Tsirkulaarne RNA CircDVL1 pärsib selgerakulise neerurakulise kartsinoomi progresseerumist läbi MiR-412-3p/PCDH7 telje

Abstraktne

Selgerakuline neerurakk-kartsinoom (ccRCC) on kõrge agressiivse fenotüübi ja äärmiselt halva prognoosiga primaarne neeruvähk. Kogunev tõendusmaterjal viitab sellele, et tsirkulaarsed RNA-d (circRNA-d) mängivad keskset rolli inimese erinevate vähivormide esinemises ja arengus. TsircRNA-de ekspressioon, kliiniline tähtsus ja regulatiivne roll ccRCC-s jäävad siiski suures osas ebaselgeks. Siin teatame, et circDVL1 väheneb ccRCC patsientide seerumites ja kudedes ning korreleerub negatiivselt ccRCC pahaloomuliste tunnustega. CircDVL1 üleekspressioon inhibeerib proliferatsiooni, indutseerib G1 / S seiskumist, vallandab apoptoosi ning vähendab migratsiooni ja invasiooni erinevates ccRCC rakkudes in vitro . Vastavalt pärsib circDVL1 üleekspressioon ccRCC tuumorigeensust hiire ksenotransplantaadi mudelis. Mehhaaniliselt toimib circDVL1 onkogeense miR-412-3p käsnana, vältides sellega oma sihtmärk-protokadheriin 7 (PCDH7) miR-412-3p-vahendatud represseerimist ccRCC rakkudes. Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et circDVL1 avaldab ccRCC progresseerumisel circDVL1/miR-412-3p/PCDH7 telje kaudu kasvajat pärssivat funktsiooni ning viitavad sellele, et circDVL1 võib olla uudne diagnostiline ja prognostiline marker ning ccRCC terapeutiline sihtmärk.

Märksõnad

circDVL1; Neerurakuline kartsinoom; miR-412-3p; PCDH7; biomarker

Klõpsake siin, et näha, millised on Cistanche eelised

Sissejuhatus

Neerurakk-kartsinoom (RCC) on äärmiselt surmav uroloogilise süsteemi pahaloomuline kartsinoom, mis mõjutab tõsiselt inimeste tervist [1]. RCC esinemissagedus on viimastel aastakümnetel suurenenud – 2020. aastal diagnoositi Ameerika Ühendriikides 73 750 uut haigusjuhtu [2, 3]. Clear cell RCC (ccRCC), RCC kõige levinum ja agressiivsem alatüüp, moodustab 70–75 protsenti RCC juhtudest [4]. Oluline on see, et enam kui 30 protsenti ccRCC patsientidest on esialgse diagnoosimise ajal seotud metastaasidega. Pealegi, kuigi radikaalne kirurgia on primaarse ccRCC peamine ravivõimalus, koges umbes 40 protsendil patsientidest retsidiive ja metastaase, mille 5-aastane üldine elulemus oli alla 10 protsendi [5, 6]. Need dilemmad rõhutavad tungivat vajadust uurida ccRCC arengu aluseks olevaid molekulaarseid mehhanisme nii diagnostiliste ja prognostiliste biomarkerite kui ka potentsiaalsete terapeutiliste sihtmärkidena.

Tsirkulaarsed RNA-d (circRNA-d) on mittekodeerivad RNA-d, millel on üheahelalised suletud ahelaga struktuurid, mis muudavad need väga stabiilseks [7, 8]. Hiljutised uuringud on näidanud, et tsirkRNA-sid leidub rohkesti veres [9, 10], süljes [11] ja eksosoomides [12], mis näitab, et need võivad toimida uute diagnostiliste biomarkeritena [13]. Arvestades, et vedelbiopsia on vähem invasiivne kui traditsiooniline koebiopsia [14], on tsircRNA-sid peetud väärtuslikeks täppismeditsiini ennustamisvahenditeks [15-17]. Täpsemalt võivad mitmed tsirRNA-d, nagu cricNOX4, circEGLN3 ja circPRRC2A, toimida potentsiaalsete biomarkeritena RCC diagnoosimisel ja/või prognoosimisel, mis on kokku võetud meie hiljutises ülevaates [18]. Lisaks keskenduvad praegused uuringud peamiselt tsircRNA ekspressiooni vaheldumisele ccRCC kudedes [19, 20], kuid nende tasemed vedelas biopsias on suures osas teadmata, mis takistab potentsiaalsete biomarkerite uurimist. Lisaks, kuigi on näidatud, et mitmed tsirRNA-d, sealhulgas circHIAT1 [21], circ-AKT3 [22] ja cRAPGEF5 [23], mängivad olulist rolli ccRCC [18] initsieerimisel ja progresseerumisel, on ccRCC-ga seotud tsirRNA-de süstemaatiline uurimine. areng ja nende aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid on endiselt puudulikud.

Siin määrasime kõigepealt tsircRNA-de ekspressiooni ccRCC patsientide ja tervete kontrollide seerumiproovides, kasutades tsircRNA mikrokiibi. Oluline on see, et tuvastasime uudse ccRCC-ga seotud circRNA circDVL1 (rümba ID: hsa_circ_ 0009267), mis on kodeeritud DVL1 geenis. CircDVL1 on ccRCC-ga patsientide seerumis oluliselt vähenenud ja selle ekspressioon on pöördvõrdelises korrelatsioonis ccRCC Fuhrmani klassifikatsiooniga, mis viitab potentsiaalile biomarkerina. Lisaks väheneb CircDVL1 ccRCC kasvaja kudedes. Vastavalt sellele võib circDVL1 pärssida proliferatsiooni, indutseerida rakutsükli peatamist, vallandada apoptoosi ja vähendada ccRCC rakkude migratsiooni ja invasiooni. Mehaaniliselt toimib circDVL1 miR-412-3p käsna PCDH7 ekspressiooni ülesreguleerimiseks. Need leiud identifitseerivad ühiselt circDVL1 ccRCC kasvaja supressorina ja viitavad selle potentsiaalile nii diagnostilise biomarkerina kui ka terapeutilise sihtmärgina.

Cistanche toidulisand

Materjalid ja meetodid

1. Kliinilised proovid

Selle uuringu kiitis heaks Zhejiangi ülikooli esimese sidushaigla (2021-104) eetikakomitee. ccRCC-ga patsientidelt koguti kaheksateist sobivat ccRCC ja külgnevate mittekasvaja kudede proovi. Proovid säilitati pärast operatsiooni kiiresti vedelas lämmastikus ja seejärel säilitati -80 kraadi juures kuni edasise kasutamiseni. Koguti seerumiproovid 60 ccRCC patsiendilt ja 66 tervelt kontrollilt. Seejärel töödeldi proove sobivate meetoditega ja saadud seerumit säilitati -80 kraadi juures kuni edasise kasutamiseni.

2. Rakuliinid ja rakukultuur

Kõik rakuliinid osteti riiklikust autentitud rakukultuuride kollektsioonist (Hiina). 786-O ja Caki-1 rakke kultiveeriti RPMI 1640 (HyClone), ACHN rakke MEM (HyClone) ja 293T rakke kasvatati DMEM (Gibco) söötmes. Kõigile rakukultuuri söötmetele lisati 10 protsenti veise loote seerumit (Gibco) ja 1 protsenti penitsilliini ja streptomütsiini segu (Gibco). Rakukultuure hoiti niisutatud inkubaatoris temperatuuril 37 kraadi ja 5 protsenti CO₂.

3. CircRNA mikrokiibi analüüs

CircRNA mikrokiibi profileerimine seerumiproovides viidi läbi, kasutades Arraystar inimese CircRNA Array V2 (Capital Biotechnology, Hiina). Andmete summeerimiseks, normaliseerimiseks ja mikrokiibi kvaliteedikontrolliks kasutati tarkvara GeneSpring V13.0 (Agilent Technologies). Statistiliselt oluliseks peeti CircRNA-sid, mille kordse muutuse lävi oli suurem või võrdne 2 ja väiksem või võrdne -2 ning P-väärtus < 0,05. Hierarhiline klastri analüüs viidi läbi standardiseeritud eukleidilise kauguse abil koos täieliku sidemega.

4. RNA sekveneerimine (RNA-seq) ja andmete analüüs

Järgmise põlvkonna RNA-seq viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [24, 25]. RNA sekveneerimiseks kasutati miR-412-3p ja kontroll-miimikaga transfekteeritud 786-0 rakke. Raamatukogu ehituse ja algandmete bioinformaatika analüüsid viis läbi Novogene Co., Ltd. (Peking, Hiina). RNA-seq andmed deponeeriti Gene Expression Omnibus (GEO) registreerimisnumbri GSE175492 all.

5. RNA ekstraheerimine ja reaalajas kvantitatiivne RT-PCR (RT-qPCR)

RT-qPCR viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [26, 27]. Kogu RNA eraldati seerumist, rakkudest ja kasvajakudedest, kasutades AG RNAex Pro reagenti (AG, Hunan, Hiina). Tsirkul-RNA tuvastamiseks lõigati 1 ug kogu RNA-d RNase R-ga (3 U/ug, Epicenter Technologies, Madison, USA, kat nr RNR07250) 37 kraadi juures 10 minutit ja komplementaarne DNA (cDNA) genereeriti HiScript II 1st abil. Strand cDNA sünteesikomplekt (Vazyme). CircRNA ja mRNA ekspressioonitasemed normaliseeriti -aktiiniks. MiRNA ekspressiooni määramiseks viidi läbi pöördtranskriptsioon miR-XTM miRNA esimese ahela sünteesikomplektiga (Takara Bio USA, CA, USA, kat. nr 638313), mille endogeenseks kontrolliks oli U6 (Rnu6–1) ekspressioon. Suhteline RNA ekspressioonitase määrati 2-ΔΔCt meetodiga. Kõik qRT-PCR analüüsi praimerite järjestused on näidatud tabelis S2.

6. Plasmiidi ehitus ja stabiilne transfektsioon

CircDVL1 ja circDVL1-MUT üleekspressioonivektori konstrueerimiseks klooniti circDVL1 ja muteeritud circDVL1 järjestus pcDNA 3.1( plus ) Laccase 2 MCS Exon vektorisse, mis telliti Addgene'ilt (#69893) [28]. ACHN- ja 786-O-rakud transfekteeriti tsirkRNA ja negatiivse kontrollvektoriga, kasutades Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). 48 tunni pärast selekteeriti circDVL1 ekspresseerivad stabiilselt transfekteeritud rakud, lisades söötmele 800 ug/ml G418.

7. Rakkude elujõulisus

Rakkude elujõulisuse test määrati CCK8 komplektiga (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Jaapan, Cat# CK04), nagu eelnevalt kirjeldatud [29]. 786-O ja ACHN circDVL1 üleekspresseerivad ja kontrollrakud külvati 96-augu plaatidele. Näidatud ajal lisati CCK8 lahus (10 μL) ja inkubeeriti 37 kraadi juures 2 tundi ning neeldumist mõõdeti spektrofotomeetriga.

Herba Cistanche

8. Kolooniate teke

Kolooniate moodustumise testid viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [24]. ACHN (800 rakku süvendis) ja 786-O rakku (400 rakku süvendis) kultiveeriti 10 päeva ja seejärel fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga ligikaudu 30 minutit, millele järgnes värvimine 0,1 protsendiga. kristallvioletne lahus umbes 15 minutit. Rohkem kui 50 rakku sisaldavad kloonid loendati ühe kolooniana.

9. Rakutsükli analüüs

Rakud sünkroniseeriti RPMI 1640 söötmes ilma FBS-ita üleöö ja lülitati järgmise 48 tunni jooksul söötmele 10% FBS-iga. Rakud pesti, resuspendeeriti 70% etanoolis PBS-is ja säilitati öö läbi temperatuuril -20 kraadi. Järgmisena värviti rakud rakutsükli analüüsiks propiidiumjodiidi (PI) lahusega, mis sisaldas RNaasi A.

10. Apoptoosi analüüs

ACHN- ja 786-O-rakkude apoptoosi analüüs viidi läbi anneksiin V-FITC/PI apoptoosi tuvastamise komplektiga (Beijing Biosea Biotechnology, Hiina), järgides tootja juhiseid.

11. Rakkude migratsiooni ja invasiooni testid

In vitro hinnati rakkude migratsioonivõimet 8 μm pooridega polükarbonaatmembraanidega transwell-kambrite abil (Millipore, MA, USA). Rakkude invasiooni testid viidi läbi 100 µl Matrigeli (BD Biosciences, USA) kaetud transwell-kambritega. 786-O-rakud (2×104) või ACHN-rakud (4×104) suspendeeriti 200 µl RPMI 1640-s ilma seerumita ja külvati ülemistesse transwell-kambritesse ning seejärel lisati 600 µl söödet, mis sisaldas 20 protsenti FBS-i. alumistesse kambritesse. Seejärel kultiveeriti rakke 24 tundi migratsiooni mõõtmiseks ja 48 tundi invasiooni hindamiseks. Ülemises kambris olevaid rakke kraabiti hoolikalt ja alumises kambris olevad rakud fikseeriti 4-protsendilise paraformaldehüüdiga ja värviti kristallvioletiga. Tehti pildid ja rakud loendati mikroskoobiga.

12. Western blot

Kogu valk ekstraheeriti, kvantifitseeriti ja eraldati 10% SDS-PAGE geelidel ning kanti seejärel polüvinülideendifluoriidmembraanidele (Millipore, MA, USA), mida inkubeeriti primaarse anti-glütseraldehüüdi 3-fosfaatdehüdrogenaasiga (GAPDH). (Proteinch, 60004-1-Ig), anti-PCDH7 (Abcam, ab139274) primaarsed antikehad 4 kraadi juures üleöö.

13. Immunofluorestsentsvärvimine

Rakud külvati katteklaasidele 24 tunniks ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga, permeabiliseeriti 0,2% Triton X-100-ga 20 minutit ja inkubeeriti 5% veise seerumi albumiiniga. Järgmisena inkubeeriti rakke Ki67 suhtes spetsiifilise primaarse antikehaga (1:400, ab48027, Abcam) 4 kraadi juures üleöö ja seejärel inkubeeriti 488-konjugeeritud kitse küülikuvastase IgG-ga (1:150, D110088, Sangon). ) temperatuuril 37 kraadi 1 tund. Rakud värviti 4′,6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI) ja kujutised saadi Leica fluorestsentsmikroskoobiga (DM4000).

14. In vivo kasvaja moodustumine ja Ki67 värvimine

Kuuenädalased isased BALB/c nude hiired (osteti Shanghai SLAC-ist) jagati 2 rühma (n=5 iga rühma kohta). Hiired inokuleeriti subkutaanse süstimise teel ligikaudu 3 × 106 kontrollraku või circDVL1 üleekspresseerivate ACHN-rakkudega. Kasvaja suurust mõõdeti libiseva nihikuga iga 3 päeva järel, alates 6. päevast pärast süstimist. Kasvaja maht arvutati kui pikkus × laius × kõrgus / 2. Kõik katsed viidi läbi vastavalt laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhistele (NIH väljaanne 80-23, muudetud 1996) ja need kiitis heaks Hiina Hangzhou Zhejiangi ülikooli loomahoolduskomitee.

Cistanche kapslid

15. Fluorestsents-in situ hübridisatsioon (FISH)

Sünteesiti circDVL1 topeltdigoksigeniini (DIG) - mädarõika peroksidaasi (HRP) sond (Exon Biotechnology, Guangzhou, Hiina). Kontroll- ja circDVL1 üleekspresseerivaid ACHN-rakke kultiveeriti katteklaasidel ja inkubeeriti märgistatud sondiga 37 kraadi juures 24 tundi. Pärast pesemist inkubeeriti slaide DIG-vastases sekundaarses antikehas 37 kraadi juures 1 tund. TsircDVL1 signaalide tuvastamiseks kasutati türamiini signaali võimendamise meetodit ja rakud värviti DAPI-ga. Kaas-FISH jaoks inkubeeriti katteklaase DIG-märgistatud circDVL1 ja biotiiniga märgistatud miR-412-3p.

16. RNA immunosadestamise (RIP) test

RIP testid viidi läbi Magna RIP™ RNA-siduva valgu immunosadestamise komplektiga (Millipore, MA, USA). 786-O-rakud lüüsiti täielikus RIP lüüsipuhvris ja inkubeeriti seejärel immunosadestamispuhvriga, mis sisaldas magnethelmeid, mis konjugeeriti AGO2 (Abcam, MA, USA) või IgG antikehakompleksiga 4 kraadi juures üleöö. Seejärel testiti immunosadestatud RNA-sid RT-qPCR abil.

17. Kahe lutsiferaasi reporteranalüüs

CircDVL1, PPM1H-3'UTR ja PCDH7-3'UTR järjestused, mis sisaldasid muteeritud miR-412-3p sidumissaite ja nende vastavad muteerunud järjestused, sünteesiti ja seejärel subklooniti lutsiferaasi reporterisse. vektor psiCHECK-2 (Promega), et luua circDVL1-WT, circDVL1-Mut1, circDVL1-Mut2, PPM1H-3'UTR-WT, PCDH{ {14}}'UTRWT, PCDH7-3'UTR-Mut1 ja PCDH7-3'UTR-Mut2 vektorid. PPM1H ja PCDH7 erinevad 3'UTR järjestused sisaldavad 500 aluspaari pikkust fragmenti, mis sisaldab potentsiaalseid miR-412-3p sidumissaite (külgneb 250 aluspaariga). Suhtelist lutsiferaasi aktiivsust hinnati kahe lutsiferaasi reporteranalüüsiga (Promega, USA). Kõik testid viidi läbi kolmes sõltumatus korduses.

18. Statistiline analüüs

Statistilised analüüsid viidi läbi rakendusega GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Rühmadevahelisi erinevusi hinnati Studenti t-testide või ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil. Erinevusi rühmade vahel peeti statistiliselt olulisteks, kui P-väärtused olid < 0,05.

Arutelu

Eksperimentaalselt on välja pakutud ja hinnatud erinevat tüüpi ccRCC biomarkereid, sealhulgas mRNA-sid [32], miRNA-sid [33], lncRNA-sid [34] ja tsirRNA-sid [35]. Ükski neist ei ole aga kinnitatud täpsete diagnostiliste biomarkeritena rutiinseks kliiniliseks kasutamiseks ccRCC patsientidel. Siin näitas meie uuring, et circDVL1 mängib olulist rolli ccRCC progresseerumisel. Esiteks skriinisime ccRCC patsientide ja tervete kontrollide seerumit, et tuvastada erinevalt ekspresseeritud tsirRNA-sid, kasutades tsircRNA mikrokiibi. RT-qPCR andmed näitasid, et circDVL1 oli ccRCC proovides dramaatiliselt alla reguleeritud. Varasemad uuringud on näidanud, et tsircRNA-d võivad toimida latentsete seerumi biomarkeritena erinevate vähivormide korral [36, 37]. Näiteks Bei et al. näitasid, et eksosomaalne has-circ{10}} suurenes kolorektaalse vähiga patsientidelt kogutud seerumis [38]. Sellegipoolest on uuringud tsircRNA kui mitteinvasiivse biomarkerina ccRCC-s spetsiifilise rolli kohta endiselt piiratud. Meie uuring näitas, et circDVL1 oli ccRCC-ga patsientide seerumis oluliselt alareguleeritud ja et seerumi circDVL1 vähenenud ekspressioon võib olla kasvajast tulenev. Lisaks oli seerumi circDVL1 tasemel märkimisväärne diagnostiline väärtus Fuhrmani I-II astme ja Fuhrmani III-IV astme kasvajatega patsientide eristamisel. Seetõttu võib seerumi circDVL1 olla ccRCC paljutõotav diagnostiline marker. Siiski näitasid mitmed terved patsiendid seerumis madalat circDVL1 taset, mis näitab, et patsiendi jälgimine, mis põhineb ainult selle ringleva RNA analüüsil, võib põhjustada valepositiivseid tulemusi. Seetõttu on circDVL1 väärtus ühe diagnostilise markerina mõnevõrra piiratud ja kasvaja arengu ja metastaaside usaldusväärse prognoosi saamiseks võib olla vaja analüüsida erinevate ringlevate RNA-de kombinatsiooni.

Hiljuti tuvastatud tsircRNA-na ei olnud circDVL1 bioloogilist ja patoloogilist rolli uuritud. Selles uuringus hindasime circDVL1 rolli ja regulatiivset mehhanismi ccRCC-s. Funktsionaalsed testid näitasid, et üleekspresseeritud circDVL1 võib vähendada ccRCC rakkude proliferatsiooni, kolooniate moodustumise võimet ja tuumorigeenset potentsiaali, mis on tõenäoliselt tingitud raku apoptoosist in vitro ja kasvaja arengu pärssimisest in vivo. Andmed viitasid sellele, et circDVL1-l võib olla ccRCC-s kasvaja supressor.

CircRNA-d võivad soodustada kasvaja teket ja progresseerumist, toimides miRNA käsnadena. Seetõttu uurisime, kas circDVL1 võib reguleerida miRNA biogeneesi ccRCC kantserogeneesi ajal. Kasutades miRanda ja miRWalki tarkvara, leidsime, et circDVL1-l oli potentsiaalne seostumiskoht miR-412-3p jaoks. Lutsiferaasi reporteranalüüsid näitasid otsest seost circDVL1 ja miR{4}}p vahel. Varasemad uuringud on näidanud, et miR-412-3p osales erinevate molekulaarsete mehhanismide kaudu erinevate vähivormide patogeneesis [31, 39, 40]. Näiteks oli miR-412-3p onkogeenne roll käärsoolevähi puhul, soodustades vähi tüvirakkude migratsiooni, invasiooni ja rakkude proliferatsiooni [31]. Veelgi enam, suu lamerakk-kartsinoomi (OSCC) patsientide ekstratsellulaarsetes vesiikulites oli miR-412-3p ekspressioon ülesreguleeritud [39]. Samamoodi näitasid meie tulemused, et miR-412-3p oli ccRCC-s oluline kasvaja promootor.

Cistanche pulber

Lisaks tuvastati ka circDVL1/miR-412-3p sihtmärk. Protokadheriinid (PCDH-d) on kadheriini superperekonda kuuluvad transmembraansed valgud, mis mängivad olulist rolli rakkude adhesioonis ja signaaliradades. PCDH7 on PCDH perekonna liige ja sellel on väljakujunenud roll raku-rakkude äratundmisel ja rakkude adhesioonil [41]. Üldiselt on teada, et adhesiooni kadumine on kasvajarakkude invasiooni ja metastaaside varajane samm. Uued tõendid näitavad, et PCDH7 ekspresseerub erinevates kasvajatüüpides ebanormaalselt. Näiteks inimese mitteväikerakk-kopsuvähi korral ekspresseeriti PCDH7 sageli üle ja toimis onkogeenina, et indutseerida raku transformatsiooni ja soodustada kopsukasvaja teket, võimendades MAPK signaaliülekannet [42]. Seevastu PCDH7 pärssis maovähirakkude migratsiooni ja invasiooni E-kadheriini kaudu [43]. Veelgi enam, kolorektaalse [44] ja põievähi [45] puhul on leitud PCDH7 ekspressiooni vähenemist. Need andmed näitasid, et PCDH7-l oli erinevates kasvajatüüpides erinevaid funktsioone. Selles uuringus näitasime, et PCDH7 tasemed vähenesid ccRCC kasvajaproovides. Huvitaval kombel näitasid funktsionaalsed päästekatsed, et circDVL1 kasvaja supressoromadused on osaliselt tingitud selle mõjust PCDH7-le. Meie uuring viitab kindlalt circDVL1/miR-412-3p/PCDH7 regulatoorse telje tähtsusele ccRCC progresseerumisel.

Sellel uuringul on mitmeid piiranguid. Testisime endogeense circDVL1 jaoks kolme spetsiifilist siRNA-d, kuid kahjuks ei suutnud kõik need siRNA-d circDVL1-d maha lüüa tõenäoliselt selle circRNA ainulaadse struktuuri ja selle madala basaalekspressiooni tõttu ccRCC rakkudes. Lisaks näitasid meie tulemused, et circDVL1 võib olla ccRCC-ga patsientide terapeutiline sihtmärk, selle kliinilise tähtsuse edasiseks demonstreerimiseks on vaja kliinilisi uuringuid suurte patsientide rühmadega. Meie uuringus ei uurinud me circDVL1 alareguleerimise põhjust ccRCC kahjustustes. On teatatud, et RNA-d siduvad valgud (RBP-d), sealhulgas värisev (QKI), epiteeli splaissimise reguleeriv valk 1 (ESRP1) ja fused-in-sarcoma (FUS) osalevad tsirkulaarsete RNA-de transkriptsioonijärgses moodustumises [{{10] }}]. Lisaks on teatud transkriptsioonifaktorid (nt ZEB1, c-Myb ja c-Jun) samuti seotud spetsiifiliste tsirkulRNA-de biogeneesiga [49-52]. Samuti on uuringud näidanud, et m6A modifikatsioon vahendab tsirkulRNA lagunemist. Park jt. teatas, et m6A-ga modifitseeritud tsircRNA-sid reguleeriti alla ka YTHDF2- HRSP12-RNaasi P/MRP telje kaudu [53]. Kas need RBP-d, transkriptsioonifaktorid ja m6A metüülimine on seotud circDVL1 allareguleerimisega, jääb ebakindel. Oma tulevastes uuringutes püüame uurida circDVL1 ülesvoolu reguleerivat mehhanismi ccRCC arengus ja tuumorigeneesis.

Kokkuvõttes näitasime, et ccRCC patsientide seerumis vähenes circDVL1 tase. Eelkõige uurisime täiendavalt circDVL1 regulatiivseid mehhanisme ja näitasime, et circDVL1 pärssis ccRCC tuumorigeneesi, soodustades PCDH7 ekspressiooni miR-412-3p sponging abil. Seetõttu näitas meie uuring, et circDVL1 võib olla potentsiaalne terapeutiline sihtmärk tulevaste ccRCC-ravi jaoks.

Viited

1.Cheng SK, Chuah KL. Pankrease metastaatiline neerurakuline kartsinoom: ülevaade. Patoloogia ja laborimeditsiini arhiiv. 2016; 140: 598-602.

2. Jonasch E, Walker CL, Rathmell WK. Selge rakuline neerurakk-kartsinoomi ontogenees ja letaalsuse mehhanismid. Nat Rev Nephrol. 2021; 17: 245-61.

3. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Vähi statistika, 2020. CA Cancer J Clin. 2020; 70.

4. Shuch B, Amin A, Armstrong AJ, Eble JN, Ficarra V, Lopez-Beltran A jt. Neerurakulise kartsinoomi patoloogiliste variantide mõistmine: terapeutiliste võimaluste destilleerimine bioloogilisest keerukusest. Euroopa uroloogia. 2015; 67: 85-97.

5. Koul H, Huh JS, Rove KO, Crompton L, Koul S, Meacham RB jt. Neerurakulise kartsinoomi molekulaarsed aspektid: ülevaade. Am J Cancer Res. 2011; 1: 240-54.

6. Sanchez-Gastaldo A, Kempf E, Gonzalez Del Alba A, Duran I. Neerurakkude vähi süsteemne ravi: põhjalik ülevaade. Cancer Treat Rev. 2017; 60: 77-89.

7. Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK, Hansen TB, Kjems J. Ring-RNA-de biogenees, bioloogia ja iseloomustus. Looduse ülevaated geneetikast. 2019; 20: 675-91.

8. Patop IL, Wüst S, Kadener S. TsirRNAde minevik, olevik ja tulevik. EMBO ajakiri. 2019; 38: e100836.

9. Perez de Acha O, Rossi M, Gorospe M. Circular RNAs in Blood Malignancies. Esiosa Mol Biosci. 2020; 7: 109.

10. Zhang SJ, Chen X, Li CP, Li XM, Liu C, Liu BH jt. Tsirkulaarsete RNA-de identifitseerimine ja iseloomustamine kui uus oletatavate biomarkerite klass diabeetilise retinopaatia korral. Uuriv oftalmoloogia ja visuaalne teadus. 2017; 58: 6500-9.

11. Bahn JH, Zhang Q, Li F, Chan TM, Lin X, Kim Y jt. MikroRNA, Piwiga interakteeruva RNA ja ringikujulise RNA maastik inimese süljes. Kliiniline keemia. 2015; 61: 221-30.

12. Li Y, Zheng Q, Bao C, Li S, Guo W, Zhao J jt. Ringikujuline RNA on eksosoomides rikastatud ja stabiilne: paljutõotav biomarker vähi diagnoosimiseks. Rakuuuringud. 2015; 25: 981-4.

13. Li S, Han L. Ring-RNAd kui paljulubavad biomarkerid vähi korral: avastamine, funktsioon ja muu. Genoomi meditsiin. 2019; 11:15.

14. Ye Q, Ling S, Zheng S, Xu X. Vedelbiopsia hepatotsellulaarse kartsinoomi korral: ringlevad kasvajarakud ja ringleva kasvaja DNA. Mol Vähk. 2019; 18: 114.

15. Wen G, Zhou T, Gu W. Vere tsirkulaarse RNA kasutamise potentsiaal inimeste haiguste vedela biopsia biomarkerina. Valgu rakk. 2020.

16. Zhang Z, Yang T, Xiao J. Ringlikud RNA-d: paljulubavad biomarkerid inimese haiguste jaoks. EBiomeditsiin. 2018; 34: 267-74.

17. Wang S, Zhang K, Tan S, Xin J, Yuan Q, Xu H jt. Tsirkulaarsed RNA-d kehavedelikes vähi biomarkeritena: vedelate biopsiate uus piir. Mol Vähk. 2021; 20:13.

18. Wang Y, Zhang Y, Wang P, Fu X, Lin W. Ringikujulised RNA-d neerurakulise kartsinoomi korral: mõju tuumorigeneesile, diagnoosimisele ja ravile. Mol Vähk. 2020; 19: 149.

19. Chen D, Chen W, Xu Y, Zhu M, Xiao Y, Shen Y jt. Ülereguleeritud immuunkontrollpunkt HHLA2 selgerakulise neerurakulise kartsinoomi korral: uudne prognostiline biomarker ja potentsiaalne terapeutiline sihtmärk. J Med Genet. 2019; 56: 43-9.

20. Lv Q, Wang G, Zhang Y, Shen A, Tang J, Sun Y jt. CircAGAP1 soodustab kasvaja progresseerumist, muutes miR-15-5p selgerakulise neerurakulise kartsinoomi korral. J Exp Clin Cancer Res. 2021; 40:76.

21. Wang K, Sun Y, Tao W, Fei X, Chang C. Androgeeniretseptor (AR) soodustab selgerakulise neerurakulise kartsinoomi (ccRCC) migratsiooni ja invasiooni, muutes circHIAT1/miR-195-5p/29a{{ 4}}p/29c-3p/CDC42 signaalid. Vähi kirjad. 2017; 394: 1-12.

22. Xue D, Wang H, Chen Y, Shen D, Lu J, Wang M jt. Circ-AKT3 inhibeerib selge rakulise neerurakulise kartsinoomi metastaase, muutes miR-296-3p/E-kadheriini signaale. Molekulaarne vähk. 2019; 18: 151.

23. Chen Q, Liu T, Bao Y, Zhao T, Wang J, Wang H jt. CircRNA cRAPGEF5 pärsib neerurakulise kartsinoomi kasvu ja metastaase miR-27a-3p/TXNIP raja kaudu. Vähi kirjad. 2019; 469: 68-77.

24. Guo X, Lin W, Wen W, Huyghe J, Bien S, Cai Q jt. Uute kolorektaalse vähi riski tundlikkuse geenide tuvastamine 125 478 subjektiga hõlmatud transkriptsiooni hõlmava assotsiatsiooniuuringu põhjal. Gastroenteroloogia. 2021; 160.

25. Wang J, Nie W, Xie X, Bai M, Ma Y, Jin L jt. MicroRNA-874-3p/ADAM (A disintegriin ja metalloproteaas) 19 vahendab makrofaagide aktivatsiooni ja neerufibroosi pärast ägedat neerukahjustust. Hüpertensioon. 2021; 77: 1613-26.

26. Kun-Peng Z, Chun-Lin Z, Jian-Ping H, Lei Z. Uudne tsirkuleeriv hsa_circ_0081001 toimib potentsiaalse biomarkerina osteosarkoomi diagnoosimisel ja prognoosimisel. Int J Biol Sci. 2018; 14: 1513-20.

27. Yuan Y, Bao J, Chen Z, Villanueva AD, Wen W, Wang F jt. Multi-omika analüüs kolorektaalse vähi vastuvõtlikkuse geenide tuvastamiseks. Hum Mol Genet. 2021. aasta.

28. Kramer MC, Liang D, Tatomer DC, Gold B, March ZM, Cherry S jt. Drosophila tsirkulaarse RNA ekspressiooni kombineeritud kontroll introniliste korduste, hnRNP-de ja SR-valkude abil. Genes Dev. 2015; 29: 2168-82.

29. Guo X, Lin W, Bao J, Cai Q, Pan X, Bai M jt. Põhjalik cis-eQTL analüüs näitas kogu genoomi hõlmavate assotsiatsiooniuuringute käigus tuvastatud rinnavähi tundlikkuse lookuste sihtgeene. Olen J Hum Genet. 2018; 102: 890-903.

30. Zhong S, Wang J, Zhang Q, Xu H, Feng J. CircPrimer: tarkvara tsirkRNA-de märkimiseks ja tsirRNA praimerite spetsiifilisuse määramiseks. BMC bioinformaatika. 2018; 19: 292.

31. Zhu K, Wang Y, Liu L, Li S, Yu W. Pikk mittekodeeriv RNA MBNL1-AS1 reguleerib vähi tüvirakkude proliferatsiooni, migratsiooni ja invasiooni käärsoolevähi korral, toimides MYL9-ga sponging-mikroRNA kaudu -412-3lk. Hepatoloogia ja gastroenteroloogia kliinikud ja uuringud. 2020; 44: 101-14.

32. Schrödter S, Braun M, Syring I, Klümper N, Deng M, Schmidt D jt. Dopamiini transporteri SLC6A3 identifitseerimine neerurakulise kartsinoomiga patsientide biomarkerina. Molekulaarne vähk. 2016; 15:10.

33. Ran L, Liang J, Deng X, Wu J. miRNA-d selgerakulise neerurakulise kartsinoomi prognoosimisel. Biomed Res Int. 2017; 2017: 4832931.

34. Li JK, Chen C, Liu JY, Shi JZ, Liu SP, Liu B jt. Pikaajaline mittekodeeriv RNA MRCCAT1 soodustab selgerakulise neerurakulise kartsinoomi metastaase, inhibeerides NPR3 ja aktiveerides p38-MAPK signaaliülekande. Molekulaarne vähk. 2017; 16: 111.

35. Sheng JQ, Liu L, Wang MR, Li PY. Tsirkulaarsed RNA-d seedesüsteemi vähis: potentsiaalsed biomarkerid ja terapeutilised sihtmärgid. Am J Cancer Res. 2018; 8: 1142-56.

36. Vea A, Llorente-Cortes V, de Gonzalo-Calvo D. Ringikujulised RNA-d veres. Adv Exp Med Biol. 2018; 1087: 119-30.

37. Vo JN, Cieslik M, Zhang Y, Shukla S, Xiao L, Zhang Y jt. Ringikujulise RNA maastik vähis. Kamber. 2019; 176.

38. Pan B, Qin J, Liu X, He B, Wang X, Pan Y jt. Seerumi eksosomaalse has-circ-0004771 tuvastamine kolorektaalse vähi uudse diagnostilise biomarkerina. Front Genet. 2019; 10: 1096.

39. Gai C, Camussi F, Broccoletti R, Gambino A, Cabras M, Molinaro L jt. Sülje ekstratsellulaarsed vesiikuliga seotud miRNA-d kui potentsiaalsed biomarkerid suu lamerakk-kartsinoomi korral. BMC vähk. 2018; 18: 439.

40. Lenherr SM, Tsai S, Silva Neto B, Sullivan TB, Cimmino CB, Logvinenko T jt. MicroRNA ekspressiooniprofiil tuvastab kõrge astme mittelihastesse invasiivsed põiekasvajad, millel on kõrge risk areneda invasiivseks fenotüübiks. Geenid (Basel). 2017; 8.

41. Yoshida K. Fibroblasti rakkude kuju ja adhesiooni in vitro muudab protokadheriini 7 isovormide 7a ja 7b, kuid mitte 7c isovormi üleekspressioon. Cell Mol Biol Lett. 2003; 8: 735-41.

42. Zhou X, Updegraff BL, Guo Y, Peyton M, Girard L, Larsen JE jt. PROTOCADHERIN 7 toimib SET-i ja PP2A kaudu, et tugevdada MAPK signaalimist EGFR-i ja KRAS-i poolt kopsukasvaja tekke ajal. Cancer Res. 2017; 77: 187-97.

43. Chen HF, Ma RR, He JY, Zhang H, Liu XL, Guo XY jt. Protokadheriin 7 pärsib maovähi korral rakkude migratsiooni ja invasiooni E-kadheriini kaudu. Tumor Biol. 2017; 39: 1010428317697551.

44. Bujko M, Kober P, Mikula M, Ligaj M, Ostrowski J, Siedlecki JA. Rakkude ja rakkude adhesiooniga seotud geenide ekspressioonimuutused kolorektaalsetes kasvajates. Oncol Lett. 2015; 9: 2463-70.

45. Lin YL, Wang YL, Fu XL, Li WP, Wang YH, Ma JG. Protokadheriin7 (PCDH7) madal ekspressioon on potentsiaalne prognostiline biomarker primaarsele mitte-lihasesse invasiivsele põievähile. Oncotarget. 2016; 7: 28384-92.

46. ​​Conn SJ, Pillman KA, Toubia J, Conn VM, Salmanidis M, Phillips CA jt. RNA-d siduva valgu värisemine reguleerib tsirkRNA-de moodustumist. Kamber. 2015; 160: 1125-34.

47. Errichelli L, Dini Modigliani S, Laneve P, Colantoni A, Legnini I, Capauto D jt. FUS mõjutab tsirkulaarset RNA ekspressiooni hiire embrüonaalsete tüvirakkudest pärinevates motoorsetes neuronites. Nat Commun. 2017; 8: 14741.

48. Yu CY, Li TC, Wu YY, Yeh CH, Chiang W, Chuang CY jt. Ringikujuline RNA circBIRC6 osaleb inimese pluripotentsust kontrollivas molekulaarses vooluringis. Nat Commun. 2017; 8: 1149.

49. Lee YH, Kim HS, Kim JS, Yu MK, Cho SD, Jeon JG jt. C-my reguleerib tselluloosi elujõulisuse autofagiat glükoosi oksüdatiivse stressi korral. J Dent Res. 2016; 95: 430-8.

50. Li Q, Wang Y, Wu S, Zhou Z, Ding X, Shi R jt. CircACC1 reguleerib AMPK kompleksi kokkupanekut ja aktiveerimist metaboolse stressi all. Lahtri metab. 2019; 30.

51. Ren C, Zhang Z, Wang S, Zhu W, Zheng P, Wang W. Ringikujuline RNA hsa_circ_0001178 hõlbustab kolorektaalvähi invasiooni ja metastaase ZEB1 ülesreguleerimise kaudu mitme miRNA kaudu. Biol Chem. 2020; 401: 487-96.

52. Zeng K, Chen X, Xu M, Liu X, Hu X, Xu T jt. CircHIPK3 soodustab kolorektaalse vähi kasvu ja metastaase, tuues miR-7. Cell Death Dis. 2018; 9: 417.

53. Park OH, Ha H, Lee Y, Boo SH, Kwon DH, Song HK jt. mA-d sisaldavate RNA-de endoribonukleolüütiline lõhustamine RNaasi P/MRP kompleksiga. Mol Cell. 2019; 74.

Ying Wang1,2, Yunjing Zhang1,2, Xinwan Su3, Qiongzi Qiu4, Yuan Yuan2, Chunhua Weng2, Sailan Zou5, Yan Tian5, Weidong Han6, Pengyuan Liu4, Xingyi Guo7, Jianhua Mao8, Xianghui 3, P5 fuqi

1. Neljas sidushaigla ja rahvusvahelised meditsiiniinstituudid, Zhejiangi ülikooli meditsiinikool, Jinhua 322000, Zhejiang, Hiina.

2. Neeruhaiguste keskus, esimene sidushaigla ja translatsioonimeditsiini instituut, Zhejiangi ülikooli meditsiinikool, Hangzhou 310003, Zhejiang, Hiina.

3. Uroloogia osakond, esimene sidushaigla, Zhejiangi ülikooli meditsiinikooli, Hangzhou 310003, Zhejiang, Hiina.

4. Hingamisteede meditsiini osakond, Sir Run Run Shaw haigla ja translatsioonimeditsiini instituut, Zhejiangi ülikooli meditsiinikool, Hangzhou 310016, Zhejiang, Hiina.

5. Endokrinoloogia ja ainevahetuse osakond, Lääne-Hiina haigla bioteraapia ja vähikeskuse riiklik võtmelabor, Sichuani ülikool ja bioteraapia koostööinnovatsiooni keskus, Chengdu 610041, Sichuan, Hiina.

6. Meditsiinilise onkoloogia osakond, Sir Run Run Shaw haigla, Zhejiangi ülikooli meditsiinikool, Hangzhou 310016, Zhejiang, Hiina.

7. Epidemioloogia osakond, Vanderbilti epidemioloogiakeskuse meditsiiniosakond ja Vanderbilt-Ingrami vähikeskus, Vanderbilti ülikooli meditsiinikool, Nashville 37203, TN, USA.

8. Nefroloogia osakond, riiklik lastetervise kliiniliste uuringute keskus, lastehaigla, Zhejiangi ülikooli meditsiinikool, Hangzhou 310003, Zhejiang, Hiina.