Dieckoli nõrgendav toime hüpertensiivsele nefropaatiale spontaanselt hüpertensiivsetel rottidel

Ang II kutsub esile vasokonstriktsiooni ja sellest tulenevalt hüpertensiooni [30]. Hüpertensiooni korral aktiveerub RAAS süsteemselt ja RAAS-i ülesreguleerimisega kaasneb mitmes elundis, näiteksneerud[31,32]. Intrarenaalse RAAS-i hüperaktiveerimine on hüpertensiooni ja kroonilise hüpertensiooni oluline mehhanismneeruhaigus[31,32]. Nii TGF 1 kui ka Ang II indutseerivad intrarenaalse RAAS-i aktivatsiooni ja suurendavad angiotensinogeeni, reniini, ACE ja AT1R ekspressiooni, mis indutseerivad EMT-d [33]. Meie uuringus vähenes SHR-i süstoolne BP oluliselt kas ECE või DK manustamisega. SHR-i Ang II tase seerumis langes oluliselt kas ECE või DK manustamisega. AT1R ekspressioon SHR-i ajukoores ja medullas vähenes oluliselt ECE või DK manustamise tõttu.

RAAS-i ülesreguleerimine, näiteks AT1R suurenenud ekspressioon, aktiveerib TGF 1 signaaliülekanderaja [34]. RAAS-i poolt aktiveeritud TGF 1 indutseerib EMT-d SMAD-st sõltuvate ja SMAD-sõltumatute radade kaudu [33]. SMAD-sõltuva signaaliülekanderajana edastatakse TGF 1 signaalimine TGF RII ja TGF RI kaudu ning see viib SMAD2/3 aktiveerimiseni. [10]. SMAD4 seondub SMAD2/3-ga ja soodustab SMAD-kompleksi translokatsiooni tuuma [10]. Translokeeritud SMAD-id reguleerivad üles EMT geenide, nagu Snail, Twist ja ZEB, ekspressiooni [34]. Meie uuringus oli AT1R ekspressioon SHR-i ajukoores ja medullas oluliselt kõrgem kui WKY rottidel ning seda vähendas kas ECE või DK manustamine. TGF ja SMAD2/3 ekspressioon SHR-i ajukoores ja medullas vähenes kas ECE või DK manustamisega.

CISTANCHE PARANDAB NEeru-/NEERUNEKTSIOONI

EMT-d iseloomustab epiteeli markeri, nagu E-kadheriin, kadumine ja mesenhümaalsete markerite, nagu -SMA, vimentiin ja fibronektiin, saavutamine [35]. E-kadheriin on epiteelirakkudes kõige enam ekspresseeritud kadheriin ja seetõttu kasutatakse seda sageli epiteeli markerina [36]. -SMA on müofibroblastirakkude fenotüübiline marker ja selle ekspressioon on EMT kaugelearenenud staadiumide tunnus [37]. -SMA-d ekspresseerivad müofibroblastid, mis läbivad EMT, indutseerivad liigse ECM-i sünteesi ja ebanormaalset ECM-i remodelleerumist janeeru-fibroos [37]. Hüpertensiivne nefropaatia kutsub esile glomeruloskleroosi ja interstitsiaalse fibroosi, mis kutsub esileneerufunktsioonja märkimisväärne proteinuuria [6]. Meie uuringus suurenes vimentiini ja -SMA ekspressioon SHR-i medullas ja ajukoores ning vähenes kas ECE või DK manustamisega. SHR-ide medulla ja ajukoore fibroosi piirkonna kogus suurenes ning seda vähendas kas ECE või DK manustamine. SHR-i glomerulaarskleroosi indeks suurenes ja seda vähendas kas ECE või DK manustamine.

SHR-ide uriini maht vähenes järk-järgult võrreldes sama vanade WKY rottide omaga [38]. On teada, et mida suurem on naatriumi eritumine uriiniga, seda väiksem on kaaliumi eritumine uriiniga. Lisaks on inimestel tehtud uuringutes seostatud uriini Na/K suhet vererõhu tõusu ja veresuhkru kiire halvenemisega.neerufunktsioon[39]. Meie uuringus oli SHR-ide uriini maht väiksem kui WKY-rottidel, kuigi veetarbimise kogus ei erinenud SHR-i ja WKY-rottide vahel. SHR-ide Na/K suhe uriinis oli WKY rottide, SHR-ide ja ECE- või DK-ga ravitud rühmade vahel oluliselt erinev. Uriini Na/K suhet kasutati inimuuringutes toidust saadava naatriumi ja kaaliumi tarbimise markerina [39]. Vererõhk tõusis naatriumi tarbimise suurenemisega. Suurenenud kaaliumi tarbimine vähendas aga vererõhku, suurendades naatriumi eritumist uriiniga [40]. Seetõttu seostatakse uriini Na/K suhet inimestel BP-ga [40]. Meie uuringus ei söödetud kõiki loomi kõrge naatriumisisaldusega dieediga, mis selgitab, miks uriini Na / K suhe rühmade vahel ei näidanud olulist erinevust. Hüpertensioon kipub suurendama proteinuuriat [37]. On teada, et uriini albumiini ja kreatiniini suhe on seotud glomerulaarfiltratsiooni kiiruse vähenemisega [41]. Varasemad uuringud on näidanud, et mikroalbuminuuria tekkimist SHR-ides põhjustab valdav tubulaarne vigastus, mis kutsub esile madala molekulmassiga valkude kaotuse uriiniga [42,43]. Meie uuringus oli SHR-de uriini albumiini ja kreatiniini suhe kõrgem kui WKY rottidel ja seda vähendas kas ECE või DK manustamine.

Varasemad uuringud näitasid, et mitmetel polüfenoolidel on AKE aktiivsust pärssiv toime [14–17]. Nendes uuringutes kirjeldati aga ainult AKE inhibeerivat aktiivsust IC50 väärtusena, mis on positiivse kontrolli 50-protsendiline inhibeerimiskontsentratsioon, ning nad ei näidanud loomadel antihüpertensiivset toimet ega kaitsvat toimet hüpertensiivse nefropaatia vastu. Üks uuring näitas, et ECE vähendas BP-d 2-neerud1-klipp Goldblatti hüpertensiivsed rotid [44]. Pürogallool-floroglütsinool-6,6-bieckol vähendas veresuhkru taset kõrge rasvasisaldusega dieedist põhjustatud hüpertensiooni loommudelis, moduleerides veresoonte düsfunktsiooni [45]. Need uuringud näitasid aga ainult vererõhu langust ja ei hinnanud, kas ECE näitas mingit mõju hüpertensiivse nefropaatia nõrgendamisel. Meie uuring näitas, et ECE ja DK vähendasid AT1R/TGF/SMAD2/3 ekspressioonineerudja alandas Ang II taset seerumis. Lisaks vähendasid ECE ja DK EMT,neeru-fibroos ja glomerulaarskleroos. Näib, et ECE ja DK võivad olla abiks hüpertensiivse nefropaatia leevendamisel

4. Materjalid ja meetodid

4.1. ECE ettevalmistamine ja DK isoleerimine

ECE saadi ettevõttelt Aqua Green Technology Co., Ltd. (Jeju, Korea). E. cava pesti põhjalikult puhta veega ja kuivatati õhu käes toatemperatuuril 48 tundi. See jahvatati ja lisati 50% etanooli, millele järgnes kuumutamine 85 °C juures 12 tundi. ECE filtriti ja seejärel kontsentreeriti steriliseerides kuumutades kõrgel temperatuuril 40–60 minutit ja seejärel pihustuskuivatati. Seejärel isoleeriti direktor, mis on üks E. cava tüüpilistest florotaniinidest. Lühidalt, tsentrifugaaljaotuskromatograafia viidi läbi, kasutades kahefaasilist lahustisüsteemi, mis segas puhast vett, etüülatsetaati, n-heksaani ja metanooli segu (suhe 7:7:2:3). Orgaaniline statsionaarne faas täideti kolonnis ja liikuv faas täideti kolonnis, järgides kiiruse kahanevas järjekorras (2 ml minutis) ja seda kasutati eraldamiseks. Järgisime dr Soni jt meetodeid. (2019) [45].

CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust

4.2. Hüpertensiooni loomamudel

Isased SHR-rotid (8 nädala vanused) ja isased WKY rotid (8 nädala vanused) osteti Orient Bio'st (Sungnam, Korea) ja neid hoiti konstantsel temperatuuril umbes 24 ◦C, suhtelisel õhuniiskusel 50–55 protsenti ja valguse/ tume tsükkel 12 h/12 ​​h. Roti sublimatsioon viidi läbi 1 nädal. Rotid jagati juhuslikult kuueks rühmaks (viis rotti rühma kohta): (i) WKY rühm, kus rottidele manustati 4 nädala jooksul suukaudselt joogivett; (ii) SHR rühm, kus rottidele manustati suu kaudu joogivett 4 nädala jooksul; (iii–v) SHR-rühm, kus rottidele manustati suukaudselt ECE-d (iii) 50 mg/kg/päevas, (iv) 100 mg/kg/päevas ja (v) 150 mg/kg/päevas 4 nädalad; (vi) SHR rühm, kus rottidele manustati suukaudselt DK 2,5 mg/kg/päevas 4 nädala jooksul. 4 nädala pärast valideeriti veetarbimine, uriini maht ja uriini keemiline analüüs metaboolse puuriga 24 tunni jooksul. Pärast metaboolse analüüsi lõpetamist surmati kõik rotid vastavalt Gachoni ülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee eetilistele põhimõtetele (kinnitusnumber: LCDI-2019-0121).

4.3. Immunohistokeemia

Neerukudeparafiiniplokid lõigati 8 µm, asetati želatiinkattega objektiklaasidele ja kuivatati 37 °C juures 3 päeva. Theneerudkoeslaidid deparafineeriti ja inkubeeriti seejärel 0,3% vesinikperoksiidiga (Sigma-Aldrich, MO, USA) 10 minutit. Seejärel loputati slaide kolm korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja inkubeeriti loomse seerumiga, et inhibeerida antikeha mittespetsiifilist seondumist. Lisaks inkubeeriti neid primaarsete antikehadega (anti-AT1R, anti-E-kadheriin, anti-- -SMA ja anti-vimentin) ja loputati kolm korda PBS-iga. Seejärel inkubeeriti koeslaidid biotinüülitud sekundaarsete antikehadega ABC komplektist (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), inkubeeriti 3 tundi blokeeriva lahusega ja loputati kolm korda PBS-ga. Slaidid töötati välja substraadina 3,3-diaminobensidiiniga 3 minuti jooksul, paigaldati ksüleenipõhise DPX lahusega (Sigma-Aldrich) ja visualiseeriti valgusmikroskoopia abil (Olympus Optical Co., Tokyo, Jaapan). .

4.4. RNA ekstraheerimine ja kvantitatiivne reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon (qRT-PCR)

RNA rotiltneerudkuded eraldati, kasutades RNAiso Plus reagenti (TAKARA, Jaapan) vastavalt tootja juhistele. Theneerudkuded jagati kõigepealt kaheks osaks, nimelt ajukoore osaks ja medulla osaks. Neerukuded lõigati peeneks ja purustati pulbriks ning pulbrid resuspendeeriti 1 ml RNAiso Plus reagendiga, segati 0,1 ml puhta lagendiku kloroformiga (Amresco, Solon, OH, USA) ja seejärel tsentrifuugiti 13,000 × g juures 20 min temperatuuril 4 ◦C. Pärast tsentrifuugimist segati supernatant 0,25 ml puhta lagendiku isopropüülalkoholiga ja ekstraheeritud RNA pelleteid pesti 70% alkoholiga ja tsentrifuugiti 7500 × g juures 5 minutit temperatuuril 4 °C. Kuivatatud pelletid lahustati 10–30 µl dietüülpürokarbonaadiga töödeldud puhtas vees ning RNA kvantifitseeriti ja kontrolliti NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) abil. Komplementaarne DNA (cDNA) valmistati RNA-st, kasutades cDNA sünteesikomplekti (PrimeScript™, TAKARA). Kvantitatiivne reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon (qRT-PCR) määras RNA tasemedneerudkoed. Päri- ja tagurpidi praimerid segati destilleeritud veega ja seejärel asetati 10 µl segud 384-süvendiga qRT-PCR plaadile. Seejärel lisati cDNA ja SYBR roheline (TAKARA) ja seejärel valideeriti qRT-PCR masinaga (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Huvipakkuvad geenid on loetletud täiendavas tabelis S1. Järgisime dr Soni jt meetodeid. 2019 [45].

4.5. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA)

Seerumi Ang II taseme kinnitamiseks lisati seerumieraldustorudesse (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) võetud vere alikvoot (1,5–1,7 ml) ja seejärel tsentrifuugiti 2000 × g juures 20 minutit toatemperatuuril. . Seejärel viidi eraldatud seerum uude tuubi ja hoiti sügavkülmas. Ang II ELISA komplekti (MyBioSource, San Diego, CA, USA) kasutati seerumi olemasolu analüüsimiseks vastavalt tootja juhistele. Ang II mõõdeti 1 nädala jooksul pärast loomadelt vere võtmist.

4.6. Histoloogiline analüüs

4.6.1. Massoni trikroomne (MT) plekk

Massoni trikroom (MT) plekk kinnitab fibroosineerud.Parafiiniga manustatud plokidneerudkude lõigati paksuseni 8 µm, asetati katteklaasile ja kuivatati 37 °C juures 3 päeva. Slaidid deparafineeriti ksüleeni ja alkoholiga ning fikseeriti uuesti Bouini lahusega 24 tundi ja loputati jooksva kraaniveega 3 minutit. Slaidid sukeldati 10 minutiks Weigerti raua hematoksüliini lahusesse ja 15 minutiks Biebrichi sarlakhappe fuksia lahusesse ning seejärel diferentseeriti 10 minutiks fosfomolübdeen-fosfovolframhappe lahusega. Lõpuks viidi slaidid 3 minutiks aniliinsinise lahusesse ja pesti seejärel veega. Värvitud slaidid paigaldati ksüleenipõhise DPX lahusega (Sigma-Aldrich) ja visualiseeriti valgusmikroskoopia abil (Olympus). Kollageenikiud näivad olevat fibroosi piirkonnas sinist värvi, samas kuineeru-epiteel näib olevat punast värvi. MT-ga värvitud fibroosipiirkondi mõõdeti ImageJ tarkvara abil. MT-värvitud neeru originaalkujutised teisendati RGB-piltideks ja seejärel dekonvoleeriti need pildid ImageJ tarkvara abil, kasutades värvidekonvolutsiooni pistikprogrammi.

4.6.2. Perioodiline happe-Schiffi (PAS) plekk

Perioodiline happe-Schiffi (PAS) värv kinnitas glomerulaarkahjustuseneerud. Parafiiniga manustatud plokidneerudkude lõigati paksuseni 8 µm, asetati katteklaasile ja kuivatati 37 °C juures 3 päeva. Slaidid deparafineeriti ksüleeni ja alkoholiga, hüdreeriti veega, oksüdeeriti 0,5-protsendilise perioodilise happe lahusega 5 minutit ja pesti veega. Objektiklaasid sukeldati 15 minutiks Schiffi reaktiiviga ja seejärel pesti 5 minutit leige kraaniveega. Lõpuks viidi slaidid 1 minutiks Mayeri hematoksüliini lahusesse ja pesti seejärel veega. Värvitud slaidid paigaldati ksüleenipõhise DPX lahusega (Sigma-Aldrich) ja visualiseeriti valgusmikroskoopia abil (Olympus).

Glomerulid valiti juhuslikult ja glomerulaarset kahjustust hinnati poolkvantitatiivse punktimeetodi abil (klassid 0–4), kasutades PAS-värvimist.neerudkudede slaidid.

(1) Aste 0: normaalsed glomerulid; (2) 1. aste: minimaalne skleroos (sklerootiline piirkond kuni 25 protsenti); (3) 2. aste: mõõdukas skleroos (sklerootiline piirkond 25 protsenti kuni 5 0 protsenti); (4) 3. aste: mõõdukas-raske skleroos (sklerootiline piirkond 50–75 protsenti); (5) 4. aste: raske skleroos (sklerootiline piirkond 75–100 protsenti); Glomerulosklerootiline indeks (GSI) arvutati järgmise võrrandi abil: (4 × n4) pluss (3 × n3) pluss (2 × n2) pluss (1 × n1) / n4 pluss n3 pluss n2 pluss n1 pluss n0, kus n ( x) on arvneeru-glomerulaarskleroos igas astmes [46]. Selle analüüsi viis ravirühmades läbi maskeeritud vaatleja.

4.7. Süstoolse vererõhu, diastoolse vererõhu ja keskmise arteriaalse vererõhu mõõtmised

Süstoolset, diastoolset ja keskmist arteriaalset BP-d mõõdeti mitteinvasiivse CODA sabamanseti süsteemiga (Kent Scientific Corp., Torrington, CT, USA). Roti sublimatsioon viidi läbi 20 minutit 5 päeva jooksul ja BP mõõdeti viimasel päeval.

4.8. In vitro modelleerimine TCMK-1 rakkude abil

TCMK-1 rakud, hiire proksimaalne tuubulite rakuliin, osteti ettevõttest American Type Culture Collection (Washington, DC, USA). Kultuurisöötmena kasutati kõrge glükoosisisaldusega Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söödet (Gibco; Grand Island, NY, USA), 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS) ja 1 protsenti penitsilliini-streptomütsiini. ECE ja DK inhibeeriva toime kinnitamiseks angiotensiin II-ga töödeldud TCMK-1 rakkudes ravisime ECE-d (5, 25, 50 µg/mL) ja DK-d (1,8 µg/ml) 100 nmol/l angiotensiin II-ga. (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 12 tundi. Telmisartaani (1 µmol/L, Sigma-Aldrich) kasutati AT1 retseptori antagonistina ja seda eeltöödeldakse enne angiotensiin II 3 tundi [47].

CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU

4.9. Valgu ettevalmistamine ja Western blot analüüsimine

Valgu eraldamiseks angiotensiin II-ga töödeldud TCMK-1 rakkudest kaabiti rakud RIPA lüüsipuhvriga koos fosfataasi ja proteinaasi inhibiitoriga (EzRIPA; ATTO; Tokyo, Jaapan) ning inkubeeriti jääl 20 min. Pärast tsentrifuugimist kiirusel 13,000 × g 20 minutit temperatuuril 4 ◦C viidi puhtad supernatandid uude katsutisse ja supernatantide kontsentratsiooni analüüsiti bitsinhoniinhappe analüüsikomplektiga (BCA komplekt; Thermo Fisher Scientifific, Inc.; Waltham, MA, USA). Valgu ekspressiooni kinnitamiseks TCMK-1 rakkudest viidi läbi blotanalüüs. Võrdne kogus lüsaatvalke (30 ug/raja kohta) eraldati 10% naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geeliga, kasutades elektroforeesi. Seejärel kanti jooksvad valgud polüvinülideenfluoriidmembraanidele, mida inkubeeriti lahjendatud primaarsete antikehadega (Anti- -aktiin, AGTR1, TGF-, SMAD2/3 ja pSMAD2/3) temperatuuril 4 ◦C. Antikehadega inkubeeritud membraane pesti põhjalikult Tris-puhverdatud soolalahusega, mis sisaldas 0,1 protsenti Tween 20, ja inkubeeriti sekundaarsete antikehadega 2 tundi toatemperatuuril. Kõik membraanid töötati välja täiustatud kemoluminestsentsi abil (LAS{24}}s; GE Healthcare, Chicago, IL, USA). Selles uuringus kasutatud antikehade teave on esitatud tabelis S2.

4.10. Statistiline analüüs

Tulemused on esitatud kui keskmine ± SD ja p-väärtused<0.05 mean="" it="" is="" statistically="" significant.="" the="" kruskal–wallis="" test="" was="" used="" to="" validate="" the="" differences="" among="" the="" groups,="" and="" the="" mann–whitney="" u="" test="" was="" used="" in="" the="" spss="" ver.="" 22="" software="" (ibm="" corporation;="" ny,="" armonk,="" usa)="" completed="" post="" hoc="" comparisons.="" means="" denoted="" by="" a="" different="" letter="" indicate="" significant="" differences="" between="">

5. Kokkuvõtted

Kokkuvõtteks võib öelda, et AT1R oli SHR-ides ülesreguleeritud ja signaali rada suurendas TGF-i ja SMAD2 või 3, mis indutseeris EMT. Kas ECE või DK reguleerisid signaali rada alla ja vähendasid EMT-d. Seetõttu vähendas ECE või DK mesenhümaalsete rakkude markereid, nagu vimentiini ja -SMA, fibrootilise koe ekspressioon.neerud, ja uriini albumiini/kreatiniini suhet ning nõrgendasid EMT-d. Lisaksneeru-fibroos viis taastumisenineerufunktsioon(Joonis 7).