Arüülsüsivesinike retseptorist sõltuvad ja sõltumatud rajad vahendavad kurkumiini vananemisvastast toimet

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Arüülsüsivesinike retseptor (AhR) on ligandiga aktiveeritud transkriptsioonifaktor, mille aktiivsust saab moduleerida polüfenoolidega, nagu kurkumiin. AhR-il ja kurkumiinil on evolutsiooniliselt konserveerunud mõju vananemisele. Siin uurisime, kas ja kuidas AhR vahendab kurkumiini vananemisvastast toimet liikide lõikes. Kasutades in vivo, in vitro ja in silico analüüside kombinatsiooni, näitasime, et kurkumiinil on kontekstispetsiifilisel viisil AhR-sõltuv või sõltumatu toime. Leidsime, et Caenorhabditis elegansis vahendab AhR kurkumiinist põhjustatud eluea pikenemist, tõenäoliselt ligandist sõltumatu inhibeerimismehhanismi kaudu, mis on seotud selle antioksüdantse aktiivsusega. Kurkumiin näitas ka AhR-st sõltumatut vananemisvastast toimet, nagu kaitse agregatsioonile kalduvate valkude ja oksüdatiivse stressi eest C.elegans'is ning inimese primaarsete endoteelirakkude migratsioonivõime edendamine. Neid AhR-sõltumatuid efekte vahendab suuresti Nrf2/SKN-1 rada.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Märksõnad:arüül süsivesinike retseptor; kurkumiin; oksüdatiivne stress; Caenorhabditis elegans; hiired; endoteelirakud; in vivo; in vitro; in silico

1. Sissejuhatus

Arüülsüsivesinike retseptor (AhR) on üldlevinud ligandiga aktiveeritud transkriptsioonifaktor, mis on identifitseeritud imetajate toksikoloogilise vastuse määrajaks 23,7,8-tetraklorodibenso-p-dioksiinile (TCDD) [1]. AhR signaaliülekandeteid on imetajate rakkudes hästi kirjeldatud. Lühidalt öeldes paikneb ligandita AhR tsütoplasmas ja seda stabiliseerivad erinevad kaasfaktorid, nagu 90- kDa kuumašoki valk (Hsp90), AHR-iga interakteeruv valk (AIP) ja chaperone p23. Seondumine eksogeensete (nt TCDD) või endogeensete (nt kinureniini) ligandidega soodustab selle kompleksi translokatsiooni tuuma, kus AhR dissotsieerub oma kaasfaktoritest ja koguneb heterodimeeriks koos AHR tuumatranslokaatoriga (ARNT). Saadud AHR/ARNT kompleks seondub reageerivate I ja II faasi detoksifitseerimisgeenide aku ksenobiootiliselt reageerivate elementidega (XRE), mis viib lõpuks ligandide lagunemiseni [2]. Lisaks rollile ksenobiootilises vastuses toimib AhR mitmesugustes patofüsioloogilistes protsessides, alates immuunsusest [3,4], põletikust [5,6], lipiidide ja glükoosi metabolismist [7,8] kuni südame-veresoonkonna, maksa ja Viimastel aastakümnetel on avastatud muude organite haigusi [9-12]. Kasvavad tõendid viitavad ka AhR-i erinevatele ja näiliselt vastuolulistele rollidele vananemisprotsessis, mida saab siiski ühitada, võttes arvesse koe-, annuse- ja liigispetsiifilisi mõjusid [13].cistanche tšingis-khaanAhR negatiivset rolli vananemises ja vanusega seotud tunnustes on kirjeldatud liikide lõikes [14,15]. Võrreldes metsiktüüpi Caenorhabditis elegansiga on AhR mutanttüvel ahr-1(ju145) pikem elu- ja terviseiga; hiirtel parandab AhR defitsiit veresoonte funktsiooni ja suurendab lämmastikoksiidi süntaasi aktiivsust ja seega ka NO biosaadavust; ja lõpuks leiti positiivne korrelatsioon AhR ekspressiooni ja veresoonte jäikuse vahel keskealistel ja eakatel inimestel [14]. Lisaks oli Hiina populatsiooni epidemioloogilises uuringus AhR ekspressioon seotud koronaararterite haiguse esinemissagedusega [16].

Cistanche on vananemisvastane toime

Pange tähele, et paljud vananemist või vanusega seotud haigusi mõjutavad ühendid [17-19] võivad moduleerida AhR aktiivsust [20-22]. Kui AhR-i aktiveerimine ksenobiootikumide poolt põhjustab imetajatel erinevaid vähkkasvajaid [23,24], siis toitumis- ja keskkonnateguritel on C.elegansi tervisele vastupidine AhR-sõltuv mõju [25]. Toidu AhR-i modulaatorite hulgas on polüfenoole nagu kurkumiin suuresti uuritud nende tervisemõjude osas. Kurkumiin on Curcuma longa kollane pigment, millel on arvukalt evolutsiooniliselt säilinud kasulikke omadusi, sealhulgas antioksüdantne, põletikuvastane ja vananemisvastane toime [26]. Kurkumiin takistab valkude agregatsiooni ja pikendab C.elegansi ja Drosophila eluiga valgu homöostaasi moduleerimise kaudu [27-29].cistanche eluea pikendamineVeelgi enam, kui seda manustati Alzheimeri tõve transgeense hiire mudelile, vähendas see oluliselt amüloid-beeta(A) kogukoormust [30]. Vanadel hiirtel taastas kurkumiin NO biosaadavuse, vähendades seega oksüdatiivset stressi ja parandades endoteeli düsfunktsiooni ja arterite jäikust, mida hinnati aordi pulsilaine kiiruse (PWV) järgi – üks olulisemaid kliinilisi mõõtmisi või suurte elastsete arterite jäikuse markereid [31]. Mitmed uuringud inimestel näitasid ka kurkumiini kaitsvat toimet südame-veresoonkonna tervisele [32]. Kurkumiini toimemehhanism on aga endiselt suures osas ebaselge ja, mis veelgi olulisem, ei ole uuritud, kas selle kasulikke tervisemõjusid vahendab AhR [33.34]

Mudelorganismid, nagu nematoodi C.elegans, on aidanud tuvastada vananemist põhjustavad geneetilised ja keskkonnategurid. Selle põhjuseks on selle paljud kasulikud omadused, sealhulgas lihtne laboratoorsed käsitsemised, lühike eluiga ja suure hulga järglaste saamine iseviljastumise teel. C.elegansi genoom on täielikult sekveneeritud ning enamik selle geene ja radu on evolutsiooniliselt konserveerunud. AhR-i valgujärjestus on evolutsiooni käigus konserveerunud ja C.elegans'is kodeerivad AhR-i ja ARNT-i ortolooge AhR-iga seotud (ahr-1) ja ahr-1-seotud (aha{{4). }})geenid vastavalt [35]. Vastavad valgud AHR-1 ja AHA-1 jagavad umbes 40 protsenti oma järjestusest identsusest imetajate omadega ja moodustavad heterodimeeri (ka imetajate vastetega), mis suudab siduda sihtmärgi XRE-sid. geenid in vitro [36].cistanche nzAHR{0}} ekspresseerub enamasti neuronaalsetes rakutüüpides, nagu GABAergilised neuronid [37l, ja sellel on võtmeroll neuronite arengu kontrollimisel [38]. Erinevalt selgroogsete AhR-ist ei seo AHR-1 TCDD-d ega muid sarnaseid ksenobiootikume [35,39], kuid sellel on imetajate AhR-iga ühised tunnused neuronaalsete protsesside, arengu ja viljakuse reguleerimisel [37,38,{ {8}}], mis viitab lõpuks sellele, et esivanemate AhR ei olnud otseselt seotud toksiliste ligandide lagunemise geenide kontrollimisega [44,45]. Seega tunnistasime C.elegansi ainulaadseks ja võimsaks mudelsüsteemiks AhR-i esivanemate funktsioonide tuvastamiseks ja uurimiseks, mis ei pruugi olla seotud selle ksenobiootikumide vastusega.

Selles uuringus uurisime AhR rolli kurkumiini vananemisvastases toimes liikide lõikes. In vivo, in vitro ja in silico analüüside kombinatsiooni abil leidsime, et kurkumiinil on erinevad kasulikud vananemisvastased toimed lahtiühendatud ahr-1-sõltuvate ja sõltumatute mehhanismide kaudu. Leidsime, et C.elegans ahr{4}}vaesestatud loomad on pikaealised, kuid oksüdatiivse stressi suhtes tundlikumad. Kuigi kurkumiin ei pikendanud C.elegans ahr-1 mutantide eluiga veelgi, suurendas see nende vastupanuvõimet oksüdatiivsele stressile. Kurkumiin soodustas ka inimese primaarsete endoteelirakkude (EC) antioksüdantset vastust ja migratsioonivõimet, sõltumata AhR-st, mis põhines liikide lõikes peamiselt Nrf2/SKN-l{8}}. SKN-1 on inimese Nrt2 (tuumafaktori erütroidi 2-seotud faktor 2) redoks-transkriptsioonifaktori C.elegansi ortoloog, millel on evolutsiooniliselt konserveerunud roll raku ja organismi homöostaasis ning vastuses oksüdatiivsele stressile [ 46,47] Rakulise reporteranalüüsi ja AHR{15}} ligandi siduva domeeni (LBD) in silico modelleerimise tulemused näitasime seejärel, et kurkumiin pärssis tõenäoliselt AHR-1 aktiivsust ligandis. sidumisest sõltumatul viisil. Eelkõige ja kooskõlas C.elegansi ja EC andmetega avaldasid kurkumiin ja prooksüdandid AHR-1 aktiivsusele vastupidist mõju, mis tähendab, et kurkumiin võib moduleerida AHR-1 aktiivsust oma antioksüdantse võime kaudu kas otse. või kaudselt Nrf2/SKN-1 või muude redoks-regulatiivsete valkude regulatsiooni kaudu.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. C.elegan1s

2.1.1. C. elegansi tüved ja kasvatamine

Kasutasime järgmisi C.elegansi tüvesid: N2 [metsiktüüp], CZ2485 [ahr-1(jul45)], NV38b [alhr-1(ju145);unc-54p:Q40 :YFP], NV38wt [unc-54p::Q40:YFP] (algne tüvi AM141 [48]), NV42a [unc-54p::alphasymuclein::YFP, ahr-1 (jul45)], NV42wt [unc-54p::alphasynuclein::YFPI (algne tüvi NL5901 [49]), NV35a [ahr-1(ju145);(pAF15)gst-4 p::GFP::NLS], NV35wt (pAF15)st-4p::GFP::NLS] (algne tüvi CL2166). Hoolduse huvides hoiti usse sünkroonituna munemisega 20 kraadi juures nematoodide kasvusöötmel. (NGM) plaatidele ja söödeti E. coli OP50-ga vastavalt punktis [25] kirjeldatud meetoditele. Katsete jaoks sünkroniseeriti ussid plaatidel, millele oli lisatud E. coli HT115(DE3), plaatidel, millele oli lisatud 1 mM IPTG (Fisher Scientific, Geel, Belgia).

2.1.2. Geeni vaigistamine RNA-vahendatud interferentsiga (RNAi)

Geeni vaigistamine saavutati E. coli HT115(DE3) ekspresseerivate plasmiidide söötmisega spetsiifiliste geenide vastase dsRNA-ga [50]. RNAi toitmist rakendati pidevalt sünnist surmani. Juglooniresistentsuse testimiseks HT115 (skn-1) bakteritega toideti L4 ussidest RNAi-d 24 tundi enne nende ülekandmist värsketele juglooniplaatidele.

2.1.3. E.coli tüved ja kasv

Baktereid kasvatati LB söötmes 37 kraadi juures üleöö. E.coli kandvate vektorite kasutamisel lisati LB söödet 0.01 protsenti ampitsilliini ja 0,0005 protsenti tetratsükliini.E.coli HT115(L4440), HT115(ugt{{8} }),HT115(skn-1) ja OP50 saadi Ahringer C. elegansi RNAi raamatukogust [51].

2.1.4.Eluiga

Eluea analüüsi alustati sünkroniseeritud usside populatsioonist, mida kanti viljaka perioodi jooksul iga päev värsketele NGM-plaatidele. Pärast viljakat faasi viidi loomi üle igal teisel päeval. Ülekandmise käigus hinnati surnud, elusaid ja tsenseeritud loomi. Loomad loeti surnuks, kui nad ei näidanud liikumist ega reageerimist plaatinatraadiga käsitsi stiimulile ega neelu pumpamist. Sisemise koorunud (kotid) ja lõhkenud häbemega või seinale kuivanud loomi tsenseeriti. Surnud ja tsenseeritud loomade arvu kasutati OASIS[52] või OASIS 2[53] ellujäämise analüüsiks. OASISe ja OASIS 2 keskmise eluea ja ellujäämiskõvera arvutamiseks kasutati Kaplan-Meieri hinnangut ja p-väärtused arvutati loomade ühendatud populatsioonide logaritmilise järjestuse testi abil.

2.1.5. Liikumise/tervise ulatus

Liikumine määrati tervisliku vananemise parameetriks ja aktiivse liikumise faasi nimetatakse terviseperioodiks. Seda hinnati eluea testis kasutatud populatsioonides. Loomi, kes roomasid kas spontaanselt või pärast käsitsi stimuleerimist, loeti liikuvateks, surnud loomi või ilma roomamiskäitumiseta loomi aga mitteliikuvateks. Statistiline analüüs viidi läbi vastavalt eluea kirjeldusele.

2.1.6. Kurkumiin C. elegansi ravi

Kurkumiin (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksamaa) lahustati DMSO-s (Carl Roth, Karlsruhe, Saksamaa) kontsentratsioonis 100 mM ja suunati pärast autoklaavimist NGM-i. Kurkumiini lõppkontsentratsioon söötmes oli 100 µM (0,1 protsenti DMSO). Kontrollplaadid sisaldasid 0,1 protsenti DMSO-d. Ussi raviti pidevalt alates munadest.

2.1.7. PolyQ agregaatide kvantifitseerimine

PolyQ40 agregaadid visualiseeriti fluorestsentsmikroskoopiaga (100-kordne suurendus) 10-päevastes ussides, mis anesteseeriti 15 mM naatriumasiidiga (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksamaa). Agregaatide arvu hindamiseks õmmeldi kujutised Fidži paarisõmblemise pistikprogrammi [54] abil, et luua terved ussid, ja agregaatide arv kvantifitseeriti Fidžis [55], kasutades pistikprogrammi "Analyze Particles".

2.1.8. X-sünukleiini agregaatide kvantifitseerimine

-sünukleiini agregaadid 7-ühepäevaste usside pealihastes visualiseeriti fluorestsentsmikroskoopia abil (400-kordne suurendus) ussides, mida anesteseeriti 15 mM naatriumasiidiga (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksamaa, S2002 ). Pildid segmenteeriti kasutades Plastik (versioon 1.3.0) (Anna Kreshuki labor Euroopa molekulaarbioloogia laboris, Heidelberg, Saksamaa) (saadaval aadressil https://www.ilastiku.org/, juurdepääs 10. aprillil 2018)[56] . Segmenteeritud pilte kasutati agregaatide arvu analüüsimiseks Fidžil [55], kasutades pistikprogrammi "Analyze Particles".

2.1.9.Microarray ja GO termini analüüs

Viiest sõltumatust kordusest koguti proovid ligikaudu {{0}}päevaste ussidega seisundi kohta ning RNA ekstraheeriti ja laaditi Affymetrixi kiibile. CEL-vormingus mikrokiibi algandmeid analüüsiti tarkvara R (versioon 3.4.2) (R Foundation, Viin, Austria) ja Bioconductori (The Bioconductor Project, Bioconductor on avatud lähtekoodiga ja avatud arendus) abil [57]. Taustakorrektsioon, normaliseerimine ja ekspressiooni arvutamine viidi läbi oligopaketi58] ja RMA meetodiga. Massiivi kvaliteedikontrolliks kasutati paketti arrayQualityMetrics 3.34.{16}} [59]. Kvaliteedimeetmete tõttu jäeti proov ahr{11}}C5 edasisest analüüsist välja. Erinevalt ekspresseeritud geenid tuvastati, kasutades limma paketti ja lineaarset mudelit ning modereeritud t-statistikat FDR-iga, et testida mitut võrdlust [6{{20}}]. Kasutati p-väärtust 0,1. Erinevalt ekspresseeritud geene analüüsiti geeniontoloogia terminite rikastamiseks, kasutades Cytoscape'i (versioon 3.6.0) (sõltumatu mittetulundusorganisatsioon Cytoscape Consortium)[61] ja pistikprogrammi ClueGo (versioon 2.5.0) (Laboratory of Integrative). Cancer Immunology, Pariis, Prantsusmaa)[62]. Mikrokiibi andmetele pääseb juurde Gene Expression Omnibusi liitumisnumbri kaudu. GSE195769.

2.1.10.ROS-i kvantifitseerimine

MtROS tuvastati elusate wt ja ahr{0}} mutantsete usside puhul, kasutades MitoSOX Red (Ther-moFisher Scientific, Dreieich, Saksamaa). Nematoodid sünkroniseeriti munade munemisega IPTG-plaatidele, kasutades toiduna HT115 (L4440) baktereid. Seejärel, 48 tundi hiljem, viidi 50 L4 staadiumis looma värskelt valmistatud 10 μM MitoSOX Red plaatidele, millele oli külvatud UV-ga tapetud HT115 (L4440). Ussid inkubeeriti pimedas 20 kraadi juures. Pärast 16-tunnist inkubeerimist viidi need 1 tunniks uutele NGM-plaatidele, mis olid laotatud elusa HT115 (L4440)-ga, et eemaldada soolestikust värvaine jäägid. Kujutise tegemiseks paigaldati nematoodid 2-protsendilistele agaroosipadja alusklaasidele, tuimastati 10 mM levamisooli lisamisega ja fikseeriti ProLongTM Glass Antifade Mountantiga (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Saksamaa). Pildid saadi kohe Zeiss Axio Imager M1 mikroskoobiga (Carl Zeiss, Inc., Köln, Saksamaa), kasutades 40 × objektiivi ja DsRed filtrit. Seejärel valiti ussipea piirkond käsitsi ja integreeritud intensiivsus arvutati pilditarkvara Fij 55 abil.

2.1.11. Tetrametüülrodamiini etüülestri (TMRE) analüüs

Mitokondriaalse membraani potentsiaali hindamiseks sünkroniseeriti nematoodid munade munemisega IPTG plaatidele, mis olid külvatud HT115 (L4440) bakteritega. Katsepäeval lahustati TMRE (Invitrogen, Eugene, OR, USA) DMSO-s kontsentratsioonini 5 mM ja seejärel lahjendati kuumusega inaktiveeritud HT115 (L4440) (30 min, 65 kraadi) kontsentratsioonini 30 μM. Ühele plaadile lisati kokku 150 μL seda lahust ja jäeti umbes 30 minutiks pimedas kuivama. Kuuskümmend täiskasvanud sünkroonset ussi 1, 3 või 5 täiskasvanueas koguti ettevalmistatud TMRE plaatidele ja jäeti plekile imenduma 2 tunniks pimedas 20 kraadi juures. Pärast värvimist kanti ussid IPTG plaatidele, mis olid külvatud kuumusega inaktiveeritud HT115 (L4440) ja inkubeeriti 1 tund pimedas 20 kraadi juures, et eemaldada soolestikust värvaine jäägid.cistanche peenise suurusPildimiseks paigaldati 10 nematoodi 2-protsendilistele agaroosipadja alusklaasidele, tuimastati 10 mM levamisooli lisamisega ja fikseeriti ProLongM Glass Antifade Mountant'iga (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Saksamaa). Iga katsesõidu jaoks valmistati rühma kohta 5 slaidi. Pildid saadi kohe Zeiss Axio Imager M1 mikroskoobiga (Carl Zeiss, Köln, Saksamaa), kasutades 2,5-kordset objektiivi ja DsRed-filtrit. Fluorestsentsi intensiivsus arvutati Fidži [55] abil.

2.1.12. Neelu pumpamise kiiruse ja motoorika test

N2 ja CZ2485 nematoodid sünkroniseeriti pleegitamise teel [63] ja munad jäeti orbitaalsel raputamisel ööseks haudemunade puhvrisse (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3). L1 vastsed märgiti NGM-ile, millele oli lisatud 1 mM IPTG ja mis sisaldas 0,1 protsenti DMSO-d või 100 µM kurkumiini. Toiduna kasutati baktereid HT115 (L4440). Noored täiskasvanud ussid koguti M9 puhvriga, tsentrifuugiti (300 g × 3 min) ja pesti kaks korda bakterite eemaldamiseks. Usse inkubeeriti 0-1 mM H, O, (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Saksamaa) (100 ussi/100 μL) orbitaalsel loksutamisel 2 tundi. Kontroll-usse inkubeeriti ainult M9 puhvriga. 2 tunni pärast viidi ussid NGM-i, millele oli lisatud 1 mM IPTG ja mis sisaldas 0,1 protsenti DMSO-d või 100 µM kurkumiini ja külvati toiduna HT115 (L4440) baktereid. Neelu pumpamise kiirus, mis arvutati neelu terminali pirni kokkutõmbumise kordade loendamisel 1-minutise intervalliga (pumbad/min) ja motoorika test, mis arvutati kehalööbe arvu (keha painded/min) loendamisega M9 puhvrit 1-minutilise intervalliga hinnati 2 kuni 20 tundi hiljem.

2.1.13. Ägeda juglooni tundlikkuse test

N2 ja CZ2485 nematoodid sünkroniseeriti munade munemisega NGM-plaatidele kas DMSO või 100 μM kurkumiiniga. Plaate täiendati 1 mM IPTG-ga ja külvati toiduna HT115(L4440) või HT115(ugt-45) ​​bakteritega. Naha-1 RNAi mõju hindamiseks sünkroniseeriti ussid munemise teel DMSO- või kurkumiiniplaatidele, mis olid külvatud HT115(L4440)bakteritega. Kui nematoodid jõudsid L4 vastsete staadiumisse, kanti nad 24 tunniks DMSO- või kurkumiiniplaatidele, mis olid külvatud HT115(nahk-1)bakteritega. 1. päeva täiskasvanud ussid (25 ussi) viidi värsketele NGM-plaatidele, mis sisaldasid 200 µM Juglone (Merck, Darmstadt, Saksamaa), ja külvati 25 µl 10-kordse kontsentreeritud bakteriga üleöö. Usside ellujäämist jugloonist põhjustatud oksüdatiivse stressi all kontrolliti puutetundliku liikumisega iga tund 6 tunni jooksul. Loomad hinnati surnuks, kui nad ei reageerinud plaatinast traatnõelaga puudutamisele. Seinale kuivanud nematoodid tsenseeriti. Surnud ja tsenseeritud loomade arv hinnati ning ellujäämise analüüsiks kasutati veebirakendust ellujäämisanalüüsiks OASIS2 [53].

2.1.14. GST-4:GFP intensiivsuse kvantifitseerimine

NV35wt ja NV35a sünkroniseeriti munemisega NGM-plaatidele, millele oli lisatud 1 mM IPTG ja mis sisaldasid 0,1 protsenti DMSO-d või 100 µMkurkumiini. Toiduna kasutati baktereid HT115 (L4440), HT115 (ugt-45) ja HT115 (nahk-7). GFP fluorestsentsi visualiseerimiseks tuimastati 1. päeval täiskasvanud ussid 10 mM levamisoolvesinikkloriidi lahusega ja paigaldati 2-protsendilistele agaroosipadjadele. Pildid saadi kohe Zeiss Axio Imager M1 mikroskoobiga (Carl Zeiss, Köln, Saksamaa), 2,5-kordse suurendusega ja seejärel analüüsiti tarkvara CellProfiler (projektimeeskond CellProfiler, Cimini Lab MIT Broad Institute'is ja Harvard, MA, USA). Lühidalt, pilte töödeldi torujuhtme abil, et segmenteerida ereda välja mikroskoopia abil iga pildi ussid ja eraldada need taustast. Seejärel mõõdeti integreeritud GFP intensiivsust ussi kohta.

2.1.15. Poolkvantitatiivne reaalajas PCR (qPCR) C. elegansis

Koguti proovid kolmest sõltumatust kordusest, mis sisaldasid ligikaudu 1000 3-päevaseid usse seisundi kohta ja ekstraheeriti RNA. Pärast pesemist ja elueerimist kvantifitseeriti RNA sisaldus spektrofotomeetriliselt ja cDNA sünteesiks kasutati 1-2 ug RNA-d (Omniscript RT Kit (Qiagen, Hilden, Saksamaa).cistanche pulberPraimerite paarid on loetletud tabelis S1. Reaalaja qPCR jaoks lahjendati cDNA 10 mM TRIS-is (pH 8,0) vahekorras 1:20. Reaktsiooni jaoks kasutati qPCR Green Core komplekti (Jena Biosciences, Jena, Saksamaa)) või GoTaq⑧ qPCR komplekti (Promega, Walldorf, Saksamaa). Proove viidi läbi MyiQ2 tsükleris (BioRad, Feldkirchen, Saksamaa) ja iga proovi ekspressiooni mõõdeti kahes eksemplaris samal mitme süvendiga plaadil. Ekspressioon arvutati iO5 tarkvara abil võrdlusgeenide akt-1 ja CDC-42 suhtes. Kõik kogutud andmed võimaldati geeniuuringuks vastavalt BioRad kasutaja juhistele ja ekspressioon arvutati normaliseeritud ekspressiooni (ddCr) abil. Normaliseeritud ekspressiooni õigeks kvantifitseerimiseks lisati iga praimeripaari reaktsiooni efektiivsus. Tõhusust hinnati cDNA lahjendustega 1:20, 1:100, 1:500 ja 1:2500. Normaliseeritud ekspressiooniväärtuste põhjal arvutati iga korduse korral metsiktüübiga võrreldes korduv muutus.

2.2. Imetajate rakud

2.2.1.Cos7 rakkude kultiveerimine

Cos7 rakke (ATTC, #CRL-1651) kasvatati 37 kraadi ja 5 protsendi CO juures Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmes (DMEM) (Gibco/ThermoScientific, Dreieich, Saksamaa), mis sisaldas 1 protsenti püruvaati, 1 protsenti Glutamaxi ja 1 protsenti. 0 protsenti veiseloote seerumit (FBS) (Gibco/ThermoScientific, Dreier-ich, Saksamaa) ja veel penitsilliini (10.000 ühikut/mL)/streptomütsiini kohta (10.000 ug/ mL) Niipea, kui rakud ehitasid konfluentse raku muru, eraldati need aluselt, kasutades 0,05% trüpsiini/EDTA (Thermo Scientific, Dreieich, Saksamaa).

2.2.2. Transfektsiooni plasmiidid

Kasutasime Cos7 rakkude transfektsiooniks järgmisi plasmiide: pcDNA3, pcDNA3-Ahr-1-VP16, pcDNA3-AhA-1-VP16, pcDNA3-AhR -1(juuli 45)-VP16, p1A1-FL, Perl-TK. Plasmiide ​​on kirjeldanud Larigot et al. (esitatud koos selle uuringuga). Plasmiid p1A1-FL kannab XRE-ga indutseeritavat lutsiferaasi, Perl-TK kannab renilla lutsiferaasi ning pcDNA3-Ahr-1-VP16 ja pcDNA3-AhA{{24 }}VP16 kannab järjestusi vastavalt C.elegansi AHR-1 ja AHA-1 ekspressiooniks. Selle uuringu jaoks lõime pcDNA3-AhR-1(LBD)-VP16 pcDNA3-Ahr-1-VP16 plasmiidi saidipõhise mutageneesi ja QuikChange II saidipõhise plasmiidi abil. Mutageneesi komplekt (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Järgmist praimeripaari kasutati AHR-1 asenduseks L-ks A-ks ja H365-ks H365-ks asenduseks: LBD-F5'-GAGAGCATCGGCGCGACCCAACGGCTGCTGAACGAG 3'jaLBD-R5'-CTCGTTCAGCAGCAGCCGCTGGGATTCGCCT} '.Superkompetentne XL1-Siniseid rakke transformeeriti amplifitseerimiseks saadud plasmiidiga. Plasmiidi järjestust kontrolliti Sangeri sekveneerimisega.

2.2.3. Cos7 rakkude ajutine transfektsioon

24 tundi enne transfektsiooni külvati 000 rakku süvendi kohta 48-süvendiga plaadile 400 uL DMEM-is (pluss 10 protsenti FBS pluss antibiootikumid) ja inkubeeriti 37 kraadi juures. Seejärel transfekteeriti rakud lipofectamine 200 (Invitrogen, Eugene, OR, USA) abil järgmiste kontsentratsioonidega plasmiididega: p1A1-FL(244ng/süvend), Phil-TK(36ng/süvend),pcDNA3- AhA-1-VP16 (5 ng süvendi kohta) ja kas pcDNA3-VP16 (10 ng süvendi kohta), pcDNA3-Ahr-1-VP16 (5 ng süvendi kohta) või pcDNA 3-AhR-1(ju145)-VP16 (5 ng süvendi kohta), nagu on kirjeldanud Larigot et al. (esitatud koos selle uuringuga). Lipofectamine 2000 kasutati kontsentratsioonis 1 uL süvendi kohta ja seda eelinkubeeriti vastavate plasmiididega DMEM-is 20 minutit enne kasutamist. Ajutise transfektsiooni jaoks inkubeeriti Cos7 rakke lipofektamiini/plasmiidi seguga 3hin DMEM jaoks (pluss 10 protsenti FBS) ilma antibiootikumideta, et vältida antibiootikumide põhjustatud toksilisust. Seejärel eemaldati transfektsioonisööde ja asendati 400 µl süvendi kohta DMEM-ga (pluss 10 protsenti FBS pluss antibiootikumid). Transfekteeritud rakke inkubeeriti 37 kraadi juures. Igal plaadil ei transfekteeritud 2 rakuaugu ja seega kasutati neid normaliseerimiseks. 2.2.4.Cos7 rakkude ravi

Kõigi ühendite jaoks valmistati põhilahused, mille kontsentratsioon oli 1000-korda suurem kui soovitud ravikontsentratsioon. Kurkumiin (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksamaa), benso(a)püreen (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksamaa), leflunomiid (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksamaa) ja luteiin (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksamaa) lahustati DMSO-s ( Carl Roth, Karlsruhe, Saksamaa), samas kui resveratrool (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksamaa) ja rotenoon (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksamaa) lahustati etanoolis (Carl Roth, Karlsruhe, Saksamaa). 24 tundi pärast transfektsiooni asendati rakkude rakukultuuri sööde rakukultuurisöötmega, mis sisaldas vastava ühendi 1:100 lahjendust. Rakke töödeldi 24 tundi enne lutsiferaasi aktiivsuse hindamist.

2.2.5. Lutsiferaasi test (AhR aktiivsus)

AhR-i transkriptsioonilist aktiivsust hinnati XRE-juhitava lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmisega [64]. Selleks kasutati Dual-Luciferase Reporter Assay Systemit (Promega, Wall Dorf, Saksamaa). Pärast 24-tunnist töötlemist pesti Cos7 rakke kaks korda PBS-ga ja lüüsiti seejärel 15 minutit toatemperatuuril, kasutades Dual-Luciferase Reporter Assay komplekti kuuluvat passiivset lüüsipuhvrit. Kokku 20 μL lüüsitud rakke pandi valgele 96-süvendiga plaadile ja kasutati luminestsentsi mõõtmiseks. Lutsiferiini (LARII) ja vanilje (Stop&cGlo) substraadid valmistati vastavalt tootja kirjeldusele. Proovid laaditi luminomeetrile (EG&G Berthold microplate Luminometer LB 96V Microluminomat plus (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksamaa)) ja substraadid kinnitati luminomeetri torusüsteemi külge. Kõigepealt lisati igasse süvendisse 65 uL LARII-d. proovist ja mõõdeti tulikärbse lutsiferaasi tekitatud luminestsents, seejärel lisati 65 μL Stop&clo reaktiivi ja mõõdeti Renilla lutsiferaasi poolt tekitatud luminestsents AhR aktiivsuse hindamiseks luminestsentsi mõõtmiste põhjal teostasime järgmise järeltöötluse etapid: Esiteks lahutati iga proovi luminestsentsist taustakorrektsiooniks transfekteerimata rakkude luminestsents Järgmises etapis normaliseerisime lutsiferaasi luminestsentsi sama proovi renilla luminestsentsiks, et kõrvaldada erinevused transfektsiooni kiiruses ja rakus AhR-indep eemaldamiseks viidi läbi iga ravirühma jaoks veel üks pcDNA-VP16 transfekteeritud rakkude normaliseerimise etapp. lõppmõju XRE juhitavale lutsiferaasile.

See artikkel on välja võetud ajakirjast Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants