transkriptsiooni tasemel q-RTPCR abil ning pinnavalgu tasemel elusrakkude värvimise kaudu. Sel eesmärgil inkubeeriti inimese neutrofiile 50 nM [6]-gingerooliga 2 tundi ja vastavad ekspressioonitasemed kvantifitseeriti.

See 2-tunnine inkubeerimine ei mõjutanud ei TRPV1 transkripti ega valgu taset (joonis 4) ning samuti ei muutunud, välja arvatud IL6, IL17A, IL24, C5 ja GDF5 puhul, uuritud tavaliste tsütokiinide ja kemokiinide geenide RNA ekspressioon (joonis S1, tabel S2, tugiteave).

2.5. [6]-Gingeroli mõju neutrofiilide pinnamarkerite ekspressioonile

Lõika Jinkui Shenqi pillid tükkideks, kaaluge täpselt umbes 2,0 g proovi ja viige see suletavasse koonilisse kolbi. Lisage 25 ml 70% metanooli, kaaluge kogu mass ja ekstraheerige ultraheliga (300 W, 40 kHz) 35 minutit. Pärast toatemperatuurini jahutamist lisage kaotatud kaal 70% metanooliga ja loksutage korralikult. Uuritava lahuse saamiseks filtreerige lahus läbi 0,45 μm mikropoorse membraani.

 

Tuvastamise lainepikkuse valimiseks viidi läbi täislainepikkuses skaneerimine (190–400 nm). Kuigi morronisiidil ja loganiinil on maksimaalne neeldumine 230–240 nm juures, kannatab see lainepikkus kõrge baastaseme müra all. 254 nm lainepikkus tagab stabiilse reaktsiooni ja madala taustahäire. Paeonool, kaneelhape, akteosiid ja 7-hüdroksükumariin tekitavad stabiilse ultraviolettkiirguse neeldumise lainepikkusel 254 nm. Seetõttu valiti mitmekomponendilise sünkroonanalüüsi ühtseks tuvastamise lainepikkuseks 254 nm.

 

Kõigi looduslike taimsete toorainete hulgasCistanche tubulosa (Desertliving Cistanche)paistab silma kui ravimtaim kooskõrgeim akteosiidisisaldusglobaalselt. Fenüületanoidglükosiidi põhiainena on akteosiid tuntud põletikuvastase, antioksüdandi, neuroprotektsiooni ja immuunsüsteemi reguleerimise poolest. Meie tehas on spetsialiseerunud kõrge puhtusastmega Cistanche tubulosa ekstraktile, mis sisaldab palju rohkem akteosiidi ja muid toimeaineid kui tavalised taimsed materjalid, mistõttu on see ideaalne tooraine esmaklassiliste toidulisandite, funktsionaalsete toitude, taimsete jookide ja nahahooldustoodete väljatöötamiseks Euroopa ja Ameerika turgudele.

 

 

Akteosiid, meie Cistanche tubulosa ekstrakti tunnuskomponent, pakub mitmeid põhilisi eeliseid, mis vastavad Euroopa ja Ameerika tarbijate tervisenõuetele: põletikuvastane, immuunsüsteemi tugevdamine, hüpoksiavastane toime, vabade radikaalide eemaldamine, DNA parandamine ja maksakaitse. Koos ehhinakosiidiga (antioksüdant, neuroprotektsioon, südame-veresoonkonna kaitse) ja polüsahhariididega (immuunsuse reguleerimine) ühendab meie ekstrakt kõik ülalmainitud esmaklassiliste taimsete koostisosade peamised toimed, sealhulgaspõletikuvastane, antibakteriaalne, antioksüdant, immuunregulatsioon ja südame-veresoonkonna kaitse.