Kuidas uurida herbatsistanšide geneetilist mitmekesisust?

RAPD-i uuring Herba Cistanches'i geneetilise mitmekesisuse kohta

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da

(Hiina Materia Medica instituut, Hiina Hiina meditsiini akadeemia, Peking 100700)

Abstraktne

Eesmärk:Rahvastiku uurimiseksgeneetiline mitmekesisuskohtaCistanche deserticolajaCistanche tubulosa.

Meetodid:Kaks looduslikku populatsiooniCistanche deserticolaja neli looduslikku populatsiooniCistanche tubulosaanalüüsis RAPD jageneetiline mitmekesisuspopulatsioonidest analüüsiti POPGENE tarkvara versiooniga 1.31.

Tulemused:Polümorfsete lookuste keskmine protsentCistanche deserticolaoli 47,37 protsenti , kahe populatsiooni polümorfsed lookused olid 39,47 protsenti ja 35,53 protsenti ning Nei keskmine geenide mitmekesisus oli 0.135 8. Shanoni oma oli rohkem. Olekuteabe indeks on 0.207 2 ja geenide diferentseerumiskoefitsient Gst {{1{{20}}}.254 6. Polümorfsete lookuste keskmine protsent Cistanche'is oli 27,59 protsenti ja polümorfsete lookuste protsent igas populatsioonis oli 19,54 kuni 25,29 protsenti, millest Andieri populatsioonil oli suurim 25,29 protsenti ja Nei keskmine geenide mitmekesisus oli 0. { {21}}, Shannoni polümorfismi teabeindeks on 0,1258, geenide diferentseerumiskoefitsient Gst =0.175 5.

Järeldus:Cistanche deserticolajaCistanche tubulosapopulatsioonide vahel on teatav erinevus. Thegeneetiline mitmekesisusDesert Cistanche on oluliselt kõrgem kui Cistanche tubulosa ja on eristunud kaheks ökotüübiks.

Märksõnad: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; geneetiline mitmekesisus

[Hiina raamatukogu klassifikatsiooninumber] S 567 [Dokumendi identifitseerimiskood] A [Artikli number] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

Tistanche on Lidanaceae sugukonda Cistanche perekonda kuuluv parasiitaim, tuntud ka kui Dayun, mis on hinnaline Hiina ravimmaterjal. Cistanche deserticola peamised lähtetaimed minu kodumaal onCistanche deserticolaYCMa ja C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Cistanche deserticola peremeestaimedeks on haloksilon ammodendron ja haloksilon ammodendron, mis on levinud peamiselt Alashani liigas Sise-Mongoolias, Põhja-Xinjiangis, Qinghais, Gansus ja mujal. Cistanche deserticola levik on sama, mis peremeestaimedel. Minu riigis levib Cistanche cistanche ainult maakondades, mis asuvad Taklimakani kõrbe ümbruses Xinjiangis Tianshani mägedest lõunas ja selle levik ei ole täielikult sünkroniseeritud võõrustaja Tamarixiga. Teised piirkonnad, nagu Põhja-Xinjiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, Sise-Mongoolia, Shaanxi ja muud Tamarixi taimede kohad, ei ole parasiitilised Cistanche Tubula[2]. Seoses nõudluse kiire kasvuga viimastel aastatel Cistanche'i järele, mille tulemuseks on selle ressursid väljasuremine, on looduslikud tsitanche'i varud kahanenud vaid mõnele peamisele tootmispiirkonnale. Mõlemad on minu kodumaal loetletud ohustatud kaitsealuste taimeliikidena [3], sealhulgasCistanche deserticolaon kantud CITESi II lisasse [4].

Pärast mitut aastat kestnud uurimistööd on Cistanche kunstliku aretuse uurimine olnud edukas ning see on laiaulatusliku edendamise ja istutamise faasis. Kuid kuidas vältida Cistanche liikide vähenemist tööstusliku tootmise käigus, kuidas taastada võimalikult kiiresti piiratud looduslik populatsioon ja säilitada väärtuslikke looduslike iduplasma ressursse, on selle säästva kasutamise võti. Mis puutub Cistanche'i kaitstud pärandisse [vastuvõtmise kuupäev], 2004-03-11 [Fund Project] Teadus- ja Tehnoloogiaministeeriumi sotsiaalhoolekande projekt (2001.109); Teadus- ja Tehnoloogiaministeeriumi projekt "Kümnes viieaastane plaan" (2001BA701A09a) [Vastatav autor] * Huang Luqi, Tel:( 010) 64014411-2955, E-post: huangluqi @263.net Ülekandeuuringud on endiselt pooleli tühi. Selles uuringus kasutatakse RAPD-tehnoloogiat kahe loodusliku populatsiooni uurimiseksCistanche deserticolaja 4 looduslikku populatsiooniCistanche tubulosaja analüüsige mõlemat Erinevusgeneetiline mitmekesisusEeldatakse, et see loob olulise eksperimentaalse geneetilise aluse hinnalise Hiina meditsiini Cistanche kaitsmiseks.

cistanche

1. Materjal ja meetodid

1.1 Materjalid

Cistanche deserticolakoguti Jimsari maakonnast Xinjiangis ja iidse Alxa liiga Jilantai piirkonnast Sise-Mongoolias. Cistanche populatsioonid koguti Minfengi maakonnast ja Yutiani maakonnast Xinjiangist. Minfengi maakond on praegu kõige suurema Cistanche cistanche saagikusega piirkond, kus on suurim tihedus ja suhteliselt terviklikud looduslikud metsad. Yutiani maakonna proovivõtukohad Andil, Sawuzek, Yatongguz ja Daheyan on peamised tootmispiirkonnad, mis asuvad Andiri jões, Yeyike jões, Yatongguzi jões ja Kelaniyas Jõe alamjooksul on populatsioonide vaheline kaugus suurem kui 50 km. Iga populatsioon valis juhuslikult 19-30 isendit. Proovid kuivatati kiiresti silikageelis ja kasutati DNA ekstraheerimiseks (tabel 1).

Tabel 1 Cistanche deserticola ja Cistanche tubulosa populatsioonide ja tootmispiirkondade proovide võtmine

1.2 DNA ekstraheerimine

Kogu DNA ekstraheerimise meetodis kasutatakse kõrge soolasisaldusega madala pH-taseme meetodit [5]. DNA proovile viidi DNA matriitsi kontsentratsiooni tuvastamiseks spektrofotomeeter, seejärel kasutati RAPD analüüsiks 1-protsendilist agaroosgeeli elektroforeesi, EB värvimist, vaatlust ja fotograafiat ultraviolettvalguses, selgete ribadega DNA elektroforeesi ja vähem saba.

1.3 RAPD praimerite sõelumine

Kuna katses leiti, et samal praimeril on ebarahuldav mõju mõlema samaaegsele amplifikatsioonile.Cistanche deserticolaja Cistanche tubulosa, praimereid sõeluti sõltumatult. Amplifikatsiooniks ja sõelumiseks kasutati 150 juhuslikku praimerit (10 aluspaari), 25 µl Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. reaktsioonisüsteemi; iga praimer kasutas pimekontrollina 2 populatsiooni malli ja 1 steriliseeritud topeltdestilleeritud vett ning Cistanche deserticola amplifitseerimiseks saadi 10 selgete ribade, tugeva polümorfismi ja hea korratavusega praimerit: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 praimeritCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 PCR amplifikatsioon ja produktide tuvastamine

Valitud praimereid kasutati matriitsi DNA amplifitseerimiseksCistanche deserticolajaCistanche tubulosaPCR abil. Genoomne DNA lahjendati matriitsina kontsentratsioonini 50 ng·μL -1 vastavalt mõõdetud kontsentratsioonile. Reaktsiooni kogumaht on 25 μL, millest 10 × PCR puhver 2,5 μL, Mg2 pluss 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, dNTP segu (igaüks 2,5 mM) 1 μL, 5 μM praimer 1 μL, matriitsi DNA 1 μL, steriliseeritud topeltdestilleeritud vesi 18,8 μL, ülaltoodud PCR amplifikatsioonilahus on Shanghai Sangoni toode. Amplifitseerimine viidi läbi PTC-100 termotsükleriga. Amplifikatsiooniprogramm oli 94-kraadine eeldenatureerimine 5 minutit ja seejärel 40 tsüklit. Iga tsükkel hõlmas 94 kraadi 45 s, 34 kraadi 1 min, 72 kraadi 1 min 30 s ja lõpuks pikendamist 72 kraadi juures 5 minutit. Amplifitseeritud saadusi elektroforeesiti 2,0-protsendilisel agaroosgeelil (sisaldab EB-d) 1 × TAE puhvris ning vaadeldi ja pildistati SYNGENE geelikuvamissüsteemis.

1.5 Statistika ja andmete analüüs

Elektroforeesi spektris võrreldakse reaktsioonisaaduse vastavat asendit geelil vastavalt molekulmassi standardile ja hinnatakse amplifitseeritud produkti molekulmassi. Ribaga riba registreeritakse kui 1 ja ribata riba registreeritakse kui 0, moodustades 0/1 maatriksgraafiku ja sisestades arvutisse, kasutades polümorfsete saitide protsendi arvutamiseks POPGENE32 iga populatsiooni (PPL), Nei geenide mitmekesisuse indeks (H), Shannoni polümorfismi teabeindeks (I), geenide diferentseerumiskoefitsient (Gst), geenide mitmekesisus (Ht),Geneetiline mitmekesisus(Hs), Nei (1978) geneetiline identiteet (I) ja geneetiline kaugus (D) populatsiooni sees ning klastrianalüüs viidi läbi UPGMA meetodil.

2. Tulemused ja analüüs

2.1 Cistanche geneetiline mitmekesisus

Kõik proovid said ribad molekulmassiga vahemikus 200 kuni 2 200 bp (joonis 1, 2). Kahest populatsioonist pärit 60 proovis tuvastati kokku 76 lookustCistanche deserticola, millest 36 olid polümorfsed lookused, mis moodustasid 47,37 protsenti , H=0.135 8, I=0.207 2. Nende hulgas on Jimsari PPL 39,47 protsenti ja Gilanty oma 35,53 protsenti. H on 0. 0 95 3 ja 0.1 070 ning I on vastavalt 0.15 12 ja 0.163 7. Kokku tuvastati 87 lookust {{20}} isendil Cistanche 4 populatsioonist, millest 24 olid polümorfsed lookused, mis moodustasid 27,59 protsenti, H=0.084 8, I=0.1278. Kõrgeim PPL oli Andil 25,29 protsenti, samas kui PPL oli madalam Savuzekis ja Yatungusis (mõlemad 19,54 protsenti). H on 0.062 1 -0.080 0, I on 0.095 0 -0.116. H ja I suurus on kooskõlas iga populatsiooni PPL-i suurustrendiga ning koefitsiendid on suurimad Andieris, millele järgneb Dayan. Sama PPL-i korral on Savuzeki H=0.{{40}} Summa I=0.097 0 on veidi suurem kui 0.{{44 }} ja 0.095 0 Yatunguskast (tabel 2).

Joonis 1 Mõne kõrbeproovi RAPD võimendatud ribadCistanche deserticola, praimer S490 1-10. Garantie proovid; 11-20. Jimpsteri proovid M-DNA marker (200 - 2 000 bp)

Joonis 2 Cistanche Tubulosa praimeri S2 042 1-20 mõnede proovide RAPD-ga võimendatud ribad. Xinjiang Andieri proovi M-DNA marker (200 - 2 000 bp)

Tabel 2geneetiline mitmekesisuskohtaCistanche deserticolajaCistanche tubulosapopulatsioonid

2.2 Cistanche geneetilise variatsiooni analüüs

Vastavalt tasemelegeneetiline mitmekesisuspopulatsioonides (Hs), populatsioonide diferentseerimises (Dst) ja populatsioonidevaheliste geneetiliste erinevuste osakaalus geneetilistes koguerinevustes (Gst) on näha, et Cistanche deserticola Ht kogu geneetiline mitmekesisus=0.{{ 1}}, kus Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, millest Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (tabel 3). Ülaltoodud tulemused näitavad, et populatsioonide vahel on teatav geneetiline varieeruvus. Cistanche deserticola kõrbepopulatsioonide vaheline varieeruvus moodustas 25,46 protsenti kogu variatsioonist ja Cistanche tubulosa populatsioonide varieeruvus 17,55 protsenti kogu variatsioonist.

Tabel 3 Geneetilise variatsiooni analüüsCistanche deserticolajaCistanche tubulosa.

2.3 Geneetiline kaugus ja klastrianalüüs Cistanche deserticola populatsioonide hulgas

Kahe populatsiooni geneetiline kaugusCistanche deserticolaon {{0}}.080 0 ja geneetiline identiteet on 0.9231. Cistanche nelja populatsiooni geneetiline kaugus oli 0.012 0-0.031 5 ja geneetiline identiteet oli 0.9690-0.988 1 (tabel 4) . Cistanche deserticola ja cistanche tubulosa isendite rühmitamine näitab, et Cistanche deserticola saab populatsiooni järgi rühmitada kahte erinevasse rühma, samas kui Cistanche deserticola eri isendeid ei saa populatsiooni järgi rühmitada, mis näitab ka Cistanche deserticola geneetilist diferentseerumist. populatsioon on suhteliselt kõrge. Suur, kuid geneetiline diferentseerumine Cistanche tubulosa populatsioonide vahel on väike.

Tabel 4 Geneetiline identiteet (vasakul all) ja geneetiline kaugus (paremal ülal).cistanche tubulosa.

3. Arutelu

3.1 Cistanche geneetiline mitmekesisus

Tasegeneetiline mitmekesisustaimede olemus on lahutamatu nende bioloogilistest omadustest, elupaikadest, päritolust ja evolutsioonist. Nende hulgas on enim mõju aretussüsteem, levikuala, eluvorm ning õietolmu ja seemnete levitamise meetodid [6]. Ge Song et al. 499 taimeliigi allosüümandmete statistiliste tulemuste kohaselt 165 perekonnas. [7] peaks Cistanche'i polümorfism liigitasandil olema umbes 50 protsenti ja populatsiooni tasemel polümorfism umbes 40 protsenti. Umbes 0,17. Selles katses saadud polümorfismi tasemed on kõik madalamad kui need keskmised väärtused. Samal ajal, võrreldes polümorfsete lookuste tasemetega, mis on saadud RAPD-meetoditega mitmete levinud ohustatud taimede puhul, nagu 32 protsenti ohustatud liikidest hõbenulg[18], 22,5 protsenti kääbuspojengidest ja 27,6 protsenti lilladest pojengidest. [9] ] On näha, et geneetiline mitmekesisusCistanche deserticola on keskmisest veidi madalam, samas kui Cistanche tubulosa geneetiline mitmekesisus on niigi äärmiselt madal.

3.2 Cistanche vähese geneetilise mitmekesisuse põhjused

Tistanche on spetsiifiline parasiitaim, mis on levinud kitsastes kõrbepiirkondades samal ajal. Seetõttu võib ainulaadne elustiil ja suhteliselt kitsas elamispind olla loomupäraseks põhjuseks, miksgeneetiline mitmekesisusCistanche on üldiselt madalam kui tavalistel taimedel.

Erinevus sellesgeneetiline mitmekesisusCistanche deserticola ja Cistanche tubulosa vahel võib olla seotud nende kahe levikuvahemiku erinevusega ja sellega, kas need on sünkroonitud peremeesorganismi levikuga. Cistanche tubulosa leviala on oluliselt väiksem kui Cistanche deserticola ja tema levik on peremeestaimega äärmiselt sünkroonis. Uuringud on näidanud, et Tamarixi liikide hulgas on palju mitmekesisust. Näiteks Zhang Juan et al. teatas, et Tamarix sibiricuse geneetiline mitmekesisus oli koguni 98,7 protsenti [10], samas kui Cistanche geneetiline mitmekesisus on äärmiselt halb, mis näitab pikaajalist evolutsiooni. Cistanche tubulosa võis ajaloos olla kogenud tõsiseid kitsaskohti, mille tulemuseks on suure hulgageneetiline mitmekesisus.

Samal ajal leiti uurimiste kohaselt, et ükski neistCistanche deserticola20 km raadiuses inimasustusest võiks välja kaevata ja normaalselt õitseda. Cistanche'i suured ja väikesed kaevandused kaevati välja, eriti Cistanche'i torulillede peamistes kasvupiirkondades. Seetõttu põhjustas selle suur hulk väljakaevamisi. Päritolu puudumine ja elupaikade hävitamine võivad olla madalseisu peamised inimtekkelised põhjusedgeneetiline mitmekesisusCistanche'ist.

3.3 Cistanche geneetiline diferentseerumine

Xinjiangi ja Sise-Mongoolia vahelise geograafilise kauguse tõttu põhjustas geograafiline isoleeritus eristumise ja isolatsiooniCistanche deserticolapopulatsioonid ja need kaks populatsiooni moodustasid kohalike elupaigatingimustega kohanemise tõttu erinevad geneetiliselt erinevad ökotüübid. Kitsa levikuala ja populatsioonidevahelise sagedase geenivahetuse tõttu on populatsioonide geneetiline diferentseeritus väiksem kui Cistanche deserticola oma.

3.4 Soovitused Cistanche kaitseks

Geneetiline mitmekesisuson liikide pikaajalise säilimise eelduseks, et vältida väljasuremist. Vähendaminegeneetiline mitmekesisusvähendab populatsioonide võimet kohaneda keskkonnamuutustega nii lühi- kui ka pikaajalises perspektiivis [11]. Seetõttu on Cistanche geneetilise mitmekesisuse kaitsmine selle haruldase ja hinnalise Hiina meditsiini kaitsmiseks väga oluline. Kuna Cistanche on erilise ökoloogilise tüübiga liik, tuleks teda kaitsta peamiselt in situ ning Cistanche looduskaitsebaas tuleks rajada vastavalt tema geneetilisele mitmekesisusele. Näiteks selleksCistanche tubulosa, kuna geneetiline mitmekesisus pärineb peamiselt populatsiooni seest, on esmatähtsateks kaitseobjektideks suure geneetilise mitmekesisusega populatsioonid [12], näiteks Minfengi Angier ja Yutiani Daheyan. See on loetletud Cistanche loodusliku kaitsebaasina. Mis puudutabCistanche deserticola, on Sise-Mongoolia ja Xinjiangi populatsioonid läbi teinud olulisi muutusi, seega tuleks eksperimentaalseid uuringuid veelgi tugevdada, et määrata kindlaks populatsioonid, mille kaitseks on prioriteetne. Samal ajal viige läbi alusuuringuid Cistanche'i reproduktiivbioloogia ja tolmeldamisökoloogia kohta, et anda teavet selle edasiseks kaitseks.

Viited

[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei jt. IdentifitseerimineCistancheja kaubanduslike ravimmaterjalide uurimine. Chinese Medicinal Materials, 1997, 20(3):117.

[2] Liu Mingting. Tamarixi taimede põhjalik uurimine ja üldine rakendus. Lanzhou: Lanzhou ülikooli kirjastus, 1995.

[3] Fu Guoli. Hiina taimede punane raamat. Peking: Science Press, 1992.

[4] Hiina Rahvavabariigi ohustatud liikide impordi ja ekspordi haldusamet, Hiina Rahvavabariigi ohustatud liikide teaduskomitee. Ohustatud looduslike looma- ja taimeliikidega rahvusvahelise kauplemise konventsioon (CITES), II lisa. 2003.41.

[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding jt. Mitme ohustatud taime ja nende sugulaste kogu-DNA ekstraheerimine ja tuvastamine. Acta Botany, 1994, 36:528.

[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Sordiaretussüsteem, geneetiline struktuur ja kaitsegeneetiline mitmekesisus. Biodiversity, 1996, 4(2): 92.

[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Taimede evolutsioonibioloogia. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.

[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming jt. Hõbekuuse geneetilise mitmekesisuse RAPD analüüs. Hiina teadus (C), 1997, 40(2): 145.

[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen jt. Esialgne aruanne kääbuspojengi ja lilla pojengi RAPD analüüsi kohta. Chinese Journal of Plant Taxonomy, 1995, 33(4): 350.

[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Eeluuring teemalGeneetiline mitmekesisusTamarixi lansolaatsete looduslike populatsioonide kohta. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.

[11] Ellstrand NC, Elam D R. Väikese populatsiooni suuruse tagajärjed populatsioonigeneetikale: mõju taimekaitsele. Aastaülevaade Ökoloogia ja Süstemaatika, 1993, 34:217.

[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Populatsioonigeneetika põhimõte ja selle rakendamine haruldaste ja ohustatud taimede kaitsel. Biodiversity, 1999, 7(4): 340.

Alates: China Journal of Chinese Materia Medica; Vol. 29, väljaanne 8. august 2004