Cistanche Derticola leevendab hipokampuse närvirakkude kahjustust Parkinsoni tõve rottidel KEAP1/NRF2/Ho -1 antioksüdantse raja reguleerimise kaudu

Kokkuvõte:

 

Eesmärk uuridaCistanche Derticola närvirakkude vigastuste kohta Parkinsoni tõve korral (PD)rotid ja sellega seotud mehhanism. Meetodid Sprague-Dawley (SD) Isased rotid jagati juhuslikult kolme rühma (igas rühmas 1 0 rotid): kontrollrühm, mudelirühm ja tsistanche rühm. Mudelirühma ja ravirühma rotid süstiti koljusiseselt 6- hüdroksüdopamiiniga (6- OHDA). Cistanche'i rühma rottidele anti 0,216 g/ ml tsistanche lahust, tühja rühma ja mudelirühma rottidele anti normaalne soolalahuse niisutamine, niisutamise kogus oli 1 ml/ (100 g · d) kahe nädala jooksul. Närvirakkude morfoloogia ja ultrastruktuur hipokampuses jälgiti hemotoksüliini-eosiinide ja kontaktide abil. Nishi kehade morfoloogiat Hemimite piirkonnas täheldati Nishi värvimisega. Malondialdehüüdi (MDA) ja superoksiidi dismutaasi (SOD) tase tuvastati tiobarbituurhappe meetodil ja nitroblue tetrasooliumi meetodil. Kelksarnase ECH-ga seotud valgu 1 (KEAP 1), tuumafaktori E 2- seotud faktori 2 (NRF 2) ja heemi tsüklooksügenaasi 1 (ho -1) valkude muutusi analüüsiti Western blot. Tulemused pärast tsistanche derticola ravimite ravimist paranes PD -rottide hipokampuse koe struktuur, paranesid neuronite morfoloogiat, tuumapüreoos leevendati, antioksüdantse ensüümi SOD sisaldus hipokampuses suurenes järk -järgult, samas kui süvendati süvendatavat süvendamist, samas kui süvendati süvendatavat süvendamist ja samas kui süvendati süvendatavat süvendamist ja samas kui oksüdatiivse stressiprodukti MDA sisaldus oli järk -järgult. vähenenud. Nrf 2 ja Ho -1 valgu ekspressioon suurenes. Järeldused Cistanche Derticola võib parandada hipokampuse neuronite kahjustusi ja vähendada oksüdatiivse stressireaktsiooni taset PD -rottide hipokampuses. SelleCistanche Derticola mõjusissePD -raviRotid on tihedalt seotud KEAP -1 /nrf 2 /ho -1 signaalimisraja reguleerimisega.

 

 

 

Kvaliteetne tsistanche PD raviks

 

Märksõnad: Cistanche Derticola;Parkinsoni tõbi; Oksüdatiivne stress;; hipokampus; neuronid; KEAP1; NRF2; Ho -1

 

Globaalse haiguste andmete uurimise statistika kohaselt on neuroloogilised haigused muutunud puude peamiseks põhjuseks kogu maailmas. Selles valdkonnas on Parkinsoni tõbi (PD) muutunud üheks kiiremini kasvavateks haigusteks, millel on märkimisväärne vanuseline levimus, suurenedes puude juhtumeid ja suurenevat suremust. üks.
Aastatel 1990–2020 suurenes PD -ga patsientide arv kogu maailmas 118%, ulatudes 6,2 miljonini ja esinemissagedus kasvab aasta -aastalt endiselt [1-2]. PD -ga patsientidel on tavaliselt motoorseid sümptomeid nagu värin, lihaste jäikus, bradükineesia ja tasakaalu raskused hilises staadiumis. Kuid mitte-mootorite sümptomid, näiteks kognitiivne langus, võivad esineda haiguse varases staadiumis. Haiguse edenedes halveneb kognitiivne kahjustus järk -järgult ja muutub raskemaks.

Kvaliteetne tsistanche PD raviks

Mõjutada patsientide elukvaliteeti [3]. Hipokampus on ajus oluline organisatsioon ruumilise õppimise ja välise teabe vastuvõtmiseks. See on peamine struktuur inimese kognitiivsete funktsioonide realiseerimisel. Hipokampuse düsfunktsioon on tihedalt seotud kognitiivse düsfunktsiooni tekkimisega PD -ga patsientidel. Oksüdatiivne stress on seotud hipokampuse koes närvirakkude tekkega. Kahju [4-5]. Seega, kui PD -ga patsientidel on kaitstud hipokampuse neuroneid, võib see parandada patsiendi tunnetust ja viivitada haiguse progresseerumisega.
Viimastel aastatel on osutunud tõhusaks neuroloogiliste haiguste ravis tõhusaks [6]. Cistanche Derticola on traditsiooniline hiina meditsiin, mis võib toita neeru Yangi ja täiendada olemust ja verd. Seda on kasutatud selliste neuroloogiliste haiguste nagu isheemilise insuldi ja neuromüeliidi raviks [7]. Varasemad uurimisrühma uuringud on näidanud, et Cistanche Deserticola võib parandada PD -mudeli rottide käitumist ja vähendada dopamiini närvirakkude apoptoosi keskmise aju olulises piirkonnas [{8-9]. Siiski on ebaselge, kas Cistanche Deserticola võib PD -mudeli rottidel parandada hipokampuse kudede kahjustusi. Seetõttu kehtestas see uuring PD -roti mudeli, et jälgida tsistanche dertaticola mõju hipokampuse kudede kahjustustele ja uurida selle mehhanismi, et pakkuda uusi ideid PD -raviks.Tian Bioloogiline ettevõte); Nissli värvimisreagent (Nanjing Senbeijia bioloogiline ettevõte); Isofluraani (Shanghai Yaji bioloogiline ettevõte).

 

1 materjalid ja meetodid

1.1 Materjalid

1.1.1 Eksperimentaalsed loomad

30 6- nädala vanused SD isased rotid, kes kaalusid 210-230 g. Fujiani traditsioonilise Hiina meditsiini ülikooli eksperimentaalne loomakeskus pakkus eksperimentaalseid loomi ja üldisi arsti eksperimentaalseid loomakeskkondi. Katse kiitis heaks selle asutuse loomade eetikakomitee ja eetika registreerimisnumber on 1N2023019.

1.1.2 Eksperimentaalsed reagendid
Cistanche Derticola graanulid (Fujiani kolmanda inimeste haigla); 6- hüdroksüdopamiin (6- OHDA) reagenti (Beijing Biolabor Technology Co., Ltd.); Hematoksüliin-eosiin (He) värvimisreaktiiv (Taizhou Yunke Biotechnology Co., Ltd.); Loomakoe valgu lüsaaat (Pekingi helebao bioloogiline ettevõte); Valgu fosfataasi inhibiitorid (Wuhan Pujiani bioloogiline ettevõte); Proteaasi inhibiitorid (Hunan Yunbangi biotehnoloogia ettevõte); Kelchi-sarnane ECH-ga seotud valk -1 (KEAP1) Monoklonaalne antikeha (Wuhan Sanying Biotehnoloogia ettevõte); Glyceraldehyde 3- fosfaatdehüdrogenaas (GAPDH) monoklonaalne antikeha (Wuhan Huamei bioloogiline); Tuumafaktor E2 seotud tegur 2 (NRF2), heemi oksügenaas 1 (hemoksügenas -1, ho -1) monoklonaalne antikeha (Wuhan Pujian Biotechnology Co., Ltd.); Superoksiidi dismutaas (SOD) ja Malondialdehüüde (MDA) tuvastuskomplektid (Shanghai Biotech Co., Ltd.); Nissli värvimisreagent (Nanjing Senbeijia Biotechnology Co., Ltd.); Isofluraani (Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd.).

 

1.1.3 Instrumendid

JEA3001 elektrooniline tasakaal (Shanghai Puchuni mõõteinstrument Co., Ltd.); BSA224S elektrooniline tasakaal (Sartorius, Saksamaa); STAT S2T madala temperatuuriga raputaja (Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., Ltd.); RM2235 täisautomaatse parafiini viilutaja (Leica, Saksamaa); Pectramax i3x multifunktsionaalne mikroplaadilugeja (Molecular Devices, USA); Bx63
Fluorestsentsmikroskoop (Olympus, Jaapan); DLAB -i pihuarvur D1008/D1008E (Peking Dalong Xingchuang Experimental Instrument Co., Ltd.); CryoCube F740HI Ultra-Low temperatuuri külmkapp (Epend, Saksamaa); MiniPro epbasic Basic Electroforeesi instrumendi toiteallikas (Shanghai Yishengi Biotechnology Co., Ltd.); Pidev temperatuuri kuivamisahju (Hangzhou Notting Scientific Equipment Co., Ltd.); Ascent Max Ductul Fume Hood (Shanghai Yishike Enterprise Development Co., Ltd.).

 

1.2 meetodid

1.2.1 Mudeli loomine ja loomade rühmitamine

Rats were placed in an environment with a temperature of 24-25℃, a humidity of 55%-60%, and a 12/12 h light/dark cycle, with free access to food and water. SD rats were randomly divided into 3 groups (10 rats in each group): blank group, model group, and Cistanche deserticola group. According to the PD animal model establishment method [5], SD rats in the model group and Cistanche deserticola group were anesthetized by 2% isoflurane inhalation and fixed on a brain stereotaxic instrument. The skin was incised along the midline of the skull, and the skull membrane was bluntly separated. The coordinates of the right striatum were determined by referring to the rat brain stereotaxic atlas. 8μL of 6-OHDA was injected intracranially at the above target at a concentration of 2μg/μL, and the blank group rats were injected with an equal volume of saline. Successful modeling criteria: One week after modeling, apomorphine (0.5 mg/kg) was intraperitoneally injected to induce rat rotation. The rats rotated from the healthy side to the affected side, and the number of rotations within 30 min was >21 0 ringid, mida peeti edukaks modelleerimiseks. Pärast seda kinnitati Cistanche Derticola rühmas iga päev 0,216 g/ml Cistanche Deserticola lahusega ning tühja rühma ja mudelirühm oli normaalse soolalahusega. Kolme rottide rühma gavage'i maht oli kahe nädala jooksul 1 ml/(100 g · d) [9]. Pärast iga rottide rühma töötlemist eutaniseeriti rotid 2% isofluraani sissehingamise anesteesiaga ja järgnevateks eksperimentaalseteks uuringuteks koguti ajukuded.

 

1.2.2 Patoloogiliste muutuste jälgimine hipokampuse koes hematoksüliin-eosiini värvimisel

 

Rottide hipokampuse kuded igas rühmas koguti, pandi formaldehüüdi lahusesse, dehüdreeriti gradiendiga etanooliga, küpsetati kuivatusahjus, lahustunud vaha, kuivatatud, petetud, värvitud HE -ga, läbipaistnud ksüleeniga, suleti neutraalse kummiga ja jälgiti mikroskoobi all.

 

1.2.3 ülekande elektronmikroskoopia vaatlus hipokampuse närvirakkude ultrastruktuuri kohta

Hipokampuse kude pandi 3% glutaraldehüüdi fikseeritavasse, dehüdreeriti gradiendi etanooliga, manustatud (epoksüvaik) ja valmistati ultratilised sektsioonid. Hipokampuse närvirakkude ultrastrukturaalsete muutuste jälgimiseks (ülekandeelektronmikroskoopia all) kasutati pliitsitraadi ja uranüülatsetaadi värvimist.

 

1.2.4 NISSL -i värvimine NISSL -i kehade muutuste jälgimiseks hipokampuse kudedes

Ülalnimetatud hipokampuse kudede parafiini lõigud hüdreerusid veevabas etanoolis, vastavalt 95% ja 70% gradiendi etanoolis. Pärast destilleeritud veega pesemist 3 korda pesege 5 minutit NISSL -i värvimislahusega, seejärel peske dehüdreeritud gradiendi alkoholi ja destilleeritud veega ning puhastage ksüleeniga. Sektsioonid suleti neutraalse liimiga ning pärast tahkumist jälgiti ja registreeriti optilise mikroskoobi all.

 

1.2.5 Keemiline kolorimeetriline meetod MDA ja SOD sisalduse tuvastamiseks hipokampuse kudedes

Pärast erinevate eksperimentaalrühmade hipokampuse kudesid homogeniseerimist tsentrifuugiti neid 1000 g juures 20 minutit ja iga eksperimentaalrühma supernatant koguti. Komplekti juhiste kohaselt kasutati MDA ja SOD sisalduse tuvastamiseks igas eksperimentaalsete proovide rühmas MDA ja SOD testide komplekte.

 

1.2

Iga rühma hipokampuse kuded lisati lüüsipuhvriga ja tsentrifuugiti 12, 000 r · min -1 15 minutit. Supernatant koguti ooterežiimi kasutamiseks. Valgu kontsentratsioon määrati BCA meetodil. Valgu kvantifitseerimise tulemuste kohaselt lisati vastav koguvalgu maht ja laaditi valgugeeli elektroforeesiga. Proovid denatureeriti 95 kraadi juures 10 minutit, viidi membraanile, lõigati ja blokeeriti blokeerimislahuses 1 tund. Lahjendatud primaarsed antikehad KEAP1, NRF 2, HO -1 ja GAPDH (1: 500) lisati, reageeriti üleöö 4 kraadi juures, pesti 1x TBST -ga, inkubeeriti sekundaarsete antikehadega (1: 4000) ja pesti uuesti 1 x TB -ga värvipildi jaoks.

 

1.3 Statistiline analüüs

Loendusandmeid väljendati keskmise ± standardhälbena. Normaalse jaotuse ja dispersiooni homogeensusele vastavad andmed tehti t -testiga, normaalse jaotuse ja ebavõrdse dispersiooniga vastavad andmed tehti parandatud t -testiga; Andmed, mis ei vastanud normaalsele jaotusele, tehti mitteparameetrilisele testile. Erinevate rühmade erinevuste võrdlemiseks kasutati ühesuunalist ANOVA-d ja seejärel kasutati kahe rühma võrdlemiseks LSD-meetodit. P <0. 05 peeti statistiliselt oluliseks.

 

2 tulemusi

2.1 Cistanche Derticola mõju hipokampuse CA1 piirkonna morfoloogilisele struktuurile PD -mudeli rottidel HA Värvimise tulemused näitasid, et tühjade rühmade rottide hipokampuse CA1 piirkonna neuronid olid korralikult ja tihedalt paigutatud, regulaarselt morfoloogia ja ühtlase jaotuse korral ning mitte ilmselgelt neuronaalseid kahjustusi; Mudelirühma neuronaalsed rakud olid paigutatud korratumalt, rakutuumad kahanesid, tuuma värvimine süvenes ja neuronaalsete rakkude kahjustus oli ilmne; Cistanche Derticola rühmas olevad neuronaalsed rakud paigutati regulaarsemalt kui mudelirühmas, tuuma kondenseerumise arv oli suhteliselt vähenenud ja neuronaalsete rakkude kahjustus leevendati. Tulemused on näidatud joonisel 1.

 

 

Joonis 1 Cistanche Derticola mõju patoloogilisele struktuurile hipokampuse CA1 piirkonnas Parkinsoni roti (HE, × 400) MÄRKUS: A: kontrollrühm; B: mudeligrupp; C: Cistanche Group. Mustad nooled tähistavad kahjustatud närvirakke.

 

2.2 Cistanche Deserticola mõju hipokampuse neuronite ultrastruktuurile PD -mudeli rottidel

Tühjas rühmas võib hipokampuse neuronite jälgimisel täheldada, et raku struktuur säilitab selge morfoloogia, tuum on regulaarne ümmargune või ovaalne kuju, tuumamembraan jääb siledaks ja puutumatuks ning tuuma kromatiin on ühtlaselt jaotunud ning tuuma kromatiini servade agregatsioon. Seevastu mudelirühma hipokampuse neuronid näitasid ilmseid muutusi: rakkude üldine elektronide tihedus suurenes, tuuma kondenseerub, tuumas olev kromatiin agregeerunud ja kinnitatud tuumamembraani põhja külge, tuumamembraani paksenes ja vaakumid nähti tsütoplasmas. Pärast sekkumist tsistanche Derticolaga, võrreldes mudeligrupiga, näitasid tsistanche Derticola hipokampuse neuronid teatud taastumissuunda: neuronaalse rakuorgani suurus taastati, rakumembraan jäi puutumatuks, servade agregeerimine tuumaromatiini agregatsioon teatavale ulatusele teatavale ulatusele ja tuumale. Tsütoplasm vähenes, mis näitab, et tsistanche dertaticolal on närvirakkudele teatav kaitse- või parandusmõju. Vt joonis 2.

 

Joonis 2 Cistanche Derticola mõju neuronaalsele ultrastruktuurile Parkinsoni tõve rottide hipokampuses (× 7000) Märkus: A: kontrollrühm; B: mudeligrupp; C: Cistanche Group.

 

2.3 Cistanche Derticola mõju NISSL kehadele PD -mudeli rottide hipokampuse neuronites

NISSL -i värvimise tulemused näitasid, et tühja rühma neuronid olid tihedalt paigutatud, regulaarse morfoloogia, rikkalike Nissl kehade ja tumeda värvimisega; Mudelirühma neuronid olid lõdvalt paigutatud, paistes ning enamik NISSL -i kehasid lahustati ja värviti kergelt; Cistanche Derticola rühma neuronid olid tihedalt korraldatud, regulaarse morfoloogiaga ning NISSL -i kehade arvu ja värvimist parandati võrreldes mudeligrupiga. Tulemused on näidatud joonisel 3.

 

Joonis 3 Cistanche Derticola mõju NISSLi hipokampuse närvirakkude kehale Parkinsoni tõve roti (Nissl, × 200) Märkus: A: kontrollrühm; B: mudeligrupp; C: Cistanche Group.

 

2.4 Cistanche Derticola mõju SOD ja MDA sisaldusele Parkinsoni tõve rottide hipokampuses

 

Võrreldes tühja rühmaga vähenes mudelirühma hipokampuse SOD -sisaldus, samas kui MDA sisaldus suurenes; Võrreldes mudeligrupiga, suurenes Cistanche Derticola rühma hipokampuse SOD -sisaldus, samas kui MDA sisaldus vähenes. Vt tabel 1.

 

Vahekaart. 1 Cistanche Derticola mõju SOD -le ja MDA sisule Parkinsoni tõve rottide hipokampuses

Rühmitus	SOD (PG/ML)	MDA (PG/ML)
Kontroll	12.36±2.75	2.85±0.83
Mudel	2.75±0.83*	9.95±0.37*
Rhynchophylla	7.22±1.32#	5.16±1.75#

Märkus. Võrreldes kontrollrühmaga *P<0.05; compared with model group, #P<0.05.

 

2.5 Cistanche Derticola mõju KEAP1, NRF2 ja HO -1 valkude ekspressioonile Parkinsoni tõve rottide hipokampuses

Western blot katsete tulemused näitasid, et NRF2 ja HO -1 valkude ekspressioon rottide hipokampuses mudeli rühmas vähenes, samal ajal kui KEAP1 valgu ekspressioon suurenes; Võrreldes mudeligrupiga, suurenes NRF2 ja HO -1 valkude ekspressioon Cistanche Derticola rühmas rottide hipokampuses, samas kui KEAP1 valgu ekspressioon vähenes. Vt joonis 4 ja tabel 2.

Joonis 4 Cistanche Derticola mõju KEAP1, NRF2 ja Ho -1 ekspressioonile Parkinsoni tõve rottide hipokampuses

Märkus: A: kontrollrühm; B: mudeligrupp; C: Cistanche Group

 

 

Vahekaart. 2 Cistanche Derticola mõju KEAP1, NRF2, Ho -1 ekspressioonile Parkinsoni tõve rottide hipokampuses

 

Rühmitus	Keapl	Nrf2	Ho -1
Tühigrupp	0.16±0.05	0.38±0.07	0.33±0.05
Näidisrühm	0.85±0.23*	0.12±0.09*	0.11±0.02*
Positiivne rühm	0.22±0.03#	0.86±0.06#	0.79±0.05#

 

MÄRKUS. Võrreldes kontrollrühmaga, *p <{{0}}. 05; Võrreldes mudeligrupiga #P <0,05.