Cistanche Deserticola polüsahhariid kutsub esile melanogeneesi melanotsüütides, vähendab oksüdatiivset stressi ja soodustab valgenemist

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yibo Hu1|Jinhua Huang1|Yixiao Li2|Ling Jiang1|Yujie Ouyang1|Lun Yang1|Xiaojiao Zhao1|Lihua Huang3|Hong Xiang3|Jing Chen1 Qinghai Zeng1

Abstraktne

Pigmentatsioonihäirete peamise osana on naha depigmentatsioonihaigused, nagu vitiliigo ja akroomne naevus, väga levinud ja pälvivad praegu rohkem tähelepanu. Depigmentatsiooni patogenees hõlmab melanotsüütide düsfunktsiooni ja kadu, mis võivad olla põhjustatud pärilikkusest, autoimmuunsusest jaoksüdatiivsed stressids. Nende hulgas mängib võtmerolli oksüdatiivne stress; aga vähesed kliinilised ravimeetodid suudavad oksüdatiivse stressiga toime tulla. Nagu teatatud,Cistanche deserticola polüsahhariid(CDP) on tõhus antioksüdant; selle põhjal hindasime selle rolli melanotsüütides ja paljastasime veelgi mehhanismid. Selles uuringus leidsime, et CDP võib edendadamelanogeneesinimese epidermaalsetes melanotsüütides (HEM) ja hiire melanoomi B16F10 rakkudes indutseeris see ka sebrakala pigmentatsiooni. LisaksCDPvõiks aktiveerida mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) signaaliraja, seejärel reguleeris üles mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktori (MITF) ja allavoolu geenide TYR, TRP1, TRP2 ja RAB27A ekspressiooni. Vastasel juhul avastasime, et CDP võib nõrgendada H2O2-indutseeritud tsütotoksilisust ja apoptoosi melanotsüütides. Täiendavad tõendid näitasid, et CDP võib tugevdada NRF2/HO-1 antioksüdantide rada ja eemaldada rakusisest ROS-i. Kokkuvõttes võib CDP edendadamelanogeneesja vältida melanotsüütide teketoksüdatiivnestressvigastus, mis viitab sellele, et CDP aitab säilitada melanotsüütide normaalset seisundit. SeegaCDPvõib olla uudne ravim depigmentatsioonihaiguste raviks.

MÄRKSÕNAD

Cistanche deserticola polüsahhariid, depigmentatsioonihaigus, melanotsüüdid, melanogenees, NRF2, oksüdatiivne stress

värskeCistanche

1|SISSEJUHATUS

Naha depigmentatsioonihaigusi, nagu vitiliigo ja akroomne naevus, iseloomustab laiguline või ulatuslik naha depigmentatsioon.1 Kuigi nahakahjustused põhjustavad harva raskeid kehavigastusi, mõjutavad need patsiendi välimust ja tekitavad tõsise psühholoogilise koormuse, isegi vaimse tervise häireid.2 depigmentatsiooni peamised patoloogilised muutused hõlmavad melanotsüütide düsfunktsiooni ja kadu, mis mõjutab suuresti melaniini sünteesi ja transporti, 3 mis viib melaniini ebapiisava akumuleerumiseni nahas.

Depigmentatsiooniga seotud mehhanismid on praegu teadmata, kuid uuringud on tuvastanud mõned seotud tegurid. Ühest küljest sõltub melanotsüütide funktsioon osaliselt mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktorist (MITF), mis on hästi teada, et soodustab rakkude ekspressiooni.melanogeneesseotud geenid, sealhulgas türosinaas (TYR), türosinaasiga seotud valk 1 (TRP1), türosinaasiga seotud valk 2 (TRP2), ras-seotud valk Rab-27a (RAB27A) ja fastsini aktiini siduv valk 1 (FSCN1) ).4 Nendest geenidest mängib TYR võtmerolli melaniini sünteesis, oksüdeerides l-dopa dopakinooniks.5 Teisest küljest näitavad uuringud mitme teguri kombinatsiooni, mis võivad põhjustada melanotsüütide kadu, sealhulgas pärilikkus, keskkond, autoimmuunsus. jaoksüdatiivne stress.6-9 Nende tegurite hulgas peetakse oksüdatiivset stressi kõige olulisemaks.

Mehhanismidoksüdatiivne stressosaliselt on ilmnenud depigmentatsiooni põhjus; Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ülekoormus on üks võtmetegureid.10 ROS-i ülekoormus depigmentatsioonis hõlmab tasakaalustamatust pro- ja antioksüdantsüsteemide vahel.11 Üks selles tasakaalutuses osalevaid elemente on seotud tuumafaktoriga erütroidi 2- faktor 2/antioksüdantide vastuseelement (NRF2/ARE) antioksüdantide raja kahjustus.12 Rada koosneb NRF2-st ja antioksüdatiivsetest ensüümidest, nagu heemi oksügenaas-1 (HMOX-1, HO-1) , katalaas (CAT), glutatioonperoksidaas 1 (GPX1) ja NAD(P)H kinoondehüdrogenaas 1 (NQO1).13 Kui melanotsüüdid puutuvad kokku liigse ROS-iga, võib NRF2 translokeeruda tuuma ja seonduda konserveerunud ARE-ga ning seejärel soodustada antioksüdantsete ensüümide ekspressioon. Mõne depigmentatsioonihaiguse (nt vitiliigo) korral ei saa kahjustatud NRF2/ARE antioksüdantide rada aga tõhusalt eemaldada ROS-i.14

Depigmentatsioonis tavaliselt kasutatavad kliinilised ravimeetodid hõlmavad paikseid või süsteemseid kortikosteroide, kaltsineuriini inhibiitoreid, kitsariba ultraviolett-B (NBUVB; 311 nm), 308- nm eksimervalgust, autoloogset epidermise siirdamist ja traditsioonilise hiina meditsiini (TCM) ravi. Kortikosteroidid ja kaltsineuriini inhibiitorid võivad vähendada immuunsüsteemi ebanormaalset aktivatsiooni,15 samas kui esmavaliku ravina kasutatakse fototeraapiat; eelkõige stimuleerib NBUVB melanotsüütide proliferatsiooni ja T-rakkude hävitamist,16 samas kui 308-nm eksimervalgus kutsub esile T-rakkude apoptoosi.17 Lisaks on TCM-ravi mõju seotud soodustamisega.melanogenees.18 Teatud määral on need meetodid abiks depigmentatsiooni parandamisel, kuid haiguse progresseerumise kontrolli all hoidmine on endiselt keeruline. On vaja välja töötada uusi ravimeetodeid, eritioksüdatiivne stress, mis oli varem tähelepanuta jäetud.

Cistanche deserticola on tuntud kui "kõrbe ženšenn".19 Selle komponendid on kasulikud etanoolist põhjustatud maksakahjustuse ja soolepõletikulise hüperplaasia korral; seda saab kasutada ka väsimus-, põletiku- ja kasvajavastase reagendina.20-22 Hiljuti teatasid Guo jt, etCistanche deserticola polüsahhariid(CDP), üks selle põhikomponente, omas antioksüdantset ja hepatoprotektiivset toimet20; veel kaks uuringut tuvastasid selle rolli rakkude kaitsmisel anoksüdatiivne stressvigastus hapniku-glükoosi deprivatsiooni/reperfusiooni ja osteoporoosi tingimustes.23,24 Siiski ei ole CDP rolli depigmentatsioonihaiguste korral välja selgitatud. Siin püüdsime kinnitada, kasCDPvõiks mõjutadamelanogeneesja kaitsta melanotsüüte oksüdatiivse stressi eest.

2|MATERJALID JA MEETODID

2.1|Kemikaalid ja antikehad

Cistanche deserticola polüsahhariid(CDP) ja l-dopa osteti ettevõttelt Yuanye Biotec (puhtus 98 protsenti või suurem; Shanghai, Hiina). Vesinikperoksiid (H2O2), dimetüülsulfoksiid (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-dimetüültiasool-2-üül-2, 5-difenüültetrasooliumbromiid ( MTT) ja anneksiin V-FITC apoptoosi tuvastamise komplekt osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich. 4 protsenti neutraalset paraformaldehüüdi osteti firmalt Biosharp (Hefei, Hiina); ja Immunofluorestsentsvärvimiskomplekt (Alexa Fluor 488) ja 2,{15}}diklorofluorestseiindiatsetaati (DCFH-DA) osteti ettevõttelt Beyotime Biotec (Shanghai, Hiina). Fontana-Massoni plekikomplekt ja nukleoplasmaatilise valgu ekstraheerimise komplekt osteti ettevõttest Sloarbio (Peking, Hiina). Inimese melanotsüütide kasvu lisand (HMGS), Dulbecco modifitseeritud Eagle sööde (DMEM) ja sööde 254 osteti firmalt Gibco. Veise loote seerum (FBS) osteti ettevõttest BI (Kibbutz Beit-Haemek, Iisrael). Primaarsed antikehad -aktiini, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, NRF2 ja HO-1 jaoks osteti ettevõttelt Cell Signaling Technology, esmane MITF-i antikeha osteti ettevõttest St John's Laboratory, primaarne p-MITF-i antikeha osteti ettevõttest Affinity Biosciences, GAPDH-i esmane antikeha osteti ettevõttest Bioworld ja primaarne TRP1-antikeha osteti ettevõttest EMD Millipore.

2.2|Rakukultuur ja ravi

Hiire melanoomi B16F10 rakke kasvatati söötmes DMEM, millele oli lisatud 10 protsenti FBS-i ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini antibiootikumide segu. Inimese epidermaalsed melanotsüüdid (HEM) eraldati inimese eesnahast (vt meie eelmist uuringut25) ja kultiveeriti söötmes 254, millele oli lisatud HMGS, 5 protsenti FBS ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini antibiootikumide segu. Kõiki rakke kultiveeriti niiskes inkubaatoris 37 kraadi juures 5% CO2-ga. CDP lahustati DMSO-s ja lahjendati söötmega enne kasutamist, DMSO lõppkontsentratsioon oli madalam kui 0,1 protsenti. Enne kasutamist lahjendati H2O2 söötmega.

2,3|Sebrakala kasvatamine ja ravi

Sebrakala embrüod ja sööde osteti ettevõttelt EzeRinka Biotech. Katseprotokolli kiitis heaks Kesk-Lõuna ülikooli eetikakomitee. Sebrakala kasvatati 12-süvendiplaatidel 37-kraadise nurga all valgusest eemal ja töödeldi erineva kontsentratsiooniga CDP-ga. Sebrakala peades ja sabades leiduvate melaniinide jälgimiseks ja registreerimiseks kasutati iga päev pöördmikroskoopi. Pärast vaatlust muutsime söödet ja lisasime uuestiCDP. Melaniini tihedust sebrakala sabades mõõdeti pildiga J ja väärtused on esitatud integreeritud optiliste tihedustena (IOD).

2.4|Rakkude elujõulisus

Rakkude elujõulisust mõõdeti MTT testiga. Et uurida tsütotoksilisustCDP, HEM-id ja B16F10 rakud siirdati 96-süvendiplaatidele tihedusega 2 × 103 rakku süvendi kohta ja kultiveeriti, kuni rakud kinnitati plaatidele. Seejärel töödeldi rakke erinevate kontsentratsioonidega (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 ja 320 ug/ml).CDP24, 48 või 72 tundi. Enne mõõtmist lisati igasse süvendisse 20 μL MTT-d ja plaate inkubeeriti 37 kraadi juures 4 tundi. Pärast seda visasime supernatandi ära ja lisasime formasaani kristallide lahustamiseks igasse süvendisse 160 μL DMSO-d. Neeldumisväärtus 490 nm juures mõõdeti mitmemoodilise plaadilugejaga (PerkinElmer). CDP mõju uurimiseks H2O2--indutseeritud tsütotoksilisuse tingimustes plaaditi HEM-id ja B16F10 rakud 96-süvendiga plaatidele tihedusega 4 × 103 rakku süvendi kohta. Rakke töödeldi erinevate kontsentratsioonidegaCDP({{0}}, 20, 40 või 80 ug/mL) 24 tunni jooksul, mille järel lisasime igasse süvendisse H2O2 (lõppkontsentratsioonid: 500 μm HEM-ide ja 1,0 mm B16F10 rakkude puhul) inkubeeriti rakke veel 24 tundi. Me moodustasime CDP-ga töödeldud ja negatiivse kontrolli (NC) rühmad. Avastamise etapid olid samad, mis eelnevalt kirjeldatud.

2,5|Melaniinisisalduse NaOH analüüs

Rakke kultiveeriti 100- mm Petri tassidel ja töödeldiCDPerinevatel kontsentratsioonidel (0, 20, 40 ja 80 ug/mL) 48 tundi, seejärel digereeriti trüpsiiniga ja koguti 15-mL tuubidesse. Pesime rakke kaks korda topeltdestilleeritud veega, resuspendeerisime need 1 ml etanoolis ja keeristasime neid melaniini vabastamiseks. Seejärel tsentrifuugisime (200 g, 5 minutit) segu ja eemaldasime supernatandi, lisasime igasse katseklaasi 1 ml 10% DMSO-d (lahjendatud 1 mm NaOH lahusega) ja suspendeerisime sette. Inkubeerisime suspensiooni veevannis 80 kraadi juures 1 tund, et melaniini lahustuks. Lõpuks kanti 200 μL vedelikku 96-süvendiga plaadile ja kasutasime mitmerežiimilise plaadilugeja abil neeldumisväärtust 470 nm juures.

Cistanchearvustused: pärsibmelaniintootmine.

2,6|Türosinaasi aktiivsuse mõõtmine

Rakke kultiveeriti 100- mm Petri tassidel ja töödeldiCDPenne mõõtmist seediti trüpsiiniga ja koguti 15-mL tuubidesse ning pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Teisaldasime igast proovist 106 rakku uude katsutisse ja pärast tsentrifuugimist visasime supernatandi ära, seejärel lisasime rakusademele 1 ml 0,5% Triton X-100 ja säilitasime segu 0 kraadi juures 15 minutit. Seejärel lisasime substraadiks 1 ml l-dopat (1 mm, lahjendatud 0,1 M fosfaatpuhvriga) ja segasime lahuse, teisaldasime 200 μL segu {16}}kaevuplaadile kohe ja mõõtis neeldumisväärtust (A0) lainepikkusel 475 nm, kasutades mitmerežiimilist plaadilugejat, korrates mõõtmist 10 minuti pärast (A10). Türosinaasi aktiivsus arvutati (A10-A0)/105 ja tulemused on väljendatud protsentides ( protsentides ) võrreldes negatiivse kontrolliga.

2,7|Fontana-Massoni melaniini värvimine

Rakke kultiveeriti 12-süvendiga plaatidel kuni 50-protsendilise tiheduse saavutamiseni. Pärast töötlemist fikseeriti rakud 30 minuti jooksul 4% neutraalse paraformaldehüüdiga ja pesti destilleeritud veega. Seejärel lisasime igasse süvendisse 500 µl Fontana ammoniaagi-hõbeda lahust ja hoidsime plaate 16 tundi pimedas, et melaniini värvida. Järgmisena pesime rakke destilleeritud veega viis korda (iga kord 1 minut) ja leotasime neid 5 minutit 500 µl hüposulfitiga; lõpuks eemaldasime hüposulfiti ja loputasime rakke uuesti destilleeritud veega 1 minuti jooksul. Seejärel kasutasime melaniinide vaatlemiseks ja registreerimiseks pöördmikroskoopi.

2,8|RNA ekstraheerimine ja kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsioon

Rakke kultiveeriti 6-süvendiga plaatidel. Pärast töötlemist lõigati rakud trüpsiiniga ja koguti 15-mL tuubidesse. Pesime rakke kaks korda PBS-ga, lisasime seejärel 1 ml lüüsipuhvrit, segasime segu keerisega ja asetasime tuubid 5 minutiks jääle, et rakud täielikult lüüsida. RNA ekstraheeriti Total RNA komplekti (Omega Bio-Tek) abil ja pöördtranskribeeriti (RT), kasutades ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) viidi läbi, kasutades KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). RT segu reaktsioonimaht oli 20 μL, PCR segu reaktsioonimaht aga 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, praimer F 1 μL, praimer R 1 μL, lisage DEPC H2O kuni 20 μL ). Katsed viidi läbi vastavalt protokollidele. Praimerite järjestused on loetletud tabelis S1.

2,9|Valgu ekstraheerimine ja Western blotting/immunofluorestsents

Rakke kultiveeriti 100- mm Petri tassidel. Pärast töötlemist lõigati rakud trüpsiiniga ja koguti 15-mL tuubidesse. Pesime rakke kaks korda PBS-iga, seejärel lisati 500 μL RIPA lüüsipuhvrit (Thermo Fisher), millele oli lisatud 1 mm fenüülmetüülsulfonüülfluoriid (Thermo Fisher) ja 1:100 lahjendatud fosfataasi inhibiitori kokteil (Roche). Tuuma- ja tsütoplasma valk ekstraheeriti Nucleoplasmic Protein Extraction Kit abil vastavalt tootja protokollile. Panime torud 30 minutiks jääle ja keeristasime neid iga 5 minuti järel, et rakud täielikult lüüsida. Tsentrifuugisime rakke (200 g, 4 kraadi, 15 minutit), teisaldasime supernatandi uude katsutisse ja mõõtsime kogu valgu kontsentratsiooni, kasutades BCA valguanalüüsi komplekti (KeyGEN Biotec). Keetsime valke 5-kordse laadimispuhvriga (Beyotime Biotec, Hiina) 100 kraadi juures 10 minutit, seejärel säilitasime -80 kraadi juures. Western blot analüüsis kasutati polüakrüülamiidgeelelektroforeesi (PAGE) meetodit ning 20 ug valku igast rühmast eraldati ja kanti üle polüvinülideenfluoriidmembraanile. Pärast antigeeni blokeerimist inkubeerisime membraani 1:1000 lahjendatud primaarses antikehas 16 tundi 4 kraadi juures, seejärel pesti membraani PBST-ga ja inkubeerisime 1:10 000 lahjendatud fluorestseeruva sekundaarse antikehaga 1 tund 37 kraadi juures. . Fluorestsentsi intensiivsus tuvastati Odyssey CLx Imaging System (LI-COR) abil. Immunofluorestsents viidi läbi kasutades Immunofluorescence Staining Kit (Alexa Fluor 488) primaarse antikeha lahjendusega 1:100.

cistanche reddit

2.10|Rakkude apoptoosi mõõtmine

Rakke kasvatati {{0}} mm Petri tassidel ja töödeldi erinevate kontsentratsioonidega (0, 20, 40 ja 80 ug/ml)CDP24 tunniks ja igasse süvendisse lisati H2O2 (lõppkontsentratsioonid: 500 μm HEM-ide jaoks, 1,0 mm B16F10 rakkude jaoks) ja inkubeeriti veel 24 tundi. Samuti moodustasime CDP-ga töödeldud ja NC rühmad. Pärast töötlemist seedisime rakud EDTA-vaba trüpsiiniga ja kogusime need tuubidesse, seejärel pesti rakke kaks korda PBS-iga ja resuspendeerisime need 100 µl PBS-is. Rakud värviti anneksiin V-FITC apoptoosi tuvastamise komplektiga vastavalt protokollile ja tuvastati voolutsütomeetria (FCM) abil. Apoptoosi määra analüüsimiseks kasutati FlowJo tarkvara.

2.11|Intratsellulaarne ROS mõõtmine

Rakke kultiveeriti {{0}}süvendiga plaatidel ja töödeldi erinevate kontsentratsioonidega (0, 20, 40 ja 80 ug/ml)CDP24 tunniks, millele lisasime igasse süvendisse H2O2 (lõppkontsentratsioonid: 500 μm HEM-ide jaoks, 1,0 mm B16F10 rakkude jaoks), inkubeerisime neid veel 24 tundi ja moodustasime CDP-ga töödeldud ja NC rühmad. Pärast töötlemist pesti rakke kaks korda PBS-ga, et eemaldada kogu sööde ja FBS, seejärel lahjendati DCFH-DA sondi söötmega 1:1000-ni ja lisati see igasse süvendisse. Inkubeerisime rakke 37 kraadi juures 30 minutit ja pesti neid kolm korda seerumivaba söötmega. Kasutasime anfluorestsentsi jälgimiseks ja registreerimiseks pööratud fluorestsentsmikroskoop, seejärel kasutati fluorestsentsi intensiivsuse mõõtmiseks ImageJ-d.

2.12|Statistika ja analüüs

Antud töö andmed on esitatud keskmise ± standardhälbena (SD) ning statistiline analüüs viidi läbi kasutades GraphPad Prism (versioon 7.0) või SPSS (versioon 22.0) ja Student's Mitme rühma võrdlemiseks kasutati t-testi või ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA). WB valgu ribade halli väärtus standarditi GAPDH või -aktiiniga. Väärtusi P < 0,05="" peeti="" oluliseks.="" kõiki="" katseid="" korrati="" vähemalt="" kolm="">

3|TULEMUSED

3.1|CDP indutseeris melanogeneesi HEM-ides ja B16F10 rakkudes

Enne alustamist kasutasime MTT testi, et uurida CDP võimalikku tsütotoksilisust HEM-idele ja hiire melanoomi B16F10 rakkudele. Rakke töödeldiCDPerinevatel kontsentratsioonidel 24, 48 või 72 tundi. HEM-i elujõulisuse testimine näitas, et kui kontsentratsioonid olid madalamad kui 320 ug/ml, ei mõjutanud CDP rakkude elujõulisust; elujõulisus vähenes aga oluliselt, kuna kontsentratsioon jõudis 24, 48 ja 72 tunni pärast 320 ug/ml (P < 0,05;="" joonis="" 1a).="" b16f10="" rakkude="" elujõulisus="" vähenes="" ka="" 48="" ja="" 72="" tunni="">CDPsaavutas 320 ug/ml (P < 0,01),="" kuid="" madalamate="" kontsentratsioonide="" korral="" muutust="" ei="" täheldatud="" (joonis="" 1b).="" seejärel="" uurisime="" esialgu="" cdp="">melanogeneesja võrdles selle toimet melanotsüüte stimuleeriva hormooni (-MSH; kontsentratsioonid: 20, 100 ja 400 nm) ja DMSO (0,1 protsenti) toimega HEM-ides. Melaniini värvimise, türosinaasi aktiivsuse ja melaniinisisalduse analüüside tulemused näitasid, et CDP oli melanogeneesi soodustamiseks võrreldav -MSH-ga, samas kui 0, 1-protsendiline DMSO-ga töötlemine ei muutnud (joonis S1).

Täiustasime oma uurimist vastavalt. HEM-e töödeldiCDPerinevatel kontsentratsioonidel (20, 40 ja 80 ug/ml) 48 tundi; viidi läbi melaniini värvimise, melaniini sisalduse ja türosinaasi aktiivsuse testid ning kõik näitasid pärast CDP-ga töötlemist olulist suurenemist kontsentratsioonist sõltuval viisil, mis saavutas maksimumi 80 ug/ml rühmas (P < 0,05,="" joonis="" 2a-c).="" seejärel="" mõõtsime="" mrna="" ja="" valgu="">melanogenees-seotud geenid (MITF, TYR, TRP1, TRP2, RAB27A ja FSCN1). CDP suurendas oluliselt nende geenide mRNA taset HEM-ides (P < 0,05;="" joonis="" s2a).="" lisaks="" suurenesid="" mitf-i,="" tyr-i,="" trp1="" ja="" rab27a="" valkude="" tasemed,="" nagu="" ka="" fosforüülitud="" mitf-i="" ja="" kogu="" mitf-i="" suhe="" (p=""><0,05), samas="" kui="" trp2="" ja="" fscn1="" ei="" näidanud="" erinevust="" (joonis="" 2d,="" e).="" tulemused="" näitasid,="" et="" cdp="" võib="" soodustada="" melanogeneesi="" ja="" ülesreguleerida="" melanogeneesiga="" seotud="" geenide="" ekspressiooni="" inimese="">

Lisaks kontrollisime uuesti selle mõjuCDPuuesti B16F10 rakkudega ja leidis, et B16F10 rakkude melaniinisisaldus suurenes oluliselt (P < 0,01;="" joonis="" s2b).="" lisaks="" suurendas="" cdp="" oluliselt="" rakkude="" mrna="">melanogenees-ga seotud geenid (P < 0,05; joonis S2C) ning MITF, TYR, TRP1, TRP2 ja RAB27A valgutasemed tõusid ka pärast CDP-ravi (P < 0,05; joonis S2D-E).

JOONIS 1 CDP tsütotoksilisus HEM-ides ja B16F10 rakkudes.

3.2|CDP soodustas sebrakala melanogeneesi

Et uurida, kasCDPvõiks edendadamelanogeneesin vivo kasutasime sebrakala embrüoid. Sebrakala embrüod jagati nelja rühma ja neid töödeldi pidevalt ainult söötmega (NC) või CDP-ga erinevatel kontsentratsioonidel (20, 40 ja 80 ug/ml); melaniini graanulite tihedust ja jaotumist jälgiti ja registreeriti iga päev. Sebrakala embrüote kasvades avastasime, et melaniini tihedus suurenes järk-järgult peades ja sabades. 3. päeval olid rühmadevahelised erinevused eristatavad ja erinevus kasvas jätkuvalt, kuni lõpetasime katse 6. päeval (joonis 3A). Me kasutasime kujutist J, et mõõta melaniini tihedust sebrakala sabades; melaniini tihedus CDP-ga töödeldud rühmades oli oluliselt kõrgem kui kontrollrühmas (P < 0,05;="" joonis="">

3,3|CDP aktiveeritud MAPK signaali rada HEM-ides ja B16F10 rakkudes

Et paljastada mehhanismid, mille abilCDPedutatudmelanogenees, töödeldi HEM-e CDP-ga erinevatel kontsentratsioonidel (20, 40 ja 80 ug / ml) 48 tundi ning seejärel uurisime ERK, JNK ja p38 valkude fosforüülitud ja üldtasemeid MAPK signaaliülekande rajal. Western blot analüüsiga mõõdetuna tõusid p-ERK, p-JNK ja p-p38 tasemed pärast CDP-ravi (P < 0,05),="" samas="" kui="" nende="" kogutase="" ei="" muutunud="" (joonis="" 4a,="" b).="" katseid="" korrati="" b16f10="" rakkudega="" ning="" erk,="" jnk="" ja="" p38="" valkude="" fosforüülitud="" tasemeid="" suurendati="" (p="">< 0,05),="" kuid="" mapk="" kogutase="" ei="" muutunud="" (joonis="" 4c,="" d),="" mis="" on="" kooskõlas="" tulemustega.="">

3,4|CDP nõrgendas H2O2-indutseeritud tsütotoksilisust ja apoptoosi HEM-ides ja B16F10 rakkudes

Kasutasime H2O2 oksüdatiivse stressi keskkonna simuleerimiseks ja uurisime täiendavalt CDP rolli oksüdatiivse stressi all olevates melanotsüütides. HEM-ides kasutatud H2O2 lõppkontsentratsioon oli 500 μm, samas kui B16F10 rakkudes oli see 1,0 mm. Et uurida CDP mõju H2O2-indutseeritud tsütotoksilisusele, eeltöötlesime HEM-e ja B16F10 rakkeCDPerinevatel kontsentratsioonidel (20, 40 ja 80 ug/mL) 24 tundi, seejärel lisati H2O2 ja jätkati nende töötlemist 24 tundi enne vaatluse ja MTT analüüsi läbiviimist.

H2O2 põhjustas HEM-ides nähtavat membraani muljumist ja rakkude kokkutõmbumist, CDP-ga eeltöödeldud rühmades olukord leevenes. Ravi ainult CDP-ga ei avaldanud mõju (joonis 5A). MTT test näitas sarnast tulemust, kuna H2O2-ravi vähendas HEM-i elujõulisust, samas kui CDP leevendas seda kahjulikku mõju oluliselt (P < 0,01);="" ravi="">CDPüksi ei muutnud (joonis 5C). Seejärel kontrollisime uuesti kaitsvat toimet B16F10 rakkudes. H2O2-ga töötlemine kutsus esile näilise membraani muljumise ja rakkude kokkutõmbumise, samas kui ebasoodsat seisundit leevendas ka CDP B16F10 rakkudes (joonis 5B). Samal ajal näitas MTT test, et B16F10 rakkude elujõulisus vähenes pärast H2O2-ga töötlemist, kuid olukord paranes oluliselt CDP-ga eeltöödeldud rühmades (P < 0,05;="" joonis="">

Lisaks kasutasime HEM-ide ja B16F10 rakkude H2O2-indutseeritud apoptoosi mõõtmiseks FCM-i. Tulemused näitasid, et H2O2 põhjustas HEM-ides ja B16F10 rakkudes märkimisväärse apoptoosi, kuid eeltöötlusCDPerinevatel kontsentratsioonidel võib apoptoosi oluliselt vähendada; muidu ei muutnud CDP-ravi üksi (joonis 5E, F). Apoptoosi määr suurenes pärast H2O2-ravi, kuid langes CDP-ga eeltöödeldud rühmades, muutus oli oluline nii HEM-i kui ka B16F10 rakkudes (P < 0,05,="" joonis="" 5g,="">

Joonis 2 CDP soodustab melanogeneesi HEM-ides.

3,5|CDP eemaldatud H2O2-indutseeritud intratsellulaarne ROS HEM-ides ja B16F10 rakkudes

Et uurida mehhanismeCDPH2O2-indutseeritud tsütotoksilisuse ja apoptoosi vähendamiseks tuvastasime täiendavalt rakusisese ROS-i HEM-ides ja B16F10 rakkudes, kasutades DCFH-DA fluorestsentssondi. Töötlemised olid samad, mida ülalpool kirjeldatud, fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti ROS-i taseme esindamiseks. Nagu me täheldasime HEM-ide puhul, oli H2O2-ravi efektiivne ROS-i tõstmisel, kuid CDP eemaldas oluliselt rakusisese ROS-i H2O2--ga töödeldud rühmades (P < 0,01;="" joonis="" 6a,="" c);="" pealegi="" ei="" muutnud="" ainult="" cdp="" kasutamine="" midagi.="" me="" kinnitasime="" b16f10="" rakkude="" tulemused="" uuesti.="" b16f10="" rakkudes="" ei="" mõjutanud="" ravi="" ainult="" cdp-ga="" ros-i="" taset,="" samas="" kui="" ravi="" h2o2-ga="" suurendas="" ilmselgelt="" ros-i="" taset,="" kuid="" seda="" muutust="" vähendas="" oluliselt="" ka="" cdp="" eeltöötlus="" (p="">< 0,05;="" joonis="" 6b,="">

3,6|CDP ülesreguleeritud NRF2/HO-1 antioksüdantide rada melanotsüütides

Et veelgi paljastada mehhanismid, mille abil CDP eemaldab ROS-i, mõõtsime esmalt NRF2/HO-1 antioksüdantide raja valgu taset B16F10 rakkudes. Leidsime, et ravi ainult CDP-ga ei mõjutanud oluliselt NRF2 ja HO-1 valke, kuid H2O2--ravi saanud rühmades tõusis nende kahe valgu tase oluliselt jaCDPeeltöötlus suurendas tõusu veelgi (lk<.05; figure="" s3).="" moreover,="" we="" investigated="" the="" protein="" levels="" of="" nrf2="" and="" ho-1="" in="" hems="" after="" h2o2="" and/or="" cdp="" treatment.="" the="" results="" showed="" that="" ho-1="" level="" was="" elevated="" in="" h2o2-treated="" groups,="" and="" further="" increased="" in="" cdp="" pretreatment="" groups=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" to="" know="" the="" distribution="" of="" nrf2,="" we="" compared="" the="" level="" of="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" with="" the="" total="" level="" of="" β-actin="" in="" hems.="" similarly,="" we="" found="" that="" both="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" were="" elevated="" under="" h2o2="" treatment;="" their="" levels="" further="" increased="" in="" the="" cdp="" pretreated="" groups.="" based="" on="" that,="" we="" calculated="" the="" ratio="" of="" nuclear="" nrf2="" to="" cytoplasmic="" nrf2.="" the="" result="" suggested="" that="" cdp="" increased="" the="" ratio="" significantly="" at="" concentrations="" of="" 40="" and="" 80="" μg/ml=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" using="" immunofluorescence,="" we="" observed="" the="" fluorescence="" of="" nrf2="" in="" hems="" and="" knew="" that,="" under="" h2o2="" treatment,="" the="" nucleus="" seemed="" to="" have="" expanded="" and="" the="" levels="" of="" nrf2="" in="" the="" nucleus="" and="" cytoplasm="" were="" enhanced.="" among="" them,="" the="" cells="" pretreated="" with="">CDPnäitas mõningaid erinevusi, kuna nägime, et fluorestsents tuumas oli tugevam kui tsütoplasmas ja jaotus oli lähedane kolme CDP kontsentratsiooni juures (joonis 7C).

JOONIS 3 CDP soodustab sebrakala melanogeneesi.

4|ARUTELU JA JÄRELDUSED

Selles uuringus uurisime rolliCDPHEM-ides ja B16F10 rakkudes. Esmakordselt avastasime, et CDP võib soodustada melanogeneesi melanotsüütides ja soodustada sebrakala pigmentatsiooni. Järgnev katse näitas, et MAPK signaalirada aktiveeriti CDP-ravi ajal. Uurisime täiendavalt selle rollioksüdatiivne stressja leidis, et CDP võib nõrgendada H2O2--indutseeritud tsütotoksilisust ja apoptoosi melanotsüütides; vahepeal võib CDP aktiveerida NRF2/HO-1 antioksüdantide raja ja eemaldada rakusisest ROS-i oksüdatiivse stressi tingimustes.

Mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaas on oluline rada, mis osaleb MITF-i reguleerimises, mis on peamine transkriptsioonifaktor, mis soodustabmelanogeneesgeenidega seotud geenid ja mõjutab seejärel melaniini sünteesi ja transporti.26,27 Meie uuringus suurenes ERK, JNK ja p38 aaktivatsioon melanotsüütides oluliselt pärast CDP-ravi; vahepeal reguleeriti MITF/p-MITF ja MITF-i juhitud TYR, TRP1, TRP2 ja RAB27A ekspressioone vastavalt üles. Seega soovitame CDP-l edendadamelanogeneesMAPK raja aktiveerimise kaudu, aga kuidasCDPMAPK-de aktiveerimine jääb teadmata. Hiljutiste uuringute kohaselt ekspresseerub teemaksulaadne retseptor 4 (TLR4) melanotsüütides tugevalt ja osalebmelanogenees.28,29 TLR4 on oluline transmembraanne valk, mis suudab spetsiifiliselt siduda lipopolüsahhariidi (LPS)30; uuringud teatasid, et LPS võib indutseerida melanogeneesi.29 Huvitaval kombel aktiveerisid mitmed taimedest või seentest ekstraheeritud polüsahhariidid TLR-e ja allavoolu signaaliülekandeteid, nagu MAPK ja tuumafaktor kappa beeta (NF-κB).31,32 Seetõttu kahtlustame, etCDPTLR-id saavad ära tunda ja siduda, seejärel aktiveerib allavoolu MAPK signaali edastamise raja ja soodustabmelanogenees. Lisaks on teada, et nukleotiide siduvad oligomerisatsioonidomeenilaadsed retseptorid (NLR-id) tunnevad ära rakusisesed ligandid ja juhivad MAPK ja NF-KB signaaliradade aktiveerimist.33,34 Nagu teatatud, võivad Ganoderma lucidum'ist ja Astragalusest ekstraheeritud polüsahhariidid siseneda rakkudesse. ja mõjutada NLR-e.35,36 Seega on võimalik, et CDP võib siseneda melanotsüütidesse ja reguleerida MAPK signaalirada NLR-ide kaudu. Selle hüpoteesi kontrollimiseks on aga vaja täiendavaid uuringuid.

Mõned praegused uuringud on teatanud taimsete polüsahhariidide kasutamisest melanogeneesis melaniini tootmise pärssimiseks.37,38 Kuid selles uuringus,CDPedutatudmelanogeneesmelanotsüütides ja see toime kinnitati veelgi pärast võrdlust -MSH-ga. CDP on ka omamoodi ravimtaimedest ekstraheeritud polüsahhariid, kahtlustame, et CDP vastupidine toime võib olla seotud CDP ja teiste polüsahhariidide struktuursete erinevustega. Polüsahhariidid moodustuvad monosahhariidide polümerisatsioonil, kuid nende monosahhariidide tüüp, monosahhariidi koostis, glükosiidside, külgahela struktuur ja molekulmass on erinevad39,40; Arvatakse, et need tegurid määravad nende bioloogilised funktsioonid.41 Olemasolevad uuringud on välja pakkunud struktuuriCDPja tegi ettepaneku, et CDP struktuur mõjutab hiljem selle funktsiooni.42 Seega on CDP täielikuks mõistmiseks ja meie hüpoteesi kinnitamiseks vaja rohkem tõendeid.

Melanogeneeson oluline kaitsemehhanism ultraviolettkiirguse kahjustuste vastu ja keha homöostaasi säilitamiseks43; samal ajal puutuvad melanotsüüdid kergesti kokku ebasoodsate keskkondadega, nagu ROS-i ülekoormus.11 On teada, et ROS osaleb melanogeneesi edendamises, üks mehhanisme on MAPK-de aktiveerimine.44 Kuid uuringud näitasid ka, et see efekt esineb ainult teatud ROS-i piires. tasemel, samas kui ROS-i ülekoormus kahjustabmelanogenees45 Seos ROS, MAPK ja melanogeneesi vahel on erinevates tingimustes varieeruv, seega on pro- ja antioksüdantide süsteemide tasakaal ilmselgelt oluline. Depigmentatsioonihaiguste (nt vitiliigo) puhul kahjustab tasakaalustamata antioksüdantide süsteem ja kontrollimatu ROS-i ülekoormus melanotsüüte ja vähendab rakkude elujõulisust.11,46 Selles uuringus kasutasime rakkude ROS-i ülekoormuse simuleerimiseks erinevaid H2O2 kontsentratsioone ja HEM-id näitasid kehvemat taluvust rakkude suhtes. H2O2 kui B16F10 rakud. Kui melanotsüüdid allutati H2O2-ga töötlemisele, halvenes nende elujõulisus ja apoptoosi määr, kuid CDP eeltöötlus võib suundumust osaliselt muuta. Samal ajal hakati ROS-i raiskama. Nagu teatatud, on NRF2/ARE antioksüdatsiooniraja aktiveerimine peamine meetod ROS-i eemaldamiseks naharakkudes.14 Meie katsetes reguleeriti NRF2 ja HO-1 valgu taset melanotsüütides pärast H2O2-ravi ilma CDPta; see tähendab, et H2O2-indutseeritudoksüdatiivne stressvõib aktiveerida NRF2/HO-1 raja, kuid sellest ei piisa redoks-tasakaalu säilitamiseks ja raku kaitsmiseks vigastuste eest. Kuid CDP eeltöötlus tugevdas NRF2/HO-1 antioksüdatsiooni rada ja taastas tasakaalu. Seega soovitame CDP kaitsta melanotsüüte oksüdatiivse stressi kahjustuse eest, aktiveerides NRF2/HO-1 antioksüdatsiooniraja ja eemaldades ROS-i.

See on meie toode.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin.

Leidsime selleCDPravi üksi ei mõjuta melanotsüütide ROS-i ega NRF2/HO-1-d. See tulemus viitab sellele, et CDP võib mõjutada redoks-tasakaaluoksüdatiivne stress, kuid mitte normaalsetes tingimustes. Veelgi enam, NRF2/HO-1 antioksüdatsioonirada reguleerivad väidetavalt PI3K, NF-κB ja MAPK signaalirajad.47,48 Meie uuringus suutis CDP aktiveerida MAPK signaaliraja. Võimalik, et CDP saab aktiveerida NRF2/HO-1 raja ülesreguleerivate MAPK-de kaudu. Nagu Slominski teatas, on melanotsüüdid regulatiivses võrgustikus osalevad stressiandurid ja nende funktsioonid võivad keskkonnale reageerides kiiresti muutuda.49 Arvame, et CDP rolli mõjutab melanotsüütide olek, see võib soodustada liikumist.melanogeneesmõjutamata normaalsetes tingimustes antioksüdantide süsteemi, kuid taastavad redoks-tasakaalu oksüdatiivse stressi tingimustes. Seetõttu saab CDP melanotsüütide funktsiooni ja ellujäämist säilitada kahel erineval viisil. CDP aitab melanotsüütidel säilitada homöostaasi, mis on samuti oluline funktsioonmelanogenees.50,51

Kokkuvõtteks,CDPvõib soodustada melanotsüütide melanogeneesi MAPK signaaliraja aktiveerimise kaudu. CDP võib parandada melanotsüütide ellujäämist NRF2/HO-1 antioksüdantide raja aktiveerimise ja rakusisese ROS-i eemaldamise kaudu.oksüdatiivne stresstingimused. Meie leiud on tähendusrikkad, kuna need näitavad, et CDP võib mõlemat edendadamelanogeneesja kaitsta melanotsüüte oksüdatiivse stressikahjustuse eest, mis võib olla vastutav melanotsüütide düsfunktsiooni ja kadumise eest. Selle uuringu tulemused näitavad, et CDP võib olla uudne ravim depigmentatsioonihaiguste ravis.