Cistanche Deserticola valemiga graanulite iseloomulik HPLC-MS profiil

 

Autorid: Mao Dan; Yu Hong; Mao Xiuhong; Hu Qing; Ji Shen*
Liit: Shanghai Toidu- ja Ravimikontrolli Instituut; NMPA traditsiooniliste hiina ravimite kvaliteedikontrolli võtmelabor, Shanghai 201203, Hiina

 

Abstraktne

HPLC-MS põhjal loodi Cistanche deserticola valemigraanulite iseloomulik kromatograafiline profileerimismeetod. Kasutades autentitud Cistanche deserticola keetmise tükke ja ehhinakosiidi võrdlusainet, ekstraheeriti kümme partiid proove otse 50% metanooliga ja analüüsiti HPLC abil. Eraldamine viidi läbi Phenomenex Luna C18 kolonnis (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) atsetonitriili ja 0,1% sipelghappe gradiendiga kiirusel 1,0 ml/min, 30 kraadi ja UV-tuvastusega 330 nm juures. Koostati üheksa ühise piigiga võrdluskromatogramm, millest viis piiki tuvastati LC/Q-TOF-MS abil. Kümne partii sarnasus oli suurem kui 0,981 või sellega võrdne. Iseloomuliku profiili täpsuse, stabiilsuse ja korratavuse mõõdikud olid rahuldavad. Meetod on lihtne, tuvastab tõhusalt Cistanche deserticola valemigraanulid ja seda saab kasutada kvaliteedi hindamiseks.

Märksõnad: Cistanche deserticola; valemgraanulid; iseloomulik kromatogramm; ehhinakosiid; verbaskosiid (akteosiid); HPLC; LC-Q-TOF-MS; cistanche hüvitised; parim cistanche müügiks

 

Cistanche tutvustus

Cistanche (Rou Cong Rong)on tuntud toonik traditsiooniline hiina meditsiin (TCM), millel on neere toniseeriv, essentsi toitev ja lahtistav toime. Esmakordselt salvestati see Shennong's Classic of Materia Medica ja loetleti kõrgema klassi ravimina. Hiina Rahvavabariigi farmakopöa 2020. aasta väljaanne (I osa) määratleb autentsete allikatena Cistanche deserticola YC Ma või Cistanche tubulosa (Schenk) Wighti kuivatatud, ketendavad, lihavad varred, mille töötlemismeetodid hõlmavad toorprodukti ja veinitöödeldud toodet. Peamiste keemiliste komponentide hulka kuuluvad fenüületanoidglükosiidid (PhG-d), iridoidid, lignaanid ja suhkrud, mis toetavad farmakoloogilisi toimeid, nagu neuroprotektsioon, vananemisvastane toime, hepatoprotektsioon ja lahtistav toime; kliinilise rakenduse väljavaated on laiad. Nende hulgas on PhG-d kõige aktiivsemad koostisosad.

Cistanche deserticola valemiga graanulid on ühest ürdist valmistatud graanulid, mis on valmistatud töödeldud C. deserticolast, kasutades kaasaegseid tootmismeetodeid ja mida kasutatakse kliinilistes retseptides. Praegu puudub nende kvaliteedikontrolli riiklik standard. Varasemates uuringutes on kirjeldatud C. tubulosa valemiga graanulite sisalduse määramise meetodeid või sõrmejälgede võtmist, kuid konkreetselt C. deserticola valemiga graanulite iseloomulike kromatogrammide kohta kirjandust ei ole. Selles uuringus koguti kümme partiid, et esmakordselt määrata HPLC iseloomulik profiil C. deserticola valemiga graanulitele, kusjuures viis piiki tuvastati LC-MS abil. See profiil annab tõhusa ja teadusliku aluse C. deserticola valemigraanulite rangeks kvaliteedikontrolliks.

 

Tistanche'i eksperimentaal

 

1.1 Instrumendid ja reaktiivid

 

Agilent 1100 HPLC UV-Vis detektori ja ChemStationiga (Agilent, USA)

Agilent 1290 Infinity HPLC ja Agilent 6530 Q-TOF MS koos ESI allikaga (Agilent, USA)

Sartoriuse elektrooniline kaal (Sartorius Scientific Instruments, Peking, Hiina)

Ultrahelipuhasti Elmasonic P (Elma, Saksamaa)

Cistanche deserticola võrdluskeedutükid ning ehhinakosiidi ja verbaskosiidi (akteosiidi) võrdlusained osteti riiklikust toidu- ja ravimikontrolli instituutist (partiinumbrid . 121101-201603, 111670-201907, 111514-2019). Tsistanosiid A, tubulosiid A ja isoverbaskosiid saadi ettevõttest Shanghai Tauto Biotech (partii nr . 21040621, 20061231, 21040824). Atsetonitriil (HPLC klass) pärines Merckist; teised reaktiivid olid analüütilise puhtusega (Shanghai Lingfeng Chemical Reagents). Kümme partiid C. deserticola valemigraanuleid (PFKL1–PFKL10), kolm partiid C. deserticola keetmise tükke (YP1–YP3) ja kolm partiid C. deserticola standardseid dekokte (BZTJ1–BZTJ3) tarnisid Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.

 

1.2 Lahuste valmistamine

1.2.1 Võrdluslahendused

 

Maitsetaimede võrdluslahus: kaaluge 1 g autentitud C. deserticola keedutükke korgiga koonilisse kolbi, lisage 25 ml 50% metanooli, sonikeerige (250 W, 35 kHz) 30 minutit, jahutage, segage ja tsentrifuugige. Kasutage supernatanti ürdi võrdluslahusena.

Võrdlusaine lahus: valmistada ehhinakosiid 0,2 mg/ml 50% metanoolis.

 

1.2.2 Testlahus

Lihvige proov; kaaluge täpselt umbes 1 g 100 ml merevaigukollasesse mõõtekolbi. Lisage 50 ml 50% metanooli, sulgege korgiga, loksutage, kaaluge, leotage 30 minutit ja töödelge ultraheliga 40 minutit (250 W, 35 kHz). Laske jahtuda, kaaluge uuesti ja lisage kaotatud kaal 50% metanooliga. Segage, seista, filtreerige ja koguge järgmine filtraat analüüsiks.

 

1.3 Instrumentaalsed tingimused

Kromatograafilised tingimused: Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); liikuv faas A: atsetonitriil; liikuv faas B: 0,1% sipelghape vees; gradientelueerimine: 0–5 min, 12% A; 5–15 min, 12%→20% A; 15–30 min, 20%→30% A. Voolukiirus 1,0 ml/min; tuvastuslainepikkus 330 nm; kolonni temperatuur 30 kraadi ; süstimismaht 10 μL. Ehhinakosiidi piigi põhjal arvutatud teoreetilised plaadid peaksid olema 5000 või suuremad.
Märkus: originaaltekstis on kaks korda "15–30 min, 20%→30% A"; seda tõlgendatakse ühe sammuna.

Massispektromeetrilised tingimused: ESI positiivseioonrežiimis; skaneerimisvahemik m/z 50–1200. Allika seaded: nebulisaator (N2) 35 psi; kuivatusgaas (N2) 15 L/min 200 kraadi juures ; mantligaas (N2) 12 L/min 350 kraadi juures ; kapillaar 3,5 kV; fragmentor 125 V; MS/MS kokkupõrkeenergiad (CID) 10, 20 ja 40 eV juures.

Tulemused ja arutelu

 

2.1 Proovi eeltöötlus ja tuvastamise lainepikkus

Võrreldi ekstraheerimislahusteid (metanool, 75% metanooli, 50% metanooli, 25% metanooli), ekstraheerimisrežiime (ultrahelitöötlus, tagasijooksutemperatuur) ja aegu (10, 20, 40, 60 min). Optimaalne eeltöötlus oli 50% metanool 40-minutilise ultraheliga. Kuna C. deserticola PhG-d näitavad maksimaalset UV-neeldumist 330 nm juures, valiti tuvastamiseks 330 nm.

 

2.2 Kromatograafiliste tingimuste valik

2.2.1 Veerud

Zorbax SB-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Kromasil 100-5-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) ja Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) tagasid piisava sobivuse ja süsteemi; Iseloomulike piikide suhtelised retentsiooniajad (RRT) olid ±10% piires määratud väärtustest. Laborid võivad nende hulgast valida.

 

2.2.2 Mobiilne faas

Metanool – 0,1% sipelghape andis enamiku piikide, välja arvatud ehhinakosiidi, halva eraldumise; seetõttu võeti atsetonitriil–0,1% sipelghape kasutusele ja optimeeriti vastavalt jaotises 1.3 toodud gradiendile, tagades optimaalse eraldusvõime, plaatide numbrid ja stabiilse baasjoone. Kuna 30 minuti pärast enam piike ei elueerunud, alustati tasakaalu taastamist algse koostisega.

 

2.3 Täpsus, korratavus ja stabiilsus

Kasutades partii PFKL1, süstiti jaotise 1.2.2 kohaselt valmistatud testlahust kuus korda jaotise 1.3 tingimustel. Üheksa iseloomuliku piigi RSD-d ja suhtelised piikide pindalad olid kõik<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.

2.4 Iseloomuliku kromatogrammi ja tehniliste parameetrite kindlaksmääramine

2.4.1 Karakteristiku võrdluskromatogramm

Kümme C. deserticola valemiga graanulite partiid näitasid järjekindlalt üheksa iseloomulikku piiki, mis vastasid retentsiooniajal üheksale piigile võrdlustaimelahuses (joonised 1–2). Standardite järgi määrati viis piiki ehhinakosiid, tsistanosiid A, tubulosiid A, verbaskosiid (akteosiid) ja isoverbascoside. Ehhinakosiidi piik moodustas suure ja stabiilse osa piigi kogupindalast ning valiti võrdlusaineks. Kümne partii kromatograafiline käitumine oli põhimõtteliselt ühtlane.

A.Tühilahus;B.ehhinakosiid;C.katselahus;D.Cistanchedeserticola;E.Võrdluskarakteristiku kromatogramm.

 

Cistanche Tubulosa tehniliste andmete loend

 

Võtke meiega ühendust ja ostke kohe

 

 

 

 

2.4.2 Piigi tuvastamine

Testlahuseid (punkt 1.2.2) analüüsiti LC-MS abil nii positiivses kui ka negatiivses ESI režiimis; positiivne režiim andis rikkalikumat tippteavet ja seda kasutati (joonis 3). Kokku tuvastati üheksa ühendit; viis kinnitati täpse massi, retentsiooniaja ja MS/MS fragmentidega, kasutades standardeid (tabel 1). Given that PhGs are the main actives in C. deserticola and that the formula granules are prepared by aqueous extraction, LC/Q‑TOF‑MS confirmed PhGs as the main constituents. Accordingly, nine characteristic peaks were catalogued, and five peaks with relatively strong responses were annotated in the reference chromatogram.

Joonis 2 HPLC-referentsikromatogramm 3(S): ehhinakosiid; 4: tsistanosiidA; 5: tubulosiidA; 6: akteosiid; 7: isoakteosiid.

Joonis 3 Katselahuse 3 (S): ehhinakosiid; 4: tsistanosiid A; 5: tubulosiid A; 6: akteosiid; 7: isoakteosiid ekstraheerimisvoolu kromatogramm.

 

2.4.3 Määratud suhtelised retentsiooniajad

Kümne partii põhjal olid keskmised RRT-d (S-piigi ehk ehhinakosiidi suhtes): 0,77 (piik 1), 0,86 (piik 2), 1,00 (piik 3, S), 1,17 (piik 4), 1,27 (piik 5), 1,27 (Peak43), (Pe.46). 7), 1,67 (tipp 8) ja 1,81 (tipp 9). Iga piigi RRT peaks jääma ±10% piiresse selle määratud väärtusest.

Tabel 1. Kromatograafilise tippmassispektromeetria parameetrid, mis on seotudCistanche deserticolaValemi graanulid

Tipp	Nimi	Molekulaarvalem	m/z	Säilitusaeg (min)
1	Tundmatu	C₅₁H₃₆O₁₁	824.2258	6.123
2	Tundmatu	C₃₆H₃₀O₈	590.1941	6.876
3	ehhinakosiid	C₃₅H₄₆O₂₀	809.2467	13.646
4	Tsistanosiid A	C₃₆H₄₈O₂₀	823.2642	16.285
5	Tubulosiid A	C₃₇H₄₈O₂₁	851.2570	17.947
6	Akteosiid	C₂₉H₃₆O₁₅	647.1931	18.464
7	Isoakteosiid	C₂₉H₃₆O₁₅	647.1956	20.083
8	Tundmatu	C₃₁H₃₈O₁₆	689.2044	23.446
9	Tundmatu	C₃₁H₃₈O₁₆	689.2041	25.883

2.5 Sarnasuse hindamine

Kümne partii kromatogrammid imporditi TCM-i kromatograafiliste sõrmejälgede sarnasuse hindamise süsteemi (2012A). Kasutades võrdlusnäidist S1, genereeris mediaanmeetod, 0,5-minutiline ajaaken, mitmepunktiline kalibreerimine ja andmete sobitamine võrdlussõrmejälje (joonis 4) üheksa ühise piigiga. Kõigi kümne partii sarnasusväärtused olid 0,981 (0,981–0,999) või sellega võrdsed, mis viitab suurele partiidevahelisele sarnasusele.

 

2.6 Kvantiteedi ja kvaliteedi ülekandmine keedutükkidest standardsetele keedu- ja segugraanulitele

Piikide sobitamine näitas, et C. deserticola keetmise tükkidel, standardkeetmisel ja valemigraanulitel oli üheksa iseloomulikku piiki, sealhulgas viis määratud piiki (ehhinakosiid, tsistanosiid A, tubulosiid A, verbaskosiid ja isoverbaskosiid) (joonis 5). Iseloomulikud profiilid olid tugevas korrelatsioonis ja keetmistükkide → standardkeetmise → segu graanulite ülekandmise reeglid olid selged. Keetmistükkidest standardkeetmiseni vähenes tipu 6 (verbaskosiid) pindala märkimisväärselt, mis on kooskõlas verbaskosiidi kuumuslabiilsusega.

Joonis 4 Cistanche deserticola Formulagraanulite HPLC iseloomuliku kromatogrammi katmine

2.7 C. deserticola ja C. tubulosa valemigraanulite iseloomulike kromatogrammide võrdlus

Nii C. deserticola kui ka C. tubulosa sisaldavad ehhinakosiidi, tsistanosiidi A, verbaskosiidi, isoverbaskosiidi ja tubulosiidi A. Siiski erinevad need kaks liiki ehhinakosiidide sisalduse poolest märkimisväärselt ja tsistanosiidi A esineb C. tubulosa puhul vaid jälgi. Seetõttu võivad ehhinakosiid ja tsistanosiid A toimida eristavate markeritena botaanilise päritolu eristamisel (C. deserticola vs. C. tubulosa).

Joonis 5 Tsistanhedesertikooli keetmistükkide (A), standardse keetmise (B) ja valemigraanulite (C) iseloomulike kromatogrammide võrdlus 3 (S): ehhinakosiid; 4: tsistanosiid A; 5: tubulosiidA; 6: akteosiid; 7: isoakteosiid.

 

Järeldus (muudetud vastavalt soovile: millistel liikidel on "parem" sisu)

Kehtestatud HPLC–MS iseloomuliku profiili raamesCistanche deserticolavalemgraanulid ja arvestades liikidevahelist võrdlust,C. deserticolasellel on rikkalikum ja tasakaalustatum fenüületanoidglükosiidide profiil: tsistanosiidi A on C. deserticola's kergesti tuvastatav, kuid seda on ainult jälgiC. tubulosa, samal ajalehhinakosiidnäitab märgatavaid liikidevahelisi erinevusi. Seetõttu soovitatakse preparaatide puhul, mille eesmärk on saavutada peamiste PhG-de suurem koondsisaldus ja tugevam üldine tsistaansi kasu, Cistanche deserticola't kui koostiselt paremat liiki. Kui toode on konkreetselt sihitudmaksimaalne ehhinakosiidi, valitud C. tubulosa willkaaluda sõltuvalt tarnetest ja partiide testimisest. Praktikas tuleks "parim müügiks mõeldud tsistanš" määrata ehhinakosiidi, verbaskosiidi (akteosiidi) ja tsistanosiidi A partiipõhise kvantitatiivse testimise teel siin kirjeldatud valideeritud meetodil.

 

 

Viited

[1] Tang SW. Salastatud Materia Medica. Peking: Huaxia Publishing House, 1993:192.
[2] Hiina farmakopöa komisjon. Hiina Rahvavabariigi farmakopöa (. 1 köide). Peking: China Medicine Science and Technology Press, 2020:140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W jt. Hiina traditsioonilised ja ravimtaimed, 2021, 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG jt. Kaasaegne traditsiooniline hiina meditsiin, 2019, 39 (1): 83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Lishizhen Medicine ja Materia Medica, 2006, 17(3):440.
[6] Han GQ, Li CF, Wang XQ jt. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015, 40 (21): 4218.
[7] Lei L, Jiang Y, Liu X jt. Helv Chim Acta, 2010, 90 (1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y jt. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
[9] Gong HM, Hu H, Liu YC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018, 33 (6): 623.
[10] Gao Y, Guo LN, Ma SC jt. China Journal of Chinese Materia Medica, 2019, 44 (17): 3749.
[11] Lu YH, Pi WM, Zhang Y jt. Kaasaegne Hiina meditsiin, 2019, 21 (8): 999.
[12] Wang LW, Cao R, Fang YY jt. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2):295.

Märkmed

Ühendite nimetused: ehhinakosiid; tsistanosiid A; tubulosiid A; verbaskosiid (akteosiid); isoverbaskosiid.

Ilmsed tüpograafilised libisemised, mis viitasid allikas "muskaatpähklile", esitati tõlkes konteksti alusel kui "Cistanche".