Aroomikomponentide ja diferentsiaalsete metaboliitide analüüs Cistanche Musalais's GC-MS ja metaboloomia põhjal

 

Abstraktne:Selles uuringus valmistati Cistanche Musalais traditsioonilisi tehnikaid kasutades Xinjiang Hetiani punaste viinamarjade ja erinevate Cistanche lisanditega. Optimaalsed töötlemistingimused määrati ühesuunalise ANOVA abil. Aroomikomponentide ja diferentseeritud metaboliitide analüüsimiseks kasutati GC-MS-i ja sihtmärgistamata metaboomikat ning kvantifitseeriti aktiivsed koostisosad, nagu flavonoidide koguhulk ja polüfenoolide üldsisaldus. Optimaalsed tingimused olid: algne suhkrusisaldus 32 kraadi Bx, fermentatsioonitemperatuur 25 kraadi ja 7% Cistanche deserticola lisamine. Nendes tingimustes saavutasid alkoholisisaldus, üldhappesus, flavonoidide üldsisaldus ja polüfenoolide üldsisaldus vastavalt (12,6 ± 0,6) mahuprotsenti, (3,82 ± 0,19) g/l, (0,80 ± 0,01) g/l ja (0,60 ± 0,00) g/l. GC-MS tuvastas 38 aroomiühendit, millest kõige levinum klass oli estrid (24 ühendit), millele järgnesid 6 alkoholi, 2 ketooni ja 2 aldehüüdi. Võrreldes ainult viinamarjamahlast valmistatud Musalais'ga, oli Cistanche deserticola Musalais's oluliselt kõrgem peamiste estrite, sealhulgas etüülatsetaadi (6,42% vs. 2.42%) ja etüülpalmitaadi (3,75% vs. 1.18%) sisaldus, samas kui kõrgemate alkoholide, nagu isobutanool, sisaldus vähenes märkimisväärselt (2,2,8%) (v.2.1}%). Metaboloomika tuvastas 230 erinevat metaboliiti (VIP suurem või võrdne 1, P < 0,05), mis on rikastatud ABC transporterite ja aminohapete biosünteesiga seotud radadega. Sellised komponendid nagu trigonelliin ja krotsiin olid oluliselt kõrgemad. Aminohapete metabolism aitas kaasa iseloomuliku maitseprofiili kujunemisele. See uuring annab teoreetilise ja tehnilise aluse Cistanche Musalais arendamiseks ja kvaliteedi parandamiseks. Tulevased uuringud peaksid hõlmama molekulaarseid sensoorseid meetodeid, nagu GC-O, et paremini tuvastada peamised aktiivsed ühendid, mis vastutavad üldise maitseprofiili eest.

Märksõnad: Cistanche;Musalais; GC-MS; metaboloomika

CistancheMusalais

 

 

 

Cistanche Musalais' nimekirja üksikasjad

 

 

 

Musalais (Msalais)on Xinjiangile ainulaadne traditsiooniline kääritatud jook, mis on valmistatud Awati punastest viinamarjadest või Hetian (Hotan) punastest viinamarjadest. Seda valmistatakse mahla pressimise, kontsentreerimise ja spontaanse kääritamise teel ning seda iseloomustatakse kui primitiivset, looduslikku ja rohelist. Kuna Musalais on ainulaadne Hiina looduslikult kääritatud alkohoolne jook, sellel on sensoorsete omaduste, toiteväärtuse ja funktsionaalse tegevuse osas erinevad piirkondlikud omadused. Käärimisel tekkivad alkoholid, estrid, aldehüüdid, happed, fenoolid ja terpeenid ei anna mitte ainult ainulaadset maitset, vaid on seotud ka selliste eelistega nagu vereringe soodustamine, vere lipiidide sisalduse alandamine, neerude toniseerimine ja keha tugevdamine, kolesterooli reguleerimine ning südame- ja ajuveresoonkonna tervise säilitamine, mistõttu sobib see erinevas vanuses tarbijatele [1].

Viimastel aastatel, kui tarbijate nõudlus tervislike jookide järele on kasvanud, on funktsionaalse likööri turg kiiresti laienenud. Traditsioonilise õllepruulimise põhjal sisaldavad funktsionaalsed liköörid spetsiifilisi funktsionaalseid komponente, mis vastavad heaolu, tervise säilitamise või spetsiifilise füsioloogilise regulatsiooni vajadustele. Nende kvaliteeti mõjutavad toorained, protsessid, mikroobikooslused ja funktsionaalsete komponentide stabiilsus [2]. Lõuna-Xinjiangi rahvapraktikas lisatakse Musalais' valmistamise ajal sageli kohalikke lisaaineid, nagu goji marjad, safloor, Cistanche ja safran, et suurendada kasu tervisele ja rikastada maitse mitmekesisust [3]. Nende hulgas on polüsahhariidide, aminohapete, fenüületanoidglükosiidide, iridoidglükosiidide ja alkaloidide poolest rikas Cistanche, millel on toniseeriv toime neerude yangile, moduleerib neuroendokriinset funktsiooni ja võitleb väsimusega, pälvides nimetuse "kõrbe ženšenn" [4–5].

Cistanche Musalais' industrialiseerimine seisab aga praegu silmitsi väljakutsetega, sealhulgas tootmisstandardite puudumine, mittetäielik töötlemistehnoloogia ja maitseainete ebapiisavad uuringud, mis piiravad selle turu edendamist ja kvaliteedi parandamist. Selles uuringus kasutati Cistanche'i lisandina Musalais' fermentatsiooniprotsessi optimeerimiseks. GC-MS-i ja sihtmärgistamata metaboomikat kasutati aroomi koostisosade ja erinevate metaboliitide süstemaatiliseks lahendamiseks, eesmärgiga luua teoreetiline alus ja tehniline tugi Cistanche Musalais standardiseeritud tootmiseks, maitse moduleerimiseks ja funktsionaalseks täiustamiseks, edendades seeläbi selle traditsioonilise joogi moderniseerimist ja väärtuse arendamist.

1 Materjalid ja meetodid

 

1.1 Materjalid ja reaktiivid

 

Cistanche tubulosa (torukujuline Cistanche): esimese klassi kommertseksemplarid, mis on pärit Hetianist (Hotan), Xinjiangist, lihava tekstuuriga ning ilma hallituse ja lisanditeta.

Hetiani punased viinamarjad: terve välimuse ja tugeva aroomiga kaubanduslikud puuviljad, pärit Hetianist, Xinjiangist.

Metanool ja atsetonitriil: Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.

Sipelghape: TCI (Shanghai) Development Co., Ltd.

L-2-klorofenüülalaniin: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.

 

1.2 Instrumendid ja seadmed

 

08-2T konstantse temperatuuriga magnetsegisti, Shanghai Meiyingpu Instrument Co., Ltd.

57330-U SPME seade ja 57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME kiud, Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

6890N-5973 GC–MS süsteem, Agilent Technologies (China) Co., Ltd.

5430R jahutatud tsentrifuug, Eppendorf (Shanghai) International Trading Co., Ltd.

TL-48R suure läbilaskevõimega koeveski, Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.

Vaakumkontsentraator SCIENTZ-1LS, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.

Vanquish Flex UHPLC, Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.

SDAJ-0.5 Hiina stiilis veini tootmisliin, Shandong Anji Bio-Fermentation Equipment Technology Co., Ltd.

1.3 Katsemeetodid

 

1.3.1 Protsessi voog

Cistanche aurutati hilisemaks kasutamiseks. Heti punased viinamarjad pesti ja selekteeriti, eemaldati varred ja purustati. Viinamarjamahl ekstraheeriti pressi abil, seejärel kuumutati ja kontsentreeriti, et reguleerida mahla kontsentratsiooni indikaatoreid. Lõpuks segati aurutatud Cistanche toode kontsentreeritud viinamarjamahlaga ja fermenteeriti kontrollitud temperatuuri ja aja parameetritega. Pärast kääritamist puhastati toode, et saada Cistanche Musalais.

 

1.3.2 Cistanche valmistamine

Väiksemate muudatustega Gongi jt. [6], kvaliteetne, riknemata kuivatatud Cistanche kooriti, viilutati, mähiti marli ja aurutati 20 minutit hilisemaks kasutamiseks.

 

1.3.3 Viinamarjamahla valmistamine

Kasutati Hetiani punaseid viinamarju, mille lahustuva tahke aine (suhkru) algväärtus oli 18 kraadi Bx. Mädanenud, riknenud ja ebaühtlaselt küpsenud viinamarjad eemaldati. Peale pesemist ja koorimist pressiti viinamarjad. Mahl keedeti (kontsentreeriti) kõrgel temperatuuril ja kontsentreerimine peatati, kui suhkur saavutas 26, 29 või 32 kraadi Bx. Mahl jahutati hilisemaks kasutamiseks toatemperatuurini.

 

1.3.4 Cistanche Musalais' fermentatsiooniprotsess

Aurutatud Cistanche lisati kindlaksmääratud vahekorras (3%, 5%, 7%) 600 ml kontsentreeritud viinamarjamahlale fermenteris. Kääritamise ajal mõõdeti jääksuhkrut iga 24 tunni järel, et jälgida edenemist. Kui jääksuhkru tase langes 4 g/l-ni, käärimine lõpetati. Supernatant koguti ja pastöriseeriti 85 kraadi juures 30 minutit, et saada Cistanche Musalais.

1.3.5 Cistanche Musalais' ühe teguri eksperimentaalne disain

Uuriti Cistanche lisamise (3%, 5%, 7%), esialgse suhkrusisalduse (26, 29, 32 kraadi Bx) ja fermentatsioonitemperatuuri (22, 25, 28 kraadi) mõju füüsikalis-keemilistele omadustele ja bioaktiivsusele.

 

1.3.6 Analüüsid ja mõõtmised

 

Alkoholisisaldus, lahustuvad tahked ained ja üldhappesus: määratud vastavalt GB/T 15038-2006 "Veini ja puuviljaveini üldised analüütilised meetodid".

Flavonoidide üldsisaldus: määratud viitega Xu et al. [7]. Kalibreerimiskõver koostati rutiini kontsentratsiooniga (X) abstsissina ja neeldumisega (Y) lainepikkusel 510 nm ordinaatteljega, saades Y=0.8043X − 0,0278, R2=0.9999, mis näitab head lineaarsust.

Polüfenoolide üldsisaldus: määratakse Folin-Ciocalteu meetodil [8]. Koostati kalibreerimiskõver, mille abstsiss oli gallushappe sisaldus (X) ja ordinaatteljeks oli neelduvus (Y) lainepikkusel 760 nm, saades Y=0.4177X + 0.1048, R2=0.9975, mis näitab head lineaarsust.

 

1.3.7 GC-MS analüüs

Proovid kahest rühmast - eksperimentaalsed (32 kraadi Bx, 25 kraadi, 7% Cistanche) ja kontrollist ilma Cistancheta - allutati GC-MS-le.

Proovi eeltöötlus: proov pandi 20 ml ekstraheerimisviaali; Sisestandardina lisati 100 µl 50 ug/ml isoamüülfenüülatsetaati. Viaal suleti ja tasakaalustati 60-kraadises veevannis magnetsegamisega kiirusel 250 p/min 20 minutit. Seejärel sisestati SPME kiud 30 minutiks ekstraheerimiseks. Enne kasutamist konditsioneeriti SPME kiudu GC sisselaskeava juures 250 kraadi juures 20 minutit.

GC-MS tingimused: HP-INNOWax kolonn (60 m × 250 μm × 0,25 μm); sisselaskeava 250 kraadi; ülekandeliin 250 kraadi ; kandegaasi vool 1,5 ml/min; jagas 4:1. Ahju programm: 40 kraadi (5 min), ramp 5 kraadi /min kuni 250 kraadi, hoidke 10 min. Iooniallikas 230 kraadi ; kvadrupool 150 kraadi ; EI 70 eV; täielik skaneerimine 35–550 Da.

 

1.3.8 Sihtmärgistamata ainevahetus

 

1.3.8.1 Proovi ettevalmistamine

Testiti kahte rühma: eksperimentaalne (32 kraadi Bx, 25 kraadi, 7% Cistanche) ja kontroll ilma Cistancheta; n=3 bioloogilist kordust rühma kohta, kokku 6 proovi. Pärast sulatamist ja keerisega segamist viidi 300 µl igast proovist 1,5 ml katsutisse ja tsentrifuugiti kiirusel 12 000 p/min, 4 kraadi juures 15 minutit. Seejärel viidi 100 µl supernatanti 2 ml tuubi, külmutati vedelas lämmastikus ja lüofiliseeriti. Lisage 1 ml eeljahutatud metanool:atsetonitriil (1:1, maht/maht), segage 30 s; külmutada -20 kraadi juures 30 minutit; tsentrifuugida kiirusel 12 000 p/min, 4 kraadi juures 10 minutit; koguda 850 µl supernatanti ja kuivatada vaakum täielikult; lahustada 150 μL 50% metanoolis (5 ppm 2-klorofenüülalaniiniga), segada 30 s; tsentrifuugige 12 000 p/min, 4 kraadi 10 min; filtreerige läbi 0,22 μm membraani ja kandke filtraat viaalidesse. Kombineerige igast proovist 10–20 μL, et luua kvaliteedikontrolli proov, et hinnata instrumendi stabiilsust ja andmete usaldusväärsust; QC jäetakse välja, kui kaasatakse vähem kui 5 proovi.

 

1.3.8.2 Analüütilised tingimused

Kromatograafia: ACQUITY UPLC HSS T3 kolonn (100 Å, 1,8 μm, 2,1 mm × 100 mm); voolukiirus 0,4 ml/min; sammas 40 kraadi ; autosampler 8 kraadi ; süstimine 2 μL. Liikuv faas A: vesi 0,1% (maht/maht) sipelghappega; liikuv faas B: atsetonitriil 0,1% (maht/maht) sipelghappega.
Massispektromeetria: pihustuspinge +3.5 kV/−3,0 kV; mantligaas 40 arb; abigaas 10 arb; kapillaar 320 kraadi ; abigaasi temp 300 kraadi ; MS1 eraldusvõime 60 000; skaneerimisvahemik m/z 70–1000; AGC sihtstandard; Max IT 100 ms; andmetest sõltuv MS/MS neljal ülemisel ioonil dünaamilise välistusega 4 s; MS2 eraldusvõime 15 000; HCD kokkupõrkeenergia 30%.

 

1.3.8.3 Metaboliitide tuvastamine

Metaboliitide identifitseerimine põhines PSNGM-il (PerSonalbio Next-Generation Metabolomics Database), mis koosnes ettevõttesisesest standardite teegist mzCloud (https://www.mzcloud.org/), LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/), HMDB (https://hmdb.ca/), Moadaucehnedfi (https://hmdb.ca/), Moa.labdauc.fi. NIST_2020_MSMS ja AI-prognoositud MS/MS spektriteek.

Märkus annotatsioonis kasutatavate väliste andmebaaside kohta:

HMDB: põhjalik inimese ainevahetuse andmebaas (versioon 5.0), mis sisaldab üksikasjalikku keemilist, kliinilist ja biokeemilist teavet 220 945 metaboliidi kohta koos ulatuslike ristsidemetega KEGG, PubChemi, MetaCyci, ChEBI, PDB, UniProti ja GenBankiga ning toetab täpsemat teksti-/järjestus-/MS-i spektriotsingut. Seotud ka DrugBanki, T3DB, SMPDB ja FooDB-ga.

LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50 000 kureeritud lipiidistruktuuri), spektrid, rajad, MS analüüsi tööriistad, struktuuride joonistamine ja nomenklatuuri/klassifikatsiooni ressursid.

mzCloud: täiustatud massispektri raamatukogu, mis toetab spektri-, struktuuri-, alamstruktuuri-, puu- ja m/z-põhiseid otsinguid, 32 330 ühendi, 51 002 spektripuu ja 16 531 567 spektriga (koos oluliste täiendustega 2024. aastal), optimeeritud Firefoxi/Chrome'i töölauale juurdepääsu jaoks.

 

1.3.8.4 Mitmemõõtmeline statistiline analüüs

PCA teostamiseks rakendati 6 proovi metaboliitide andmetele mitme muutujaga analüüse, selgitades Cistanche Musalais' ja Musalais' metaboolseid erinevusi. Erinevaid metaboliite rühmade lõikes skriiniti, kasutades OPLS-DA muutuvat tähtsust projektsioonis (VIP), kordade muutust ja P väärtusi (VIP lävi ja olulisus nagu ülal), millele järgnes bioloogiline tõlgendus, sealhulgas KEGG raja rikastamine [9].

 

Viited

[1] Zhu LX, Wang LL, Song HZ jt. Peamiste aroomiühendite kvalitatiivne analüüs, mis on seotud traditsioonilise Musalais töötlemisega Hiinas Xinjiangis. Journal of the Institute of Brewing. 2012;118(2):236–242.
[2] Zhao B, Li DD, Yuan Y jt. Kääritatud funktsionaalse vedeliku kaasaegsed uuringud. Alkoholi valmistamine. 2025;52(2):43–49.
[3] Zhu LX, Hou XJ, Xu Q. Arutelu Xinjiang Msalais viinamarjaveini arendusstrateegiate üle. Alkoholitootmise teadus ja tehnoloogia. 2008(7): 111–113.
[4] Laul ZH, Lei L, Tu PF. Cistanche Hoffingi taimede farmakoloogilise aktiivsuse uurimise edusammud. et link. Hiina traditsioonilised ja taimsed ravimid. 2003;34(9):U018.
[5] Shi TT, Ge WH. Cistanche Hoffmg uurimistöö. Et Link. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy. 2009;18(9):7–9.
[6] Gong X, Zhong T, Zhou JY jt. Uue fermenteeritud Cistanche veini tehnoloogia uuring. Kaasaegne toit. 2019(5):64–68;79.
[7] Xu HT, Li H, Zhao YZ jt. Nervilia fordii flavonoidide antioksüdant ja antibakteriaalne toime. Põhja aiandus. 2017(16): 161–165.
[8] Yu H, Xu X, Hao JX jt. Tsitrusviljade koorejääkide segakääritamine Trichoderma koningii, Aspergillus oryzae ja Lactobacillus casei'ga: protsessi optimeerimine, antioksüdantsed aktiivsused ja mittesihipärane metaboolne analüüs. Food Bioscience. 2025;66:106180.
[9] Zhou JN, Hou DH, Zou WQ jt. Metsiku Ophiocordyceps sinensise laialdaselt sihitud metaboloomika ja mittesihipärase metaboloomika võrdlus. Molekulid. 2022;27(11):3645.
[10] Li XH. Rosa kwangsiensis var. steriliseeritud fermenteeritud vein [magistritöö]. Chongqing: Edelaülikool; 2017. aasta.
[11] Li ZJ, Zhang XD, Long BX jt. Msalais pirni tootearenduse ja reaktsioonipinna optimeerimise uuringud. Põllumajandustoodete töötlemine. 2025;3:1–10.
[12] Zhang L, Jiang XF. Vase määramismeetodi kohandatavuse kontrollimine veini ja puuviljaveini üldises analüüsimeetodis GB/T15038-2006. Alkoholi valmistamine. 2020;47(5):104–107.
[13] Zhong DL, Yang H, Wang Z jt. Malolaktilise käärimistemperatuuri mõju Cabernet Sauvignoni veini kvaliteedile. Zhejiangi põllumajandusteadused. 2025;66(7):1724–1732.