ABSTRAKTNE

Türosinaas on oluline ensüüm melaniini moodustumise kontrollimisel melanosoomides ning mängib võtmerolli juuste ja naha pigmentatsioonis. Türosinaasi ebanormaalne ekspressioon või aktiveerimine on seotud mitmete haigustega, nagu albinism, vitiligo, melanoom ja Parkinsoni tõbi. Melaniini liigne ladestumine võib põhjustada selliseid haigusi nagu tedretähnid ja pruunid laigud inimkehas, samuti on see tihedalt seotud puu- ja juurviljade pruunistumise ning putukate sulamisega. Türosinaasi aktiivsuse tuvastamine ja inhibeerimine on nende haiguste diagnoosimise ja ravi edenemisel erakordse väärtusega. Seetõttu on välja töötatud palju selektiivseid optilisi tuvastussonde ja väikemolekulaarseid inhibiitoreid, mis on andnud olulise panuse nende haiguste põhi- ja kliinilistesse uuringutesse. Käesolevas artiklis käsitletakse türosinaasi tuvastamist ja inhibeerimist ning selle kasutamist valgendavates toodetes, pöörates erilist tähelepanu fluorestseeruvate sondide ja inhibiitorite väljatöötamisele. Loodetavasti aitab käesolev ülevaade kavandada tõhusamaid ja tundlikumaid türosinaasi sonde ja inhibiitoreid ning heidab valgust selliste haiguste nagu melanoomi uudsetele ravimeetoditele.

Asjakohaste uuringute kohaseltcistancheon tavaline ravimtaim, mida tuntakse kui "imerohi, mis pikendab eluiga". Selle põhikomponent ontsistanosiid, millel on erinevad mõjud naguantioksüdant,põletikuvastanejaimmuunfunktsiooni edendamine. Mehhanism cistanche janahkavalgendaminepeitub tsistanche glükosiidide antioksüdantses toimes. Inimese nahas sisalduv melaniini toodetakse türosiini oksüdeerumisel, mida katalüüsibtürosinaas, ja oksüdatsioonireaktsioon nõuab hapniku osalemist, nii et hapnikuvabad radikaalid kehas muutuvad oluliseks teguriksmõjutades melaniintootmine. Tistanche sisaldab tsistanosiidi, mis on antioksüdant ja võib vähendada vabade radikaalide teket organismis, seegapärssivmelaniintootmine.

Klõpsake valikul Cistanche Tubulosa Supplement

Lisateabe saamiseks:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Märksõnad:

1. Sissejuhatus

Türosinaasi (EC 1.14.18.1; katehhooloksüdaas; polüfenooloksüdaas [1] ehk difenolaas) peetakse melaniini moodustumisel kõige olulisemaks vaske sisaldavaks ensüümiks. Türosinaas võib molekulaarse hapniku toimel katalüüsida monofenoolühiku hüdroksüülimist ja sellele järgnevat oksüdatsiooni ortokinooniks. Seda leidub melanosoomides, melaniini sünteesi, ladustamise ja transpordi kohas. Kergelt ja tugevalt melaniseeritud melanosoomide pH väärtused on vastavalt umbes 4,5 ja 3. Türosinaasi aktiivsuse optimaalne pH on 6,8 [2]. Raper [3] ja Mason [4] olid esimesed, kes selgitasid melaniini moodustumise biosünteesiradasid erinevates organismides, mida Schallreuter jt hiljuti kaunistasid. [5] ja Cooksey et al. (Joon. 1) [6].

Türosinaasi leidub laialdaselt taimedes, loomades ja mikroorganismides. Arvestades türosinaasi osalust melanoomi patogeneesis, aitab selle aktiivsuse jälgimine ja farmakoloogiline reguleerimine haigust diagnoosida ja ravida [7]. Sondid töötati välja türosinaasi aktiivsuse spetsiifiliseks tuvastamiseks füsioloogilistes keskkondades. Samuti töötati välja inhibiitorid, mis võivad muuta türosinaasi inaktiivseks, ja mõnda neist kasutati kliiniliselt haiguste raviks. Näiteks kojhapet ja arbutiini [8] kui türosinaasi spetsiifilisi inhibiitoreid kasutati kliiniliselt valgendavate toodetena. Seoses edusammudega ravimite avastamisel on viimasel ajal kavandatud ja sünteesitud üha rohkem tõhusaid ühendeid, mis suudavad tuvastada/inhibeerida türosinaasi aktiivsust. See hõlbustaks oluliselt melaniini ebanormaalsest tootmisest tulenevate haiguste diagnoosimise ja ravi edenemist. Selles ülevaates käsitleme endogeense türosinaasi aktiivsuse jaoks väikesemolekuliliste sondide ja inhibiitorite väljatöötamise edusamme. Loodetavasti aitab see meil türosinaasi kohta rohkem teada saada ja leida rohkem funktsionaalseid ühendeid, mis sihivad/reguleerivad türosinaasi.

2. Türosinaasi struktuur

Türosinaasi aktiivne sait kujutab endast kahetuumalist vase keskstruktuuri, mis koosneb kahest vase ioonist (joonis 2), mis seonduvad valgu histidiini jääkidega. Kaks vase ioonikeskust on ühendatud endogeense koordinatsioonisillaga. Türosiin ja teised ained moodustuvad ensüümiga kompleksis ensüümi aktiivse tsentri ja hüdroksüülrühma vahelise sideme kaudu. Melaniini katalüütilise reaktsiooni protsessis jagatakse katalüütiline sait kolme vormi: oksüdatsiooni olek (Eoxy), redutseerimisaste (Emet) ja deoksügeenimise olek (Edeoxy), erinevus seisneb kahetuumalise vase iooni aktiivse keskuse struktuuris. (joonis 2).

Epoksiid koosneb kahest ruudukujulisest vase (II) aatomist; iga aatom koosneb kahest tugevast ekvaatorist ja ligandiks on üks nõrgem aksiaalne NH [9]. Eksogeenne hapnikumolekul seob ja ühendab kaks vasekeskust peroksiidide kujul. CueCu sideme pikkus on umbes 0,35 nm. Hapnikumolekulide kombinatsioon viib (m-h2:h2 -perokso) struktuuri moodustumiseni [10], seega võib eoksüaktiivse tsentri kirjutada kui [Cu(II)eO2eCu(II)]. Peroksiidide elektrooniline struktuur mängib Eoxy bioloogilistes funktsioonides otsustavat rolli. Tänu tugevale s* aktseptori toimele on peroksiidil vähem negatiivne laeng, samal ajal kui p elektroni aktseptor interakteerub elektronidega peroksiidi s* orbitaalil, mis nõrgendab oluliselt hapniku-hapniku sideme tugevust, muutes tuuma. türosinaasi aktiivtsenter kergesti purunev [9]. Metürosinaas (Emet) on sarnane eoksüga ja sisaldab ka kahte tetragonaalset vase (II) aatomit, mis on seotud endogeense silla kaudu. Erinevus seisneb selles, et vaseoonide vaheline sildligand on peroksiidi asemel hüdroksiid [2]. Oksüdatiivsete omaduste poolest on Emet ja Eoxy samuti veidi erinevad. Emet ei ole võimeline oksüdeerima monofenoolseid ühendeid. Substraatide puudumisel eksisteerib Emet organismide põhivormina. Deoksütürosinaasil (Edeoksü), mis on sarnane desoksühemotsüaniiniga, on sümmeetriline struktuur [(Cu(I)eCu(I)]. Kahetuumalise vase vahel ei ole sildavat ligandit, nagu peroksiid või hüdroksiid, seega on vees olev hüdroksiid oluline sillaligand.

3. Türosinaasi toimemehhanism

Kuigi teadlased on türosinaasi ja sellega seotud valkude kohta põhjalikud uuringud läbi viinud, on selle katalüütilise reaktsiooni mehhanism endiselt vastuoluline. Näiteks on katalüütiline aktiivsus türosinaasi samas aktiivses kohas erinev. Türosinaasi katalüütiline kese sisaldab kahetuumalist vasktsentrit, mida nimetatakse vastavalt Cu(A) ja Cu(B). Iga vase ioon aktiivses keskuses on koordineeritud kolme erineva histidiini jäägiga. Mükofenolaadi aktiivsuse ja difenolaasi aktiivsuse vahel on suur erinevus ning redutseeritud türosinaasil on monofenooliga reageerimisel viivitusfaas. Need on olulised teemad, mida tuleb pidevalt uurida ja uurida [11].

Türosinaasi ja sellega seotud substraatide vaheline reaktsioon toimub peamiselt tõhusa koordinatsioonisideme moodustumisega substraadi hüdroksüülrühma ja türosinaasi aktiivse tsentri vahel. Olivares et al. [12] tegi ettepaneku, et eoksü ja sobivad substraadid vallandavad imetajatel mükofenolaadi aktiivsuse ja difenolaasi aktiivsuse. Mükofenolaadi aktiivsuse käigus oksüdeeritakse monofenoolid (L-türosiin), moodustades o-kinoonid (o-dopakinoon), mis on melaniini ja edeoksü oluline eelkäija. Difenolaasi aktiivsuse ajal võivad Eoxy ja Emet oksüdeerida ka o-difenoole (L-DOPA), et toota o-dopakinooni [13]. Teadlased on selle mehhanismi üldiselt heaks kiitnud, kuna see suudab kõige täpsemalt kajastada türosinaasi kineetilisi omadusi, mille puhul melaniini tootmise kiirust piirav etapp on monofenoolitsükkel [14].

3.1. Mükofenolaadi aktiivsuse mehhanism

Melaniini sünteesi ajal on ensüümi põhiülesanne oksüdeerida monofenoolsubstraadid o-kinooniks Eoxy abil. See protsess on oluline tunnus, mis eristab türosinaasi teistest oksidoreduktaasidest, nagu katehhooloksüdaas. Monofenoolitsükli ajal (joonis 2) koordineeritakse deprotoneeritud fenooli hapnikuaatom oksüdeeritud türosinaasi aktiivtsentri vase iooniga, moodustades mükofenolaadi eoksükompleksi (EoxyM) ja seejärel asendatakse fenool ortoelektrofiilselt difenolaasiga Emet. kompleks (EmetD). EmetD läbib lõhustamisprotsessi, et genereerida otse o-kinooni ja Edeoksüt. Edeoksü ühineb otseselt hapniku molekulidega, moodustades uuesti eoksü. See on mükofenolaadi aktiivsuse tsükliline protsess. See protsess ei lõpe enne, kui substraadi reaktsioon on lõppenud. Monofenoolitsükli reaktsiooniprotsessis, kui looduslikus olekus Emet kohtub monofenoolsubstraadiga, läbib see äärmiselt aeglase oksüdatsioonireaktsiooni ja takistab monofenoolireaktsiooni normaalset kulgu. Seetõttu nimetatakse seda perioodi viivitusperioodiks, kuna Emet ise ei suuda hapnikumolekule siduda [12].

3.2. Difenolaasi aktiivsuse mehhanism

4. Türosinaasi funktsioon

Türosinaas kuulub 3. tüüpi vase perekonda ja esineb melaniini moodustumise varases protsessis. See osaleb peamiselt kahes järgmises reaktsiooniprotsessis [17]: (1) L-türosiini hüdroksüülimine L-DOPA-ks; (2) L-DOPA oksüdeerimine dopakinooniks. Dopakinoon moodustab lõpuks melaniini mitmete reaktsioonide kaudu. Teised kaks 3. tüüpi vase perekonna liiget on katehhooloksidaas ja hemotsüaniin. Katehhooloksüdaasil on ainult difenolaasi aktiivsus ja hemotsüaniin on paljude molluskite ja lülijalgsete hapnikukandjate lümfis. Kuigi 3. tüüpi vaseperekonna valkude aktiivsed keskused on säilinud kogustruktuuri ja hapnikumolekulide ühendamise võime osas, on nende potentsiaalsed ensümaatilised aktiivsused pisut erinevad, kuna substraadi seostub ensüümikeskusega või kontrollimatus, et substraat võib ulatuda.

Lisaks melaniini tootmisprotsessis osalemisele täidab türosinaas ka muid olulisi füsioloogilisi funktsioone. Käsnades, taimedes ja mõnedes selgrootutes osaleb türosinaas peamiselt haavade paranemise ja esmase immuunvastuse protsessis [18]. Lülijalgsete puhul võib türosinaas soodustada loomade sarvkihi kõvenemist pärast sulamist. Bakteriaalne türosinaas võib erituda pinnasesse ja osaleda erinevate aromaatsete ühendite juhusliku sidestamise protsessis huumuse moodustamiseks. Ja avastati, et türosinaas võib olla ka potentsiaalne vastumürk benseeni toksiliste ainete korral [13,19]. Lisaks mängib see asendamatut rolli parasiittaimede tapmisel fenoolsete sümbiootiliste bakterite vastu, looduslike pigmentide tootmisel ja aminohapete antibiootikumide, näiteks linkomütsiini sünteesil. Nende mõjude ühine punkt on lahutamatu türosinaasist, kasutades redoksreaktsioone hapniku molekulidega [11].

5. Türosinaasiga seotud haigused

Türosinaasi jaotumine on tihedalt seotud taimede ja loomade füsioloogiliste funktsioonidega. Üldiselt arvatakse, et sulgede, juuste, silmade, putukate epidermise, seemnete ja muude pigmentide värvid on türosinaasi tulemused [10]. Türosinaasil on erinevates organismides erinevad, kuid olulised funktsioonid. Enamikus putukates esineb normaalsetes füsioloogilistes tingimustes türosinaas zymogeeni kujul ja putukate teatud osades eksisteerivad erinevat tüüpi türosinaasid, et täita spetsiifilisi füsioloogilisi funktsioone [20]. Lisaks melaniini tootmises osalemisele on putukate türosinaas ainus keratoosiga seotud ensüüm. Putukate eest karastatud keratiin võib blokeerida mikroorganismide ja võõrkehade sissetungi ning kaitsta pehmet selgrootu keha. Lülijalgsete puhul osaleb türosinaas ka kahes muus olulises füsioloogilises protsessis, nimelt kaitsereaktsioonis ja haavade paranemises. Imetajatel türosinaasi poolt toodetud melaniin eritub epidermise ja karva keratinotsüütidesse, muutes kehapinna värvi, kaitstes seeläbi nahka ja silmi, taludes ultraviolettkiirgust ja takistades sisekudede ülekuumenemist [10]. Imetajatel leiduv türosinaas avastatakse tavaliselt melanotsüütides, mis on väga spetsiifilised rakud, mis eksisteerivad nahas, juuksefolliikulites ja silmades pigmentide tootmiseks [4,21]. Kui türosinaasi funktsioon on vähenenud või puudub, mõjutab see melaniini metabolismi ja põhjustab selliseid haigusi nagu epilepsia ja albinism. Loomade ja inimeste autosomaalsed retsessiivsed haigused on samuti seotud türosinaasi kadumise või aktiivsuse vähenemisega [22].

6. Türosinaasi sondid

Sondid on ained, mis tuvastavad sihtmärgi spetsiifiliselt ja vabastavad tuvastatavaid signaale, mis peegeldavad sihtmärgi olemasolu ja aktiivsust. Traditsiooniline türosinaasi analüüsi kolorimeetriline meetod on selle madala tundlikkuse tõttu piiratud [23]. Alguses teatas Willneri rühm [24e27] mitmest muust elektrokeemial ja kulla nanoosakestel põhinevast tuvastamismeetodist, mis mitte ainult ei suurenda tuvastamise mitmekülgsust, vaid värskendab oluliselt ka kolorimeetriat tundlikkuse osas. Väga tundlike türosinaasi sondide kavandamiseks on kasutusele võetud ka fluorestsentsstrateegia, nagu on näidatud joonisel 3. Türosinaasi aktiivsuse jälgimiseks võib kasutada algselt välja töötatud kvantpunkte ja konjugeeritud polümeeri fluorestseeruvaid sonde [28]. Sellegipoolest on väikese molekuliga fluorestseeruvad sondid eriti atraktiivsed nende eriliste eeliste, nagu tundlikkus, spetsiifilisus ja ühilduvus, tõttu. 2008. aastal sünteesis Zhu meeskond uue vees lahustuva oligo (fenüleenvinüleen) (Pr1) FL-fluorofoorina, mis sisaldas türosiini lõhkepead (WH) kui türosinaasi fluorestseeruvat sondi. Näidati, et Pr1 sobib türosinaasi aktiivsuse tuvastamiseks seni puhvervesilahuses isegi agaroosgeelis [29]. Esiteks kasutasid Ma jt 2010. aastal türosinaasi aktiivsuse jälgimiseks tsüaniinipõhist lähiinfrapuna (NIR) fluorestsentssondi (Pr2). [30]. Märkimisväärset värvimuutust enne ja pärast reaktsiooni oli võimalik tuvastada palja silmaga. Kuid need sondid näitavad ka väljalülitusrežiimi, mille põhjustab türosinaasi katalüüsitud oksüdatsiooni tekitatud kinoon. Funktsionaalseks kasutamiseks on aga parim lähenemisviis biotesti rakendamine sisselülitusrežiimis, kuna see on tundlik ja sobib paremini türosinaasi biopildistamiseks elussüsteemides. 2010. aastal Kim jt. [31] pakkus välja BODIPY-põhise sisselülitatava fluorogeense sondi, et tuvastada endogeense türosinaasi aktiivsus melanoomi elusrakkudes (Pr3, joonis 4). Tuginedes varasematele uuringutele türosinaasi kohta, mida kasutati amiinide kaitserühmade eemaldamiseks [32], Yan et al. [33] valmistasid türosinaasi sondid Pr4 ja Pr5, milles fenoolrühm ja naftüülamiinrühm ühendati uurea sideme kaudu 2012. aastal. Oluline on see, et Pr4 oli esimene kahe footoni sisselülitatav fluorogeenne sond, mis oli loodud türosinaasi aktiivsuse tuvastamiseks. vesipuhvris ja elusrakkudes. 2013. aastal Wang jt. [34] näitas, et fenoolrühmi (WH) sisaldavat NBD-NH2-põhist fluorestsentssondi (Pr6 ja Pr7) saab kasutada türosinaasi aktiivsuse tuvastamiseks ja potentsiaalsete türosinaasi inhibiitorite skriinimiseks sisselülitamisega. strateegia. Siiski ei ole selles töös rakukuvamisega seotud bioloogilist katset. 2016. aastal kavandasid Li ja kolleegid rühma uusi sonde, mis põhinesid 7- amino-4-(trifluorometüül)kumariinil kui FL-fluorofooril, ja sünteesisid need Pr8-11, kusjuures FL-i vaheline kaugus oli erinev. fluorofoor ja fenoolid. Leiti, et Pr9 on väga tundlik ja selektiivne "sisselülitatav" fluorogeenne sond elusate melanoomirakkude kuvamiseks [35]. 2018. aastal kasutas Wu meeskond esimesena FL-fluorestsentssondi (Pr12), et diagnoosida näriliste hiirte mudelitel varakult melanoomi (joonised 4 ja 5A). Sondi saab aktiveerida türosinaasi vahendatud oksüdatsiooniga ja seejärel hüdrolüüsida uurea sidemeid, et tekitada fluorestsentssignaal. Samal ajal suudab see tundlikult ja selektiivselt jälgida endogeense türosinaasi taset elusrakkudes ja sebrakalades (joonis 5 B/C) [36].

2016. aastal töötas Ma rühm [37] välja uudse fluorogeense sondi nimega Mela-TYR (Pr13, joonis 4), et suunata melanosoomid türosinaasi aktiivsuse tuvastamiseks. Pr13 kavandati ftalimiidi lisamisega morfoliini ja 4-aminofenoolist saadud uureaga. Sond näitab oksüdatsiooni-lõhustumisreaktsiooni kaudu väga tundlikku ja selektiivset sisselülitumisreaktsiooni türosinaasile. Eespool kirjeldatud fluorestsentssondid sisaldasid peamiselt 4-hüdroksüfenüülrühma äratundmisosana (WH) ja näitasid paralleelset fluorestsentsreaktsiooni mitmetele reaktiivsetele hapnikuliikidele (ROS) ja türosinaasile, mida ROS seega segas. Ma rühm avastas uue türosinaasi äratundmisosa, 3-hüdroksübensüüloksü (WH), mis näitas türosinaasi ja ROS-i suhtes erinevaid reaktsioonimehhanisme [38]. NIR fluorestsentssond (Pr14, joonis 4) töötati välja 3- hüdroksübensüüloksü paigaldamisega NIR fluorofoori (HXPI) ja see näitas väga spetsiifilist väljalülitatud reaktsiooni türosinaasile, mitte ROS-ile, ületades seega häired. Hüdroksürühma 3- olemasolu hõlbustab hüdroksüülimist türosinaasi poolt 4-positsiooni vabal kohal, kuid mitte ROS-i poolt, ja vaheühend läbib spontaanse 1,6-ümberkorralduse eliminatsiooni, vabastades vaba fluorofoori. Välja töötatud sondi kõrge spetsiifilisus tõestati endogeense türosinaasi aktiivsuse pildistamise ja tuvastamisega elusrakkudes ja sebrakalades ning sondi kõrget spetsiifilisust kontrolliti täiendavalt ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsiga (joonised 4 ja 6). Ma rühm töötas seejärel välja teise sisselülitatava fluorogeense sondi (Pr15, joonis 4), mis põhineb resorufiinil, mis oli ühendatud 3-hüdroksüfenüülrühmaga [39]. Seda kasutati endogeense türosinaasi aktiivsuse tuvastamiseks ja pildistamiseks erinevates elusrakkudes. Ülaltoodud kujundusest inspireerituna pakkusid Zhang ja kaastöötajad [40] välja fluorogeense türosinaasi sondi (Pr16, joonis 4), mille fluorofooriks on resorufiin ja uue türosinaasi tuvastamise tunnusena m-tolüülboorhappe pinakoolester (WH). osa. Sond näitas türosinaasi suhtes suurt selektiivsust teiste bioloogiliste ainete, sealhulgas ROS-i suhtes. Kuid H2O2 segas seda tõsiselt. 2019. aastal Hu jt. [41] teatasid uuest fluorestseiinil põhinevast kõrge keemilise selektiivsusega fluorogeensest sondist (Pr17, joonis 4), mis suudab jälgida türosinaasi in vitro ja in vivo ning realiseerida türosinaasi kõrge kemoselektiivsuse tuvastamise. Lisaks reageeris sond vesilahuses ja fluorestsents suurenes türosinaasi juuresolekul enam kui 24 korda. Lisaks näitas Pr17 suurepäraseid rakumembraani ja koe läbilaskvuse omadusi, mis aitasid kaasa endogeense türosinaasi aktiivsuse jälgimisele erinevates abistatavates elusrakkudes ja sebrakala mudelites. Dingi rühm konstrueeris uudse vees lahustuva NIR fluorestsentssondi (Pr18, joonis 4), mis suudab spetsiifiliselt ära tunda türosinaasi, mis on füsioloogilise temperatuuri ja pH piires väga stabiilne ning suudab täpselt tuvastada türosinaasi bioloogilistes süsteemides, ilma et seda häiriks kõikjal esinevad üksused. Seda saab kasutada türosinaasi kuvamiseks elusrakkudes, sebrakalades ja ksenogeensetes hiiremudelites [42].

Sidhu jt. töötas välja ja sünteesis naftalimiidil põhineva ratiomeetrilise fluorestseeruva sondi (Pr19, joonis 4). Pr19-l on türosinaasi suhtes kõrge selektiivsus ja tundlikkus ning avastamispiir (LOD) on üsna madal [43]. Ergastus- või emissioonispektri nihe toimub pärast sondi kombineerimist reagentidega. Seda saab salvestada kahel erineval lainepikkusel mõõdetud fluorestsentsi intensiivsuse suhtega, mida nimetatakse suhte mõõtmiseks. Sellel põhimõttel põhinevad ratiomeetrilised fluorestseeruvad sondid näitavad oma tundlikkust ja selektiivsust ning neid saab kasutada ensüümi funktsioonide uurimiseks elussüsteemides [44]. Guo meeskond pakkus endogeense türosinaasi aktiivsuse reaalajas tuvastamiseks välja uue ratiomeetrilise ja sisselülitatava NIR-fluorestsentssondi (Pr20, joonis 4). Need Pr20 erilised omadused koos haruldase tsütotoksilisuse, suurepäraste fotofüüsikaliste omaduste ja rakumembraani läbilaskvusega muudavad selle ideaalseks endogeense türosinaasi aktiivsuse kvantitatiivseks tuvastamiseks [45]. Tsüaniini derivaadid kui tüüpilised NIR fluorestseeruvad värvained võivad olla vesilahustes kontrollitavalt agregeeruvad ja seega on neil palju oluliselt erinevaid spektraalseid omadusi. Tsüaniini skeleti keskel olev klooriaatom on kergesti asendatav teiste funktsionaalrühmadega. Selle funktsiooni põhjal Zhang et al. [46] töötasid välja uue tsüaniinipõhise fluorestsentssondi (Pr21, joonis 4) türosinaasi aktiivsuse ratiomeetriliseks fluorestsentsi tuvastamiseks (joonis 7). Suhte määramisel saadi hea signaali-müra suhe ja türosinaasi aktiivsuse LOD väärtus oli 0,02 U/ml. Lisaks kasutati Pr21 edukalt endogeense türosinaasi aktiivsuse kuvamisel B16 rakkudes ja selle kvalitatiivsel eristamisel teistest vähi/normaalsetest rakkudest türosinaasi puudumisel (joonis 7).

7. Türosinaasi inhibiitorid

Inhibiitorid jagatakse üldiselt pöörduvateks ja pöördumatuteks inhibiitoriteks selle alusel, kas ensüümidega interakteeruvad inhibiitorid põhjustavad ensüümi püsivat inaktiveerimist. Türosinaasile iseloomulik inhibeerimine on pöörduv inhibeerimine. Inhibeerimise puhul, mida iseloomustab pöörduv inhibeerimine, on inhibiitori ja ensüümi kombinatsioon pöörduv dünaamiline tasakaaluprotsess [47e49]. Inhibiitori kontsentratsiooni suurendamine põhjustab ensüümi aktiivsuse vähenemist, kuid inhibiitor inhibeerib ainult ensüümi aktiivsust, mitte ei inaktiveerib ensüümi püsivalt. Kui inhibiitori kontsentratsioon väheneb, suureneb türosinaasi aktiivsus. Vahepeal on pöördumatuks inhibeerimiseks türosinaasi püsiv inaktiveerimine. Vastavalt ensüümiga interakteeruvate türosinaasi inhibiitorite erinevatele kohtadele ja meetoditele võib need jagada nelja vormi: konkureeriv, mittekonkureeriv, segatud ja aeglane seondumine.

Flavonoidid on ühendite kogum, mis koosneb kahest benseenitsüklist, mis on ühendatud kolme süsinikuahelaga. Kuna hüdroksüül-, metoksü- ja glükosiid-külgahela rühmad on benseenitsüklites, võib selle paigutuse jagada flavonoolideks, kalkoonideks, dihüdroflavoonideks ja oranžideks (joonis 8) [56]. Flavonoidid on laialdaselt jaotunud taimede lehtedes, seemnetes, kestades ja järglastes ning teadlased on kontrollinud enam kui 4000 flavonoidi. Mõnede taimede puhul on flavonoididel ja nende derivaatidel kaitse UV-kiirte, patogeenide ja taimtoiduliste loomade eest [57]. Lagritsajuure ekstrakti struktuuri analüüs näitab, et neoglütsürritsiini, glütsürritsiini, isoliquiritigeniini ja glütsürritsiini türosinaasi inhibeerimisvõime on seotud nende lipofiilsusega. Nende hulgas on monofenooli pärssimine tõhusam kui difenooli oma, mis näitab, et see on kiirust piirav reaktsioon oksüdatsioonireaktsiooni esimeses etapis [58].

Mõned flavoonid, mis sisaldavad {{0}}hüdroksü-4-ketooni struktuuri, võivad konkureerivalt pärssida ensüümi aktiivsust, kelaadides vase türosinaasi aktiivses kohas, mille tulemuseks on türosinaasi pöördumatu inaktiveerimine. Pärast türosinaasi kelaatimist kaotab molekul teoreetiliselt oma tasapinnalise struktuuri ja moondub. Konkureerivad inhibiitorid on tavaliselt substraadiga paralleelsed, nii et molekul siseneb kergesti türosinaasi aktiivsesse kohta ja takistab L-DOPA sisenemist [59, 60]. Jeong et al. ekstraheeris Zanthoxylum piperitumi lehtedest kaks flavonooli. Flavonoolid võivad pärssida seente türosinaasi aktiivsust, mis on konkureeriv inhibeerimine, kuid nad ei saa pärssida Streptomyces bikiniensis'e melaniini tootmist. Hiljem selgus, et ka Filipiinide Formosast eraldatud flavonoidühend võib inhibeerida türosinaasi ning pärssiv toime on parem kui kojhappel [62]. Liang et al. leidis, et safloori kollane pigment võib inhibeerida ka seente türosinaasi aktiivsust, poole maksimaalsest inhibeerivast kontsentratsioonist (IC50) on 1,01 mg/ml. See inhibeerimise suhe näib olevat annusest sõltuv [63]. Shuiliaost ekstraheeritud (2R, 3R)-(þ)-purpuriin inhibeerib 70 protsenti türosinaasi aktiivsusest ja kontsentratsioon on 0,50 mM. Inhibeerimisvõime on parem kui kojhappel ja arbutiinil [64].

7,8,40 -trihüdroksüflavon on flavonoidi derivaat, mis pärsib türosinaasi difenolaasi aktiivsust mittekonkureerival viisil IC50 väärtusega 10,31 ± 0,41 mM ja Ki 9,50 ± 0,40 mM. Selle ühendi toimemehhanism türosinaasiga on staatiline mehhanism ja näitab ühte sidumissaiti seondumiskonstandiga (7,05 ± 1,20) × 104 M-1 temperatuuril 298 K. Termodünaamilised parameetrid näitavad, et sidumisprotsess on seotud vesiniksidemetele ja van der Waalsi jõududele [51].

3, 8-hüdroksükinoliin (In1, joonis 9 [65]), mis on eraldatud Scolopendra toetustest, võivad mutilans inhibeerida melaniini tootmist ja oksüdatsiooni Melan-a rakkudes. In1 näitab kontsentratsioonist väljatöötatud antioksüdantset toimet ja inhibeerib oluliselt seente türosinaasi aktiivsust mittekonkureeriva inhibeerimise kaudu. Samal ajal leiti, et In1 ei ole uuringus tsütotoksiline, nagu on näidatud tabelis 1 [65]. Nymphaea nuchal lille ekstrakti (NNFE) etüülatsetaadi fraktsioon (100 mg/mL) võib tõhusalt vähendada melaniini tootmist ja pärssida seente türosinaasi aktiivsust. Selle aluseks olev mehhanism hõlmab melaniini sünteesi transkriptsioonifaktorite ja universaalsete signaaliradade sekkumist [66]. Paprikast ekstraheeritud kapsaitsiin (In2, joonis 9 [67]) ja dihüdrokapsaitsiin (In3, ​​joonis 9) võivad inhibeerida türosinaasi aktiivsust. Tulemus näitab, et In2 IC50 väärtus on 1,73 korda väiksem kui In3 oma. Inhibeerimiskonstant (Ki) toetab ka In3 (0,39 mM, tabel 1) inhibeerivat aktiivsust türosinaasi suhtes, mis on madalam kui In2 (0,30 mM, tabel 1) [67]. Leiti, et kameelia õietolmust ekstraheeritud kofeiin (In4, joonis 9 [68]) avaldab tugevat inhibeerivat toimet seente türosinaasi suhtes mittekonkureerivas mudelis, nagu on näidatud tabelis 1. In4 muudab L-türosiini sidumiskohta ja tsüklit. konformatsioon, mis külgneb aktiivse tsentriga, seondudes türosinaasiga. Katsetulemused näitavad, et In4-l on ilmne inhibeeriv toime türosinaasi aktiivsusele rakkudes ja melaniini teke B16F10 melanoomirakkudes on seotud kontsentratsiooniga [68]. Viinamarjadest ekstraheeritud kaftarhape (In5, joonis 9) võib konkureerivalt inhibeerida türosinaasi ja IC50 väärtus (tabel 1) on madalam kui suhteühenditel, kohvi- ja klorogeenhapetel [47]. Floretiin (In6, joonis 9) võib seostuda türosinaasiga staatilise protsessi kaudu, mis põhjustab türosinaasi konformatsiooni muutumist, pärssides seeläbi selle aktiivsust. Samal ajal on In6-l tugev antioksüdantne võime ja võime redutseerida o-dopakinooni LDOPA-ks [48].

Teadlased on hinnanud kahte spiroakridiini (AMTAC-01, In7, joonis 9) ja (AMTAC-02, In8, joonis 9) türosinaasi inhibiitoritena. Tulemused näitavad, et akridiini derivaadid interakteeruvad tugevalt seente türosinaasiga. In8 inhibeerib ensüümi aktiivsust tõhusamalt kui In7, nagu on näidatud tabelis 1, mis näitab, et In8 metoksürühm on tugevas korrelatsioonis inhibeeriva toimega [49]. Sünteesiti ja uuriti mitut 21 halogeenitud tiosemikarbasooni (TSC). Leiti, et TSC-d 6, 12 ja 21 (In9/10/11, joonis 9 [69]) omavad tugevaid inhibeerivaid omadusi vastavalt erineva IC50-ga (tabel 1). Nad näitavad türosinaasi inhibeerimiseks vastastikku pöörduvat ja konkureerivat mehhanismi. Uuritud ühenditest on tiosemikarbasoonide paraasendatud atsetofenooni derivaatidel kõrgeim afiinsus ensüümi suhtes [69]. Penitsilliin V (In12, joonis 9) on bakteriolüütiline b-laktaamantibiootikum. Uuringud on näidanud, et In12 võib pärssida mükofenolaadi ja difenolaasi aktiivsust. Fluorestsentskustutamise ja molekulaarse dokkimise uuringud on näidanud, et In12 võib moodustada staatilise interaktsiooni ensüümi katalüütilise tasku lähedal, takistades seeläbi substraadi transporti aktiivsesse kohta ja vähendades vase plastilisust katalüüsi jaoks [70]. Hiljuti Raza et al. uuris N-(asendatud-fenüül)-4-{(4-[(E)-3- fenüül-2-propenüül]-1-piperasinüül)butaanamiidide ( 5a-e) türosinaasil. Kõik ühendid leiti olevat bioloogiliselt aktiivsed, kusjuures 5b (In13, joonis 9) näitas suurimat inhibeerivat potentsiaali [71]. Mahajan jt. kavandatud ja sünteesitud kinasolinoonbenamiidid 4a-h (In14e21, joon. 9). Uurides ühendite inhibeerivat toimet türosinaasi aktiivsusele, leiti, et kõikide ühendite IC50 väärtused on madalamad kui standardsel kojhappel, nagu on näidatud tabelis 1 [72]. Shen et al. leidis uue türosinaasi inhibiitori, peptiidi ECGYF (EF-5, In22), nagu on näidatud joonisel 9. Seondumine In22 ja türosinaasi vahel sõltub peamiselt vesiniksidemetest ja hüdrofoobsetest interaktsioonidest ning türosinaasi inhibeerimise mõju on tugevam kui arbutiini ja glutatiooni oma [73]. Ta et al. eraldas kolm tamaristsinooli 1/2/3 (In23/24/25) ja kaks fenooli 4 ja 5 (In26 ja 27), nagu on näidatud joonisel 9. Katsed on näidanud, et kõigil isolaatidel on seente türosinaasi inhibeeriv toime, kusjuures In23 on kõige tõhusam (tabel 1) [74].

Lisateabe saamiseks: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501