Cistanche deserticola polüsahhariidid nõrgendavad hiirtel diabeetilist nefropaatiat, mõjutades soolestiku taimestikku ja pärssides teemaksutaolist retseptori 4/tuumafaktori signaaliülekande rada

Kokkuvõte: Selle uuringu eesmärk oli uurida leevendavat toimet jaCistanche Derticola polüsahhariidide (CDP) potentsiaalne mehhanismedasidiabeetiline nefropaatia (DN)hiirtel. DN -hiiremudel loodi kõrge rasvasisaldusega dieedi (HFD) söötmise teel koos streptozototsiini (STZ) intraperitoneaalse süstimisega. Kolmkümmend kuus C57BL/6N isaseid hiiri jagati juhuslikult kuue rühma (N=6 igaüks). Kõiki rühmi manustati suuliselt destilleeritud veega (kontroll ja mudel), dapagliflosiin või CDP -d 4 nädala jooksul. Füsioloogiliste indeksite muutused, neerufunktsioon,põletikulised teguridja hinnati soolestiku mikrobiota. Tulemused näitasid, et CDP -d parandasid märkimisväärselt üldist seisundit ja nõrgendasidneeru histopatoloogilised muutusedjavähendas veresuhkru taset, uriini valkjapõletikulised teguridDN -hiirtes. Lisaks mõjutasid CDP -d soolestiku mikrobiota tasakaalu, suurendasid kasulike bakterite arvukust ja vähendasid potentsiaalseid patogeenseid baktereid, mis omakorda parandas soolebarjääri funktsiooni. CDP-d pärssisid ka teemaksu-sarnase retseptori 4/tuumafaktori (TLR4/NF-κB) signaaliülekande raja aktiveerimist ja vähendas lipopolüsahhariidi (LPS) vabanemist. Kokkuvõtteks võib öelda, et CDP -del on hiirte DN -ile leevendav toime, mõjutades soolestiku mikrobiotat ja pärssides põletikulisi signaaliülekande teid. See leid pakub uusi teadmisi DN -i ravi kohta.

 

Märksõnad: Cistanche Derticola polüsahhariidid;diabeetiline nefropaatia;; soolebarjäär; Soolefloora; Tollitaoline retseptor 4; tuumafaktor-κB

 

Cistanche Derticola ekstrakt kvaliteetsete toorainega

Lisateabe saamiseks klõpsake

 

 

 

Diabeedi nefropaatia (DN)on lõppstaadiumis neeruhaiguse peamine põhjus ja ohustab tõsiselt patsientide elu ja tervist [1]. Uuringud on kinnitanud, et soolestiku taimestiku tasakaalustamatus mängib olulist patogeenset rolli diabeedi protsessis, mis areneb DN -ks [2-3]. "Gut-Kidney telje" teooria usub, et muutused soolestiku mikrokeskkonnas võivad mõjutada kroonilise neeruhaiguse progresseerumist, reguleerides otse soolestiku metaboliite [{2-3]. Soolefloora mängib olulist rolli neerufunktsiooni reguleerimisel DN -hiiremudelites [4-5]. "Gut-Kidney telje" põhjalikud uuringud aitavad selgitada DN-i patogeneesi ja avastada uusi eesmärke ennetamise ja ravi jaoks.
Cistanche Derticola on traditsiooniline ravim- ja söödav taim, tuntud ka kui Cistanche Derticola, Dijing, Jinsun jne, mis on üldtuntud kui Dayun, ja sellel on "Desert Ginseng" maine [6]. Hiina Rahvavabariigi farmakopöa andmetel on Cistanche Derticola kuivatatud lihav vars Cistanche Derticola yc Ma või C. Tubulosa (Schenk) Wight, perekonna Cistenche'i perekonna Oroobaceae peretaimega.
Nende hulgas on Cistanche Derticolal pikk ajalugu nii ravimina kui ka toiduna. Cistanche Derticola on magus, soolane ja soe oma olemuselt ning siseneb neeru- ja suur soole meridiaanidesse. Sellel on neerude yangi toonimine, mis on kasuks olemusest ja verest ning soolestiku niisutamisest ja kõhukinnisuse leevendamisest [7-8]. Polüsahhariidid on Cistanche Derticola üks peamisi toimeaineid. Polüsahhariidide sisaldus Cistanche Derticola veeekstraktis on suhteliselt kõrge. See koosneb peamiselt monosahhariididest nagu glükoos, galaktoos, ramnoos, arabinoos ja fruktoos. Sellel on palju farmakoloogilisi mõjusid, näiteks immuunsuse aktiivsuse reguleerimine, vananemisvastane, õppimine ja mälu parandamine, närvide kaitsmine, maksakahjustuste vastupanu, viirusetõrje ja kasvajavastane [{9-12]. Varasemad uurimisrühma uuringud on näidanud, et Cistanche Deserticola veeekstraktil on DN -le potentsiaalne terapeutiline mõju [13]. Selle põhjal võttis see eksperiment lähtepunktina soolestiku taimestikku ja põletikulist vastust Cistanche Derticola polüsahhariidide (CDP) mõju hiirte DN -i parandamisele ja neerufunktsiooni taastamisele, et anda teaduslik alus CDP -de rollile DN -i raviks.

1 materjalid ja meetodid

1.1 Loomad, materjalid ja reagendid

36 6- nädalavanused C57BL/6J isased hiired osteti Xinjiangi meditsiiniülikooli loomade eksperimendi keskusest, loomade tootmise litsents nr: scxk (xin) 2023-0006; Eetika eraldusvõime nr: IACUC -20210331-04.
Desert CDPS (polüsahhariidide massiosa ＞ 80%, partii arv: 2306019) Shaanxi Xintianyu ettevõte; Dapagliflozin (DAPA; partii number: 2108119) Astrazeneca Pharmaceuticals Co., Ltd; Uriini koguvalk (uriini koguvalk, UTP; partiiinumber: C 035-2-1), uurea lämmastik (vere uurea lämmastik, Bun; partii arv: C 013-2-1), kreatiniin (kreatiniin, cre; partii number: c {5}}, uric (uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricid, uricAc, uricac, uricac, uricac, uicAc, uricAc, urica Kit Nanjing Jianchengi bioinseneri instituut; lipopolysachariid (lps; partii number: yx -121619 m), interleukin -6 (il -6; partii number: yx-e20012), IL -1 (pakkide arv: YX-E2053); YX-E20217), tuumori nekroosifaktor- (TNF-; partii arv: YX-E20220) Kit Shanghai Youxuan Biological Co., Ltd.; Täiustatud kemoluminestseeni (ECL) Kit Peking Pulilai Gene Technology Co., Ltd.; Streptozotocin (STZ; partii arv: 20230503), kõrge rasvasisaldusega dieet (60% rasvade suhe rasvasisaldusega dieet puhastatud tüüp, materjali arv: Boaigang12492M) Peking Boaigang Biotechnology Co., Ltd.
Põhisööt (mis sisaldab 22% maisijahu, 12% kliini, 18% õlijääki, 8% kalajahu, 12% sojaoa sööki, 0. 17% soola, 0. 25% vitamiine, 0}. 25% Trace Elements Wedation Stone Cod -naftaga ja 2% Stone Cod -nagi. Xinjiangi meditsiiniülikool.

 

1.2 instrumendid ja seadmed

AE240 analüütiline tasakaal, Mettler-Toledo Instrument Co., Ltd., Šveits; DHG -9053 elektriline kuumutamiskuivatusahi, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.; DK-S22 pidev temperatuurivann, Shanghai Jinghong Experimental Instrument Co., Ltd.; 3-18 Ks kiire madala temperatuuriga tsentrifuugi, Sigmaaldrich, USA; Bs -380 täisautomaatse biokeemilise analüsaatori, Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.; EM KMR3 SLICER, HI1220 Slicer, Leitz Optiluxi digitaalne mikroskoop, Leica, Saksamaa; Fluorchem E Chemiluminestsentsi pildistamissüsteem, USA -d, USA.

1.3 meetodid

1.3.1 Loomkatse

36 C57BL/6J meessoost hiiri söödeti Xinjiangi meditsiiniülikooli SPF -i laboris ja neid toideti vabalt. Katse viidi läbi pärast 7 -päevast adaptiivset söötmist. Kuus hiiri valiti juhuslikult normaalseks (kontrollrühmaks) ja neile anti põhiedieedi. Ülejäänud eksperimentaalrühmad söödeti kõrge rasvasisaldusega dieeti ja hoiti eraldi puurides. Kehakaalu testiti kord nädalas. Hiired said vabalt vett süüa ja juua. Pärast 6-nädalast kõrge rasvasisaldusega dieedi söötmist süstiti eksperimentaalrühma hiired STZ 4 0 mg/kg intraperitoneaalselt 5 päeva jooksul lisaks tasuta kõrge rasvasisaldusega dieedile. Pärast modelleerimist oli paastuv veresuhkrut 11,1 mmol/l, mida peeti edukaks diabeedi mudeliks. Kolmkümmend eduka modelleerimisega hiirt jagati juhuslikult viieks rühmaks, igas rühmas oli kuus hiirt, nimelt mudel (destilleeritud vesi + kõrge rasvasisaldusega dieet, mudel) rühm, DAPA (DAPA 4 mg/kg + kõrge rasvasisaldusega dieet, DAPA) rühm, CDPS-i madala annusega (50 mg/kg + kõrge rasvasisaldusega dieet, CDPS-L-DOSE (100 MG-d), CDPS-DOS (100 MG-d ja 100 mg-d. CDP-d suure annuse (200 mg/kg + kõrge rasvasisaldusega dieet, CDPS-H) rühm. Kontrollrühmale (destilleeritud vesi + normaalne dieet) anti võrdses koguses destilleeritud vett. Iga hiire asus kiirusel 0,1 ml/10 g, üks kord päevas korraga, kokku 4 nädalat. Hiirte kehakaalu ja vere glükoosisisalduse muutused registreeriti nädalas.

1.3.2 Indeksi määramine

Pärast 4 -nädalast gavage'i manustamist koguti 4. nädala lõpus metaboolsete puuride kaudu uriiniproovid (24 tundi) ja värskeid väljaheiteid ja salvestati vastavalt -20 ja vastavalt -80 kraadi. Hiired olid tühjatud, kuid neid ei kastetud 12 tundi. Järgmisel päeval mõõdeti hiirte paastu kehakaal. Hiired tuimastati 3 ml/kg 10% kloraalse hüdraadi lahuse intraperitoneaalse süstimisega. Veri koguti orbiitidest ja tsentrifuugiti tsentrifuugis (4 kraadi, 3 500 r/min) 15 minutit. Supernatant oli hilisemaks kasutamiseks aspireeritud, pakendatud ja salvestatud -80 külmkapis. Seerumit mõõdeti BUN, CRE, UA, IL -6, IL -1, TGF-, TNF- ja LPS jaoks vastavalt komplektile. Uriini mõõdeti komplekti järgi 24 tunni jooksul.

 

1.3.3 neeru ja soolestiku morfoloogiline ja patoloogiline vaatlus

1.3.3.1 neerude koefitsiendi määramine

Pärast vere kogumist tuimastati hiired üledoosiga surnuks ning neerud ja koolonid eemaldati täielikult ning loputati kohe jahutatud soolalahusega, tühjendati filterpaberile ja kaaluti. Neerude koefitsient arvutati vastavalt järgmisele valemile: neerude koefitsient/%= × 100 m1m, kus M1 on neeru/g märg kaal; m on hiire kehakaal/g.

 

1.3.3.2 Neeru patoloogiline vaatlus

Hiire neerud fikseeriti 4% paraformaldehüüdi fikseeritavas, dehüdreeriti etanoolilahuse gradiendiga, läbipaistvalt ksüleeniga, manustatud parafiini, viilutatud (paksus 2 μM), ksüleeniga dewaxed, ja hüdreeriti etanoolilahuse abil ja seejärel paisutati hemotoksüliini ja eosiiniga (h & e), ja eosiiniga (h & e), h & e), ja e), H & E), H & E), ja E), H & E), ja E), H & E), H & E), ja E), H & E) pitseeritud ja pildid koguti ja jälgiti mikroskoobi all.

 

1.3.3.3 soolepatoloogiline vaatlus

Hiire soolestik fikseeriti 4% paraformaldehüüdi fikseeritavaga, dehüdreeriti etanoolilahusega gradiendiga, läbipaistvalt ksüleeniga, manustatud parafiini, viilutatud (paksus 2 μM), ksüleeniga dehaditud ja hüdreeriti etanoolgradiendiga, mis oli siis maadikradiendiga, mis on alla suudletud, ja pletallid.

 

 

1.3.4 Soolefloora kompositsiooni analüüs

Hiirte käärsoole sisaldus kontrollrühmas, mudelirühmas ja CDPS-H rühmas tuvastati 16S rRNA geeni suure läbilaskevõime järjestamise abil. DNA ekstraheerimise ja raamatukogu ehitamine ja mikroorganismide järjestamine käärsoole sisalduses viis Lianchuan Biotechnology Co., Ltd. ning saadud andmeid analüüsiti Lianchuani pilveplatvormil.

 

1.3.5 Neerude ja käärsoolega seotud valgu ekspressiooni tuvastamine

Hiire neeru- ja käärsoolekude valgud ekstraheeriti ning valk kvantifitseeriti bitsiinkoniinhappe valgu kvantifitseerimise meetodil. Pärast valgu denatureerimist hoiti valku -20 kraadi külmkapis. 10% naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesi, polüvinülideeni difluoriidimembraani ülekandmine, membraan pandi Tris puhverdatud soolalahusesse tween -20 (TBST) inkubatsioonipaagiga ja blokeeriti toatemperatuuril. Avastamine
Primaarsed antikehad Tollitaoliste retseptorite (TLR) 4, tuuma transkriptsioonifaktori (NF) -κB p65, p-nf-κBP65 ja -aktiini neerukoes (antikeha lahjendatud 1: 2 000 (v/v) TBST lahuse ja okludiini ja zonulaga) {10 {{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{10}. (Zo -1) käärsoolekoes (antikeha lahjendatud 1: 1 000 (v/v) koos TBST -lahusega) inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures. TBST lahjendus, sekundaarne antikeha (antikeha
Lahjendatud TBST lahusega 1∶ 2 000 (V/V)), inkubeeriti toatemperatuuril 1 tund, pestakse TBST -ga 3 korda ja tuvastati seejärel ECL luminestsentsreakti lisamisega ja valkude ekspressiooni tuvastamiseks kasutati geeli kuvamist. -actiini kasutati sisemise võrdlusena ja valguhalli väärtust analüüsiti tarkvara ImageJ abil. Iga rühma valgu ekspressiooni väljendati kontrollrühma halli väärtuse suhtelise väärtusena.

 

1.4 Andmestatistika

Kõik andmete tulemused väljendati kui ± S ja SPSS 21. 0 kasutati statistiliseks analüüsiks. Pidevate andmete jaoks kasutati rühmadevahelise võrdluse jaoks normaalse jaotuse järgimist dispersioonanalüüsi. Kui erinevus rühmade vahel oli statistiliselt oluline, kasutati kalkuni meetodit lisaks võrdluseks; Kui andmed järgnesid normaalsele jaotusele, kasutati rühmadevahelise võrdluseks Kruskal-Wallis H testi. Kui rühmade vahel oli statistilist erinevust, kasutati Durbini kõige olulisema erinevuse meetodit lisaks mitmele võrdlusele. P <0. 05 näitas, et erinevus oli statistiliselt oluline.

 

 

2 tulemused ja analüüs

2.1 CDP -de mõju vere glükoosisisaldusele, kehakaalule ja neerude koefitsiendile C57BL/6J

Nagu tabelitest 1 kuni 3 võib näha, võrreldes kontrollrühmaga, suurenes hiirte vere glükoos mudeli rühmas märkimisväärselt (P<0.01), and the kidney coefficient was significantly increased (P<0.01); compared with the Model group, CDPs- The body weight of mice in group H increased significantly after 4 weeks of administration (P＜0.05), and blood sugar began to decrease after 3 weeks of administration (P＜0.05). The kidney coefficient of mice in each intervention group decreased, and the CDPs-H group was the lowest (P<0.01); the body weight of mice in the Control group was larger than that of each group, indicating that CDPs can slow down the swelling of the kidneys of DN mice, thereby Reduce the kidney coefficient.

 

Tabel 1 CDP -de mõju hiirte veresuhkrule (n=6)

Rühmitus	Aeg/nädal
	0	1	2	3	4
Kontroll	7.98±0.55	7.32±0.40	7.58±0.50	7.38±0.87	7.28±0.34
Mudel	10.62±2.79#	20.32±2.69#	24.47±4.18#	24.92±3.98#	20.33±2.96#
CDPS-L	16.03±2.97	21.83±4.81	20.13±6.97	23.30±3.77	21.25±1.65
CDPS-M	13.17±3.59	22.6±5.88	19.35±4.45	22.6±4.87	18.38±1.20
CDPS-H	11.07±1.74	21.53±3.71	21.57±6.19	17.43±2.05**	15.87±0.90**
Dapa	10.28±4.75	21.12±4.96	17.72±2.00**	17.35±2.00**	14.55±1.06**

Üksus: MMOL/L

 

Tabel 2 CDP -de mõjud hiirte neeruindeksile (n=6)

 

Rühmitus	Kontroll	Mudel	CDPS-L	CDPS-M	CDPS-H	Dapa
Neeru/kehakaal %	0.98±0.04	1.69±0.17##	1.42±0.12	1.37±0.10*	1.28±0.10**	1.18±0.10**

 

Tabel 3 CDP -de mõju hiirte kehamassile (n=6)

 

Rühmitus	Aeg/nädal
	0	1	2	3	4
Kontroll	28.57±0.82	28.75±0.97	28.70±0.79	29.10±1.24	29.32±1.35
Mudel	24.53±1.25##	24.92±1.20##	24.35±1.39##	24.82±1.22##	24.73±1.56##
CDPS-L	25.75±0.69	24.77±0.91	24.83±0.99	25.10±0.83	25.42±0.97
CDPS-M	25.10±0.56	25.00±0.54	24.68±0.48	25.13±0.62	25.25±0.58
CDPS-H	25.38±0.28	25.43±0.49	25.52±0.62	25.73±0.50	26.08±0.34*
Dapa	25.13±1.02	25.52±0.98	25.97±1.00*	26.25±0.63*	26.63±0.78*

 

 

2.2 CDP -de mõju C57BL/6J hiirte neerufunktsioonile

Nagu on näidatud tabelis 4, võrreldes kontrollrühmaga, suurenesid BUN, CRE ja UA kontsentratsioonid seerumis ja 24 -tunnise UTP massi kontsentratsiooni hiirte uriinis mudelirühmas märkimisväärselt (P<0.01); compared with the Model group, CDPs-M and CDPs-H can significantly reduce the concentrations of BUN, Cre, and UA in serum and the 24-hour UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01). CDPs-L can significantly reduce the concentrations of BUN and UA in mouse serum. and 24 h UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01).

 

Tabel 4 CDP -de mõjud BUN, CRE, UA ja 24 H UTP -le DN -hiirtel (n=6)

Rühmitus	BUN -i kontsentratsioon (MMOL/L)	CRE kontsentratsioon (μmol/L)	24H UTP sisalduse kontsentratsioon (mg/ml)	UA kontsentratsioon (μmmol/L)
Kontroll	47.51±7.32	12.80±1.36	1.32±0.12	103.9±18.59
Mudel	157.97±30.57##	44.85±4.36##	2.38±0.37##	500.43±81.06##
CDPS-L	112.70±16.76*	40.72±3.62	1.37±0.12**	264.07±14.85**
CDPS-M	82.31±14.68**	35.37±6.21*	1.06±0.17**	247.62±11.22**
CDPS-H	64.58±8.64**	30.00±2.87**	0.65±0.17**	222.71±37.52**
Dapa	76.98±10.47**	28.82±3.72**	0.37±0.10**	129.87±17.69**

 

 

2.3 CDP -de mõju põletikulistele teguritele ja LPS massi kontsentratsioon C57BL/6J hiirte seerumis

 

Nagu on näidatud tabelis 5, võrreldes kontrollrühmaga, suurenesid TNF-, IL -1, IL -6, TGF- ja LPS seerumi tasemed mudelirühmas märkimisväärselt (P<0.01); compared with the Model group, Each dose of CDPs can reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β and LPS in serum, CDPs-M
CDPS-H rühma mõju oli oluline (p ＜ 0.

Tabel 5 CDP -de mõju põletikulistele teguritele ja LP -dele hiirtel (n=6)

 

Rühmitus	Massi kontsentratsioon (PG/ML)
	Tnf-	Il -1	Il -6	Tgf-	LPS
Kontroll	111.23±5.47	125.85±11.41	112.27±10.28	152.25±7.28	116.17±15.07
Mudel	167.90±16.91##	184.53±21.03##	195.57±31.88##	209.36±16.17##	173.51±15.72##
CDPS-L	144.57±10.15*	160.46±11.84*	169.10±20.32	189.03±8.02*	151.41±9.40*
CDPS-M	133.62±13.24**	154.30±17.39*	150.47±19.28*	171.25±14.35**	135.33±23.92**
CDPS-H	119.30±7.31**	140.54±16.11**	127.12±10.94**	169.47±10.57**	124.98±16.38**
Dapa	114.79±10.48**	135.17±14.37**	120.90±9.32**	159.11±10.92**	113.34±13.14**

 

 

2.4 CDP -de mõju C57BL/6J hiirte neerupatoloogiale

Nagu on näidatud joonisel 1, leiti pärast H&E värvimist, et kontrollrühma hiirte glomerulaarstruktuur ja morfoloogia olid normaalsed ja selged, keldrimembraan oli sile, glomerulaarne morfoloogia oli regulaarne, neerude interstitium oli normaalne, neerutuubud olid korralikult korraldatud ja seal polnud põletikulist infilmi. Võrreldes kontrollrühmaga laiendati hiirte glomerulaarset mahtu, keldrimembraan paksenes, põletikulised rakud infiltreerusid selle ümber ning neerutuubullid korraldati ja laienesid; Võrreldes mudeligrupiga, oli CDPS -i manustamisrühmadel hiire neerudes erinev paranemine. CDPS-M ja CDPS-H rühmades sisalduvate hiirte glomerulaarmaht vähenes märkimisväärselt, keldrimembraani paksus vähenes, infiltreeruti vaid väike kogus põletikulisi rakke ja neerutuubulited paranesid märkimisväärselt ja olid tihedalt paigutatud. Pärast 4 -nädalast CDPS -i sekkumist taastati ülaltoodud patoloogilised tingimused erineval määral.

Massoni värvimine näitas, et kontrollrühma hiirte neerutuubulid olid normaalselt paigutatud ja glomerulid olid normaalses vormis, kollageeni kiudude vohamist ei täheldatud ja nähtavad olid tubulaarsed keldrimembraanid; Mudelirühmas hiirte neerude interstitsiaalkoes täheldati suurt kogust värvitud kollageeni ning interstitsiaalne kiuline koe komplekteeriti ja retikulaarselt prolifereeriti; Hiirte glomerulaarmaht CDPS-M rühmas vähenes ja kiulise kudede proliferatsiooni sümptomid leevendati; CDPS-H rühmas olevate hiirte neerutuubleid korraldati regulaarsemalt ja täheldati väikest kogust kollageeni kiudude vohamist.

PAS -i värvimise tulemused näitasid, et kontrollrühmas sisalduvate hiirte glomerulid olid normaalsed mahu ja puutumatu struktuuri poolest; Mudelirühma hiirtel oli neerukahjustusi, glomerulaarmaht oli tavalisest suurem ja kuju oli ebaregulaarne ning mesangiaalse maatriks ladestus; Võrreldes mudeligrupiga, leevendati hiirte neerukahjustusi igas ravimiga töödeldud rühmas ning annuse suurenemisega kippusid glomerulaarkuju ja suurus olema normaalne ning mesangiaalse maatriksi sadestumise aste vähenes. Tulemused viitavad sellele, et CDP -d võivad leevendada neerukoe kahjustusi DN -hiirtel.

 

Joonis 1 CDP -de mõju neerude histopatoloogilistele muutustele DN -hiirtel, mida uuriti H&E, Massoni ja PAS -i värvimisega (× 400)