Keenia looduslike tsistangetaimede liikide identifitseerimine ja keemilise koostise analüüs
May 14, 2025
Abstraktne:Selles uuringus kasutati Keenias looduslike Cistanche liikide tuvastamiseks taime morfoloogiat, histoloogiat ja DNA vöötkoodi tehnikaid. Peamiste aktiivsete komponentide, sealhulgas fenüületanoidglükosiidide, suhkrualkoholide ja betaiini sisaldus Keeniast pärit looduslikus Cistanche'is määrati HPLC meetodil. Vahepeal viidi läbi sõrmejälgede analüüs. Tulemused näitasid, et Keeniast kogutud metsik Cistanche taim identifitseeriti kui Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. Toimeainete sisaldus naguehhinakosiid,tsistanosiid A, akteosiid, isoakteosiid, ja 2'-atsetüüllakteosiidi C. senegalensises Keeniast olid madalamad kui kodusel C. tubulosa'l, kuid kõrgemad kui kodumaisel C. deserticola'l. Betaiini sisaldus oli sarnane kodumaise C. deserticola omaga, kuid see ei sisalda glükoosi. Sõrmejälje omadused on sarnasemad kodumaise C. tubulosa omadega. See uuring annab aluse ressursside kaitsmiseks, Cistanche ressursi põhjalikuks uurimiseks ja arendamiseks Keenias.
Märksõnad: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenya; liigi määramine; DNA vöötkodeerimine; sisu määramine
Cistanche deserticolaYC Ma
Cistanche, traditsioonilises hiina meditsiinis hinnatud ravimtaim, viitab kõrbetaimede kuivatatud, ketendunud, mahlatele vartele, nagu näiteksCistanche deserticolaYC MajaCistanche tubulosa(Schenk) Wight, mõlemad Orobanchaceae perekonna liikmed. Cistanche on tuntud oma võime poolest toniseerida neeru yangi, toita essentsi ja verd ning niisutada soolestikku, et leevendada kõhukinnisust. Cistanche on Hiina ravimtaimede tekstides tähistatud juba sajandeid. Selle varaseimad meditsiinilised andmed ilmuvad iidses klassikasShennongi Materia Medica klassika, kus Cistanche on klassifitseeritud "kõrgema klassi" ürdiks. Ajaloo jooksul on arvukad traditsioonilised meditsiinitekstid dokumenteerinud Cistanche võimsaid eeliseid, pälvides selle hinnatud hüüdnime "Kõrbe ženšenn".
Cistanche'i mitmekesised farmakoloogilised toimed on tingitud selle bioaktiivsetest ühenditest. Nende hulgas on fenüületanoidglükosiidid peamised toimeained, mis vastutavad Cistanche neere toniseeriva ja luuüdi toitva toime eest. Nendel ühenditel, nagu ehhinakosiid ja akteosiid, on neuroprotektiivne, dementsusevastane, vananemisvastane ja hepatoprotektiivne toime. Nimelt on ehhinakosiid ja akteosiid kaks etalonühendit, mida kasutatakse Cistanche kvaliteedikontrolliks, nagu on täpsustatud Hiina farmakopöa 2020. aasta väljaandes. Lisaks on Cistanche lahtistav toime peamiselt tingitud selle oligosahhariidsetest alkoholikomponentidest, sealhulgas betaiinist, mannitoolist, fruktoosist, glükoosist ja sahharoosist. Neid viit komponenti tunnustatakse laialdaselt kui Cistanche'i võimet soolestikku niisutada ja soolestiku liikumist soodustada.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight
Hiinas on peamised Cistanche liigidCistanche deserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,Cistanche salsa(CA Mey.) G. jaCistanche sinensisG. Beck. Need liigid on levinud sellistes piirkondades nagu Sise-Mongoolia, Ningxia, Gansu ja Xinjiang. Lisaks Loode-Hiinale on Cistanche liigid levinud ka Euraasia ning Põhja- ja Ida-Aafrika kuivades ja kõrbepiirkondades, sealhulgas sellistes riikides nagu Iraan, Afganistan, Keenia, Pakistan ja Mongoolia.
Ida-Aafrikas asuv ja ekvaatori piiril asuv Kenya koosneb enamasti mägismaadest, mille keskmine kõrgus on 1500 meetrit, kuid selle põhjaalad on kõrbed või poolkõrbed. Keenia põlisrahvastel on pikk ajalugu ravimtaimede kasutamisest tervendamiseks. Piirkonnas on rikkalikult ravivat taimestikku – näiteks ekstraktid hambaharjapuu koorest ja juurtest (Salvadora persicaL.) on tuntud oma põletikuvastaste ja antibakteriaalsete omaduste poolest ning neid kasutatakse sageli hambavalu ja infektsioonide raviks. Sandlipuu koor (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) kasutatakse kõhulahtisuse raviks, samas kui Maasai nõgese keedust (Urtica massaicaKergeid br.) lehti kasutatakse kõhuvalu korral. See rikkalik traditsioon on soodustanud elavat ravimtaimekultuuri, kuid majandusarengu väljakutsete tõttu ei ole nende ravimtaimede kasutamist täielikult dokumenteeritud ega süstemaatiliselt uuritud.
Huvitav on see, et Cistanche liike peetakse Aafrikas sageli umbrohtudeks ja neile pole erilist tähelepanu pööratud ega uuritud. Tegelikult pole Aafrika Cistanche kohta peaaegu ühtegi avaldatud uuringut. Vastates Ida-Aafrika kogukonna kuivade ja poolkuivade maade regionaalarengu osakonna kutsele, viis meie uurimisrühm Keenias läbi väliuuringu, et uurida kohalikke Cistanche ressursse. Kogusime looduslikke Cistanche proove, viisime läbi botaanilise identifitseerimise ja analüüsisime nende esmaseid bioaktiivseid ühendeid. Eesmärk oli mõista Keenia Cistanche liigilist mitmekesisust ja arengupotentsiaali ning luua teaduslik alus nende väärtuslike kõrbetaimede edasiseks uurimiseks ja kasutamiseks.
Cistanche tubulosa kuivatatud terve juur Müük Hiinas
Materjalid ja meetodid
Taimsed materjalid
Keeniast pärit metsiku Cistanche isendeid kogusid 2023. aasta augustis Keenias Kajiados asuva Pekingi ülikooli farmaatsiateaduste kooli professorid Pengfei Tu ja Yong Jiang (01 kraad 50'01" S; 36 kraadi 47'00" E). Kaks looduslikku Cistanche taime koguti ja märgistati K1 ja K2 koos nende peremeestaime juurtega (vt joonis 1). Peremeestaime tuvastas Kenya rahvusmuuseumide Ida-Aafrika herbaariumi uurimisassistent Kennedy Matheka.Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, mis kuulub Amaranthaceae perekonda. NäidisedCistanche deserticolajaCistanche tubulosakoguti vastavalt Turpani linnast ja Yutiani maakonnast Xinjiangi Uiguuri autonoomses piirkonnas ning professor Pengfei Tu kinnitas need värskete mahlakate vartena.Cistanche deserticolaYC Ma jaCistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Kõiki vautšeri näidiseid säilitatakse meie laboris.
Instrumendid
Waters Arc HPLC süsteem
Quintix125D-1CN elektrooniline kaal (Sartorius, Peking)
Olympus BX-50 optiline mikroskoop (Olympus, Jaapan)
NanoZoomer-SQ panoraam-slaidi skanner (Hamamatsu Photonics, Jaapan)
KQ500DE digitaalne ultrahelipuhasti (Kunshan Ultrasonic Instruments, Hiina)
MM400 DNA ekstraheerimisveski (Retsch, Saksamaa)
PCR termotsükler (Analytik Jena, Saksamaa)
DYY-8C elektroforeesiaparaat ja -paak (Liuyi instrumenditehas, Peking)
MINI Space 1000 geelpildisüsteem (Tanon, Shanghai)
Konstantse temperatuuriga inkubaator (Yiheng, Shanghai)
Reaktiivid
Ehhinakosiid (partii: DST191008-038), akteosiid (DSTDL006101), isoakteosiid (DST210601-060), D-mannitool (DSTDG006201) osteti ettevõttelt Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.; tubulosiid A (MUST-15040115), 2'-atsetüüllakteosiid (MUST-15071504), betaiin (MUST-23082505), veevaba D-glükoos (MUST-23030214), fruktoos (MUST-23031403) ja sahharoos (MUST-23082505) saadi ettevõttest Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd., PL-klassi metanool (Hacetoniletri, HPLC). OCEANPAK), sipelghape (HPLC klass, VOKA reagendid) olid kõik kromatograafilise puhtusega. Molekulaaranalüüsiks kasutati taimede genoomse DNA ekstraheerimiskomplekti (DP305, Tiangen Biotech, Hiina) ja ülipuhast vett.
Mahlakate varrelõikude ettevalmistamine, värvimine ja vaatlemine
Viites [10] viidatud meetodit järgides lõigati värsked Cistanche mahlakad varred sobiva suurusega ja säilitati FAA fiksaatoris (70% etanool: jää-äädikhape: formaldehüüd=90: 5:5). Pärast fiksaatori jääkide eemaldamiseks jooksva veega pesemist pehmendati kuded vesinikfluoriidhappega, värviti safraniiniga, dehüdreeriti, sisestati parafiini ja lõigati. Pärast paigaldamist slaidid küpsetati, parafiin sulatati ja lõigud värviti 95% etanooli Fast Green lahusega, seejärel suleti neutraalse vaiguga. Kudede morfoloogiat jälgiti mikroskoobi all ja hästi moodustatud lõike skaneeriti panoraamskanneriga, et saada kõrge eraldusvõimega pilte.
DNA ekstraheerimine, PCR amplifikatsioon ja sekveneerimine
Cistanche proovide ja peremeestaimede juurte kogu DNA ekstraheeriti taime genoomse DNA ekstraheerimiskomplekti (Tiangen) abil, järgides tootja protokolli. DNA kontsentratsioone ja OD260/OD280 suhteid mõõdeti mikromahulise UV-spektrofotomeetriga, et hinnata kvaliteeti enne jätkamist.
PCR amplifikatsioon oli suunatud ribosomaalse DNA sisemisele transkribeeritud spacer 2 (ITS2) piirkonnale ja kloroplasti psbA-trnH geenile molekulaarseks tuvastamiseks [11]. Praimeri järjestused olid järgmised:
ITS2 edasi: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'
ITS2 tagurpidi: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'
psbA-trnH edasi: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'
psbA-trnH vastupidine: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'
PCR reaktsioonid (25 μL) sisaldasid 12,5 μL 2× Taq Master Mixi, 1 μL kumbagi päri- ja tagurpidi praimereid (2,5 μmol·L⁻¹), 2 μL DNA matriitsi ja 8,5 μL ddH₂O. ITS2 võimendus: 94 kraadi 5 min; seejärel 35–40 tsüklit 94 kraadi 30 s, 56 kraadi 30 s, 72 kraadi 45 s; lõplik pikendamine 72 kraadi juures 10 min. psbA-trnH võimendus: 95 kraadi 4 min; 35 tsüklit 94 kraadi 30 s, 55 kraadi 1 min, 72 kraadi 1 min; lõplik pikendamine 72 kraadi juures 10 min. PCR tooteid analüüsiti geelelektroforeesiga ja sihtribadele viidi läbi Sangeri kahesuunaline sekveneerimine. Järjestuskromatogramme analüüsiti CodonCode Aligneriga (v3.7.1, CodonCode Co., USA), et saada sihtmärk-DNA järjestused, mis tuvastati Hiina Materia Medica DNA vöötkoodisüsteemi ja BLAST analüüsi abil GenBanki andmebaasis. Fülogeneetilised puud konstrueeriti liikide tuvastamiseks MEGA X tarkvaraga.
Viie fenüületanoidglükosiidi kvantitatiivne määramine
Viie fenüületanoidglükosiidi sisaldus määrati eelnevalt kehtestatud meetoditega [13]. Võrdluslahuste valmistamine: kaalutakse täpselt ehhinakosiid, tubulosiid A, akteosiid, isoakteosiid ja 2'-atsetüüllakteosiid ning lahustatakse 50% metanoolis, et valmistada ettemääratud kontsentratsiooniga segastandardlahus. Kromatograafilised tingimused: Phenomenex Luna C18 kolonn (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); liikuv faas A: atsetonitriil-metanool (6:1, v:v); liikuv faas B: 0,1% sipelghappepuhver; gradientelueerimine: 0–5 min, 10%–18% A; 5–15 min, 18%–24% A; 15–20 min, 24%–26% A; 20–28 min, 26%–30% A; 28–35 min, 30–35% A. Voolukiirus: 1,0 mL·min⁻¹; kolonni temperatuur: 30 kraadi; tuvastamise lainepikkus: 330 nm. Meetod: süstige analüüsimiseks 10 μL standard- ja proovilahust HPLC-sse.
Betaiini, mannitooli, fruktoosi, glükoosi ja sahharoosi kvantitatiivne määramine
Need komponendid kvantifitseeriti vastavalt varasematele meetoditele [14]. Võrdluslahused: kaaluge täpselt betaiini, mannitooli, fruktoosi, glükoosi ja sahharoosi, lahustage segatud standardlahuse valmistamiseks vees. Proovilahused: lahjendage Cistanche proovilahus (valmistatud nagu eespool) 50% metanooliga 1/5 algkontsentratsioonini, segage hästi ja filtreerige läbi 0,22 μm mikropoorse membraani. Kromatograafilised tingimused: Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E kolonn (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); liikuv faas: atsetonitriil-vesi (77:23); voolukiirus: 0,7 ml-min-1; kolonni temperatuur: 25 kraadi ; tuvastamine aurustuva valguse hajumise detektoriga (ELSD): triivtoru temperatuur 100 kraadi, kandegaasi vool 3 L·min⁻¹. Kvantifitseerimiseks süstiti 5 μL ja 10 μL standardlahuseid ja 5 μL proovilahust ning sisu arvutati välise standardse kahepunktilise logaritmilise võrrandi abil.
Sõrmejälgede sarnasuse hindamine
Proovilahused valmistati ülalkirjeldatud viisil ning HPLC tingimused ja meetodid olid samad, mis fenüületanoidglükosiidide kvantifitseerimisel. Kromatograafilised andmed imporditi "Traditsioonilise hiina meditsiini kromatograafilise sõrmejälgede sarnasuse hindamise süsteemi (2012. aasta väljaanne)". Võrdlusena kasutati proovi K1 kromatogrammi, mille viis fenüületanoidglükosiidi piiki märgiti mitmepunktilise korrektsiooni jaoks, genereerides ülekatte- ja võrdluskromatogramme ning arvutades sõrmejälgede sarnasuse.
Tulemused ja analüüs
1. Cistanche morfoloogiline identifitseerimine
Keenias kogutud looduslikel Cistanche isenditel on iseloomulikud morfoloogilised omadused. Õisik on teravik, millel on üks pikk-munaja-lansolaatne kandeleht ja kaks väikest õisikut, mille mõlemad pooled on paljad. Tupp on torujas, tipus on viis tömbi laba. Korolla on torujas-kampanulaadne, 3–4 cm pikkune, umbes 2,5 korda pikem kui tupp, tipus on viis laba ja servad on kõverad. Korolla on kollast värvi (joonis 1A, B), kuivamisel muutub pruuniks. Filamendid on umbes 3 cm pikad, põhjas on mõned õhukesed karvad. Stiil on tolmukatest pisut pikem ja stigma on peaaegu sfääriline, sile ja paljas. Tolmukaid on neli, pikkade munajate tolmukatega, mis on tihedalt kaetud pikkade villaste karvadega; tolmuka põhi on järsult terav. See funktsioon on kooskõlas kirjeldustegaCistanche deserticolajaCistanche salsa"Hiina taimestikus"; seevastu tolmuka alusCistanche tubulosaon nüri ja ümar, mis eristab seda selgelt teistest sama perekonna liikidest [7].
Lisaks on peremeestaim,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz on paljuharuline põõsas. Tema noored oksad on tihedalt kaetud kahvatukollaste või valgete villaste karvadega. Lehed on laialt spaatlikujulised, kitsa põhjaga (joonis 1D, E). Õisikud on tihedalt koondunud piki vart, mis koos õisiku teljega on kaetud hallikasvalgete või kahvatuhallide või valgete villaste karvadega.
Loodusliku Cistanche'i mahlakas vars on lame-silindriline, kahvatukollase või pruunika pinnaga, mis on tihedalt kaetud nõelalaadsete, lihakate, ridadesse paigutatud soomustega. Tekstuur on kindel, kuid veidi painduv (joonis 2A). Mahlase varre ristlõige on kahvatukollane või pruunikas, palja silmaga on nähtavad hajutatud kahvatupruunid veresoonte kimbud (joonis 2B). Mikroskoobi all tunduvad vaskulaarsed kimbud munajad või fusiformsed, koosnevad ksüleemist ja floeemist, esinevad sageli üksikute hajutatud kimpudena või rühmitatuna paaridesse või triodesse, kusjuures floeem on erinevates suundades orienteeritud (joonis 2C, D). Hiina farmakopöa 2025. aasta väljaande kohaselt on läbilõigeCistanche deserticolaon pruunikas, kahvatupruunid täppitaolised vaskulaarsed kimbud, mis paiknevad lainelise ringina, moodustades sageli sisemise volditud rõngakujulise kimbu; vastupidi,Cistanche tubulosakuvab hajutatud punktitaolisi vaskulaarseid kimpe, mis on nende kahte tüüpi Cistanche viilude tuvastamiseks peamine eristav tunnus [1]. Keeniast pärit metsiku Cistanche'i ristlõikes on samuti hajutatud punktitaolisi veresoonte kimpe, mis on kooskõlasCistanche tubulosa.
Joonis 2 Kenya loodusliku Cistanche taime (K2) välimus ja ristlõike omadused. V: varre välimus; B: lihaka varre ristlõige; C: lihava varre parafiiniosa (safraniini kiire roheline värvumine); D: veresoonte kimbu suurendatud vaade parafiini sektsioonis
