Aristolohhape indutseerib hiirtel neerufibroosi ja vananemist
Mar 23, 2022
Abstraktne:Neerud on üks vastuvõtlikumaid elundeid vanusega seotud kahjustustele. Üldiselt kaasneb neerude vananemisega neerufibroos, mis on kroonilise haiguse viimane levinud viisneeruhaigused. Aristolohhape (AA), nefrotoksiline aine, põhjustab AA-nefropaatiat (AAN), mida iseloomustab progresseeruv neerufibroos ja funktsionaalne langus. Kuigi neerufibroosi seostatakse neerude vananemisega, jääb ebaselgeks, kas AA kutsub esile neerude vananemise. Käesoleva uuringu eesmärk on uurida AANi potentsiaalset kasutamist neerude vananemise mudelina. Siin uurisime AAN-mudelites vananemisega seotud tegureid, manustades krooniliselt AA-d C57BL / 6 hiirtele. Võrreldes kontrollidega näitas AA rühm vananemistneerudfenotüübid, nagu neeruatroofia, neerufunktsiooni langus ja tubulointerstitsiaalne fibroos. Lisaks soodustas AA rakkude vananemist spetsiifiliseltneerudja suurenenud neeru p16 mRNA ekspressioon ja vananemisega seotud galaktosidaasi aktiivsus. Lisaks ilmnesid AA-ga töödeldud hiirtel proksimaalsed tubulaarsed mitokondriaalsed kõrvalekalded, samuti reaktiivsete hapnikuliikide akumulatsioon. Klotho, vananemisvastane geen, oli samuti oluliselt vähenenudneerudAA-ga töödeldud hiirtest. Käesoleva uuringu tulemused näitavad kollektiivselt, et AA muudab vananemisega seotud tegureid ja et neerufibroos on tihedalt seotud neerude vananemisega.
Märksõnad:krooniline neeruhaigus; neerufibroos; aristolochhape; vananemine; raku vananemine
CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST
SissejuhatusInimeste eluea pideva pikenemisega kannatab üha rohkem inimesi vanusega seotud kahjustuste all.Neerudneid mõjutavad tavaliselt vanusega seotud koekahjustused ja krooniliste haiguste esinemissagedusneeruhaigussuureneb koos vanusega [1]. Neerude vananemine kiirendab üldist vananemist, mille tulemuseks on lühem eluiga. Seetõttu on neerude vananemise uurimine vajalik, kuigi asjakohaseid loommudeleid pole täielikult välja töötatud. Neerude vananemisega kaasnevad mitmesugused patoloogilised muutused, sealhulgas neeruatroofia, glomeruloskleroos ja tubulointerstitsiaalne fibroos [2]. Neeru tubulointerstitsiaalne fibroos on enamiku progresseeruva neeruhaiguse vormide viimane levinud tee, mis viitab sellele, et neerufibroos on tihedalt seotud eakatega.neerud. Vananemisuuringutes on hiired usaldusväärne vahend, kuna neil on geneetiline lähedus inimesele, võime geneetiliselt manipuleerida oma genoomi ja tõsiasi, et neil on eluea jooksul sarnased vananemisega seotud fenotüübid [3]. Sissearetatud hiirte pikisuunalised vaatlused sobivad ideaalselt vananemise mudeliks, kuigi hiirte jälgimine kogu nende eluea jooksul on aeganõudev. Lisaks on olemas mitu geneetiliselt muundatud vananemismudelit. Klotho-puudulik hiir on enneaegse vananemise mudel, mida kasutatakse vananemisuuringutes. Kuid selles mudelis ei mõjutata neerufunktsiooni ja mitmed muud organid peale neerude on kahjustatud [4]. Seega võib see hiiremudel olla neerude vananemise uurimiseks sobimatu.Aristolohhappe (AA) manustamine põhjustab spetsiifilist tüüpi neerukahjustust, mida nimetatakse AA-nefropaatiaks (AAN), mida iseloomustab ulatuslik interstitsiaalne fibroos [5,6]. AA on toksiline neerutorukeste epiteelile, kuna soodustab DNA aduktide moodustumist neerukudedes [7]. Tõenäoliselt ei mõjuta AA muid organeid peale kuseteede süsteemi ja võib olla kasulik selle hindamiseksneerud- spetsiifilised muudatused. Seetõttu kasutatakse AA-d tavaliselt hiirte neerufibroosi mudelite loomiseks [8, 9]. Siiski jääb ebaselgeks, kas AA-indutseeritud muutused on seotud vananemiseganeerud. Selles uuringus uurisime hiirtel AAN-i vanusega seotud fenotüüpe ja molekulaarseid tegureid
Tulemused 2.1. AA manustamine põhjustas märkimisväärse kaalukaotuse, neeruatroofia ja neerufunktsiooni languseKehakaalu algväärtus (BW) ja süstoolne vererõhk (BP) olid kandja-kontroll- ja AA rühmas identsed. Vehiikli kontrollrühma kehamass suurenes järjekindlalt 8 nädala jooksul. Kuid AA manustamine pärssis kaalutõusu ja AA rühmal oli 4 ja 8 nädalat pärast AA manustamise alustamist oluliselt madalam kehamass (joonis 1A). Vehiikli-kontroll- ja AA-rühmade vahel ei olnud olulist erinevust süstoolses vererõhus ega südame löögisageduses (joonis 1B, C). Südame massi ja kehamassi suhe ei näidanud rühmade vahel erinevust 8 nädalat pärast AA manustamise alustamist (joonis 1D), samas kuineerudkaalu/kehakaalu suhe oli AA rühmas oluliselt madalam 8 nädalat pärast AA manustamise alustamist (joonis 1E). Järgmisena uurisime neerufunktsiooni kandja-kontroll- ja AA-rühmades. Plasma kreatiniini ja uurea lämmastiku (UN) kontsentratsioonid olid AA rühmas oluliselt kõrgemad kui vehiikli kontrollrühmas 8 nädalat pärast AA manustamise alustamist. Lisaks vähendas AA-ravi oluliselt kreatiniini kliirensit võrreldes kandja kontrollrühmaga 8 nädalat pärast AA manustamise alustamist (joonis 1F – H).
2.2. AA manustamine kutsus esile ilmse tubulointerstitsiaalse fibroosi ja fibroosiga seotud geeniekspressiooni olulise ülesreguleerimise neerudesHistoloogiline uurimine, kasutades perioodilist happe-Schiffi (PAS) värvimist, näitas, et glomerulaarpiirkond oli AA rühmas oluliselt vähenenud võrreldes vehiikli kontrollrühmaga (joonis 2A). AA rühmas täheldati ulatuslikku tubulointerstitsiaalset fibroosi, mida hinnati Massoni trikroomi (MT) värvimise abil (joonis 2B), samuti neerufibroosiga seotud geenide, kollageeni I ja III ning transformeeriva kasvufaktori mRNA taseme ülesreguleerimist. TGF)- (joonis 2C–E).
2.3.AA manustamine kiirendatud rakkude vananemine, mitokondriaalne düsfunktsioon ja reaktsioonihapniku/geni liikide (ROS) akumuleerumine neerudesRakkude vananemise hindamiseks uurisime p53, p21, p16 ja glutaminaasi (GLS) neerude mRNA ekspressiooni. AA rühm näitas nende vananemisega seotud geenide mRNA taset oluliselt kõrgemal.neerud(Joonis 3A-D). Lisaks vananemisega seotud -galaktosidaasi (SA- -gal) värvumise intensiivsusneerudsuurenes AA rühmas ja peaaegu puudus vehiikli kontrollrühmas (joonis 3E). AA rühmas tuvastas elektronmikroskoopia mitokondriaalsete kristallide kadumise, mitokondriaalse killustumise, tsütoplasmaatilise vakuolisatsiooni ja autolüsosoomide proksimaalsetes tubulaarsetes rakkudes, mis on samaaegselt BCL2/adenoviiruse E1B 19-kDa interakteeruva valgu 3 (Bnip3), mitokondritega seotud geeni allareguleerimine (joonis 3FG). Nox2 neeru mRNA ekspressioon. nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaadi (NADPH) oksüdaasi komponendi sisaldus oli AA rühmas oluliselt suurenenud võrreldes vehiikli kontrollrühmaga (joonis 3H). Lisaks näitas Western blot analüüs, et neerude 4-hüdroksü-2-nominaalne (4-HNE) tase oli AA rühmas oluliselt suurenenud (joonis 3I). Need tulemused näitasid, et AA manustamine kutsus esile rakkude vananemise, mitokondriaalse düsfunktsiooni ja ROS-i akumuleerumiseneerud.
2.4. AA vähendatud neeru Klotho valgu ekspressioonUurisime vananemisvastaste valkude ekspressiooni neerudes vehiikuli kontroll- ja AA rühmas. Klotho ekspressioon vähenes oluliselt AA rühmas võrreldes vehiikli kontrollrühmaga (joonis 4A), samas kui nikotiinamiidfosforibosüültransferaasi (NAMPT) ja sirtuiin1 (SIRT1) neeruekspressioon olid rühmade vahel sarnased (joonis 4B, C).
3. AruteluMeile teadaolevalt on käesolev uuring esimene, mis keskendub neerude vananemisega seotud muutuste hindamisele AAN-is, kasutades vananemismarkereid, nagu p16 ja SA- -gal aktiivsus. AA-ravi soodustas neerude atroofiat, tubulointerstitsiaalset fibroosi ja neerufunktsiooni langust, millega kaasnes neeru p16 mRNA ülesreguleerimine ja SA- -gal-positiivne värvumine. Lisaks näitas AA rühm neerude vananemisega seotud mehhanismide tunnuseid, nagu mitokondriaalsed kõrvalekalded, suurenenud oksüdatiivne stress ja vananemisvastase geeni Klotho alareguleerimine. Kokkuvõttes näitavad meie tähelepanekud, et krooniline AA manustamine imiteerib osaliselt neerude vananemist.
Rakkude vananemine on rakkude proliferatsiooni püsiv peatamine vastuseks erinevatele stressoritele, nagu DNA kahjustus, ning aitab kaasa vananemisele ja vananemisega seotud haigustele. Tsükliinist sõltuva kinaasi inhibiitori p16 ekspressioon on korrelatsioonis vananemisega erinevates organites, sealhulgas neerudes. Kalorite piirang pikendab eluiga, pärssides pl6 ekspressiooni [10]. Lisaks põhjustab p16-ekspresseerivate vananevate rakkude elimineerimine INK-ATTAC hiirtel FK506-siduva valgu dimerisaatori [11] AP20187 süstimise teel neerude vananemise fenotüüpide, nagu glomerulaarskleroos ja neeruhaigus, nõrgenemist. funktsionaalne langus. Seetõttu on p16 üks olulisemaid vananemisega seotud tegureid. Vananevaid rakke saab tuvastada SA- -gal värvimise abil, mis näitab suurenenud -galaktosidaasi aktiivsust pH väärtusel 6,0 [12] ning on vananevate ja vananenud rakkude laialdaselt kasutatav biomarker. Pl16 neeru mRNA ekspressioon suureneb eakatel rottidelneerudja sellega kaasneb suurenenud SA{0}}gal aktiivsus neeruepiteelis [13I. Käesolevas uuringus näitasime suurenenud neeru p16 mRNA ekspressiooni ja SA- -gal-värvimist, mis näitab, et AA kutsub esile neerude vananemise. Hiljuti teatati, et GLS on oluline vananevate rakkude ellujäämiseks tõhustatud glutaminolüüsi ja rakusisese pH neutraliseerimise kaudu [14]. Näidati, et GLS-sõltuva glutaminolüüsi pärssimine eakatel hiirtel kõrvaldab vananevad rakud ja leevendab vanusega seotud elundite talitlushäireid. Käesolevas uuringus näitas neeru GLS-i mRNA ülesreguleerimine rühmas vananevate rakkude neerude akumuleerumist. Seega põhjustas krooniline AA manustamine neerudes rakkude vananemist.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUNKTSIOONI
Lisaks rakkude vananemisele on mitokondriaalne düsfunktsioon oluline vanusega seotud koekahjustuse aluseks olev mehhanism ja sellega kaasneb ROS-i akumuleerumine [15, 16. Mitokondriaalne düsfunktsioon juhib ja hoiab rakkude vananemist [17], samas kui raku vananemine aitab otseselt kaasa mitokondriaalsele düsfunktsioonile [18]. Bnip3, mis asub peamiselt mitokondriaalses välismembraanis, võib vastusena oksüdatiivsele stressile ja hüpoksiale mängida rolli mitofagia reguleerimisel kultiveeritud neerude proksimaalsetes tubulaarsetes rakkudes. Vanematel hiirtel suurendab kalorite piiramine autofagiat tubulaarsetes rakkudes Bnip3 ülesreguleerimise kaudu ja parandab vanusest põhjustatud neerufunktsiooni degeneratsiooni [19]. Käesolevas uuringus näitas elektronmikroskoopia mitokondriaalsete kõrvalekallete tunnuseid, mida võib mõjutada neeru Bnip3 ekspressiooni vähenemine või raku vananemine. Mitokondrid on ROS-i peamine rakusisene allikas. Et hinnata mitokondriaalsete kõrvalekallete mõju neerude ROS-ile, uurisime 4-HINE akumuleerumist neerudes ja näitasime AA-indutseeritud ROS-i akumuleerumist neerudes.neerud.NADPH oksüdaasid on ROS-i peamine allikas. AAN-i ägeda faasi ajal hiirtel tõusis Nox2 neerude mRNA ekspressioon ja lämmastikoksiidi kättesaadavus vähenes, mis viis püsiva hüpoksia ja isheemiani [20. Vanuses rotilneerud, kaasneb ROS-i akumuleerumisega Nox2 suurenenud ekspressioon [21]. Need leiud viitavad sellele, et AA võib esile kutsuda vanusega seotud fenotüüpe mitokondriaalse düsfunktsiooni ja NADPH oksüdaaside ülesreguleerimise põhjustatud ROS-i akumulatsiooni kaudu.
Neeru Klotho geeni ekspressioon vähenes AA rühmas, samas kui NAMPT ja SIRTl ekspressioon oli rühmade vahel sarnane. Klotho on vananemisvastane geen, mis kodeerib ühe läbipääsuga transmembraanset valku, mis toimib vananemise pärssijana. Klotho puudulikkusega hiirte vananemisprotsess sarnanes inimeste omaga, sealhulgas lühem eluiga, viljatus, arterioskleroos, naha atroofia, osteoporoos ja emfüseem [22]. Hüpomorfsetel mutantsetel Klotho hiirtel ilmnes ka kiirendatud vananemise fenotüüp, mis taastati p16 ablatsiooniga [23]. Kuna Klotho on oluline vananemise tegur, on Klotho geeniga modifitseeritud hiiri vananemise uuringutes laialdaselt kasutatud. Siiski võivad Klotho geeniga modifitseeritud hiired olla sobimatud neerude vananemise uurimiseks, kuna neil hiirtel esineb vananemisega seotud süsteemseid kahjustusi ja asjaolu, et neerufunktsioon on kontrollimata (st kreatiniini tase). Seevastu AAN-hiiremudelit võib kasutada uurimiseesmärkidel ravimitest põhjustatud neerude vananemise mudelina, kuna sellel on mitmeid eeliseid, näiteks rakendamise suhteline lihtsus ja võime hinnata sekkumiste mõju neerufunktsiooni langusele. .
Käesoleval uuringul olid mõned piirangud. Hindasime neerude vananemist, keskendudes peamiselt rakkude vananemisele, mitokondriaalsele morfoloogiale ja vananemisega seotud geeniekspressioonile. Vananemise mehhanismid on aga keerulised ja jäävad halvasti mõistetavaks. Lisaks, kuigi Klotho geeniekspressioon vähenes vastusena AA-le, ei suutnud me näidata põhjuslikku seost AAN-i patoloogiliste muutustega. AAN-i väljatöötamisega seotud erinevate molekulide rollide määramiseks on vaja täiendavaid uuringuid. Sellegipoolest annab käesolev uuring uudseid teadmisi Avani kasutamisest neerude vananemise mudelina. Oluline on märkida, et fenotüübilised muutusedneerudon tugevalt seotud elueaga. kuigineerudon kergesti mõjutatud vananemisega seotud muutustest, neerude vananemise pärssimine võib pikendada üldist eluiga. Seetõttu võivad neerude vananemise täiendavad uuringud AAN-mudelite abil tulevikus pikendada eluiga.
4. Materjalid ja meetodid4.1. LoomadSee uuring viidi läbi vastavalt riiklike tervishoiuinstituutide juhistele katseloomade kasutamise kohta. Kõik loomkatsed kiitis heaks Yokohama City ülikooli loomuuringute komitee (kinnitusnumber: FA20-027) ja need viidi läbi vastavalt ARRIVE juhistele. Tehti jõupingutusi kasutatud loomade arvu ja nende kannatuste vähendamiseks. Hiiri hoiti kontrollitud keskkonnas 12-h valguse/12-h pimeduse tsükli all temperatuuril 25 kraadi C. Hiirtel oli vaba juurdepääs toidule ja veele.
CISTANCHE PARANDAB NEeru-/NEERUNEKTSIOONI
Kaheksanädalased isased C57BL/6 hiired osteti ettevõttest Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) ja määrati pärast 1-nädalast aklimatiseerumist kandja-kontroll- või AA rühma. Hiirtele manustati intraperitoneaalselt vehiikulit või AA-d (Sigma). -Aldrich, St. Louis, MO, USA), mis lahustati väikeses koguses dimetüülsulfoksiidis. Enne käesolevat uuringut viisime läbi eeluuringu, kasutades mitmeid protokolle. Esimene protokoll hõlmas AA (3 mg/kg) manustamist C57BL/6 hiirtele intraperitoneaalselt kaks korda nädalas 4 nädala jooksul ilma remodelleerumisajata; selles protokollis põhjustas AA ilmseid ägedaid neerukahjustusi, nagu laienenud proksimaalsed tuubulid koos harja piiri kaotamisega (täiendav joonis S1). Teises protokollis manustati C57BL/6 hiirtele AA-d (2,5 mg/kg) intraperitoneaalselt üks kord nädalas 4 nädala jooksul, millele järgnes ümberkujundamine 4 nädala jooksul; plasma kreatiniinisisaldus nendel hiirtel oli 0,19 ± {{20}}.080 mg/dl versus 0,18 ± 0,010 mg/dl (vastavalt vehiikli kontroll versus AA; keskmine ± keskmise standardviga (SEM), p=0.86, paaritu Studenti t-test, n=4 rühma kohta) ja plasma UN oli 31,3 ± 5,95 mg/dl versus 30,4 ± 3,87 mg/dl (vastavalt sõiduki kontroll versus AA; keskmine ± SEM, p=0,90, paaritu Studenti t-test, n=4 rühma kohta). Seetõttu otsustasime, et see protokoll ei sobinud neerukahjustuse mudeli jaoks, kuna AA ei kutsunud esile olulist neerufunktsiooni langust. Kolmandas protokollis manustati C57BL/6 hiirtele AA-d (3 mg/kg) intraperitoneaalselt kaks korda nädalas 10 nädala jooksul ilma remodelleerumisajata; nendel hiirtel oli AA rühma suremus 83 protsenti (n=6), samas kui ükski vehiikli kontrollrühma hiirtest ei surnud (n=4). Selles protokollis ei saanud me AA poolt indutseeritud neerufenotüüpi statistiliselt hinnata kõrge suremuse tõttu. Neljandas protokollis manustati C57BL/6 hiirtele AA-d (3 mg/kg) intraperitoneaalselt kaks korda nädalas 4 nädala jooksul, millele järgnes remodelleerumisaeg 4 nädala jooksul; Nendel hiirtel täheldati kroonilisi neerukahjustusi, nagu tubulointerstitsiaalne fibroos ja neerufunktsiooni langus [9]. Seetõttu võtsime nende esialgsete uuringute tulemuste põhjal käesolevas uuringus katsete läbiviimiseks vastu neljanda protokolli.
4.2.BP mõõtmineSüstoolset vererõhku ja südame löögisagedust mõõdeti eelnevalt kirjeldatud sabamanseti meetodil (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Jaapan)[24,25]. Kõik mõõtmised viidi läbi vahemikus 9:00 kuni 14:00. Iga hiirega viidi läbi vähemalt 10 mõõtmist ja analüüsiks kasutati keskmist väärtust.
4.3. Reaalajas kvantitatiivse pöördtranskriptsiooni PCR analüüs Kogu RNA ekstraheeriti neerukudedest, kasutades ISOGEN-i (Nippon Gene, Tokyo, Jaapan) ja komplementaarne DNA (cDNA) sünteesiti SuperScript IⅢFirst-Strand Systemiga (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Reaalajas kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni PCR analüüs viidi läbi, kasutades CFX96 Touch Real-Time PCR tuvastamissüsteemi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ning pöördtranskriptsiooni tooteid inkubeeriti TaqMan PCR Master Mixi ja kohandatud TaqManiga. sond (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), nagu eelnevalt kirjeldatud [26]. Kasutati TaqMani sonde järgmiste geenide vastu: kollageen I(Mm00801666_g1), kollageen II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1), p53(Mm00441964 g1), p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) ja Nox2 (Mm00627011_m1).mRNA tasemed normaliseeriti 18S ribosomaalne RNA.
4.4. Western blot analüüs Valgu ekspressiooni analüüsiti koehomogenaatide Western blot analüüsiga, kasutades eelnevalt kirjeldatud meetodit [27, 28]. Kudedest valmistati koguvalgu ekstraktid, kasutades naatriumdodetsüülsulfaati sisaldavat proovipuhvrit. Iga proovi valgukontsentratsiooni mõõdeti pesuainega ühilduva valguanalüüsi komplekti (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ja NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) abil, kasutades veise seerumi albumiini. standard. Võrdsed kogused koeproovidest saadud valguekstrakte fraktsioneeriti 5-20% polüakrüülamiidgeelidel (ATTO Corp., Tokyo, Jaapan). Eraldatud valgud kanti seejärel poolkuiva ülekandesüsteemi (ATTO Corp., Tokyo, Jaapan) abil polüvinülideendifluoriidmembraanidele. Membraanid blokeeriti 1 tund toatemperatuuril fosfaatpuhverdatud soolalahusega, mis sisaldas 5 protsenti lõssipulbrit. Membraane inkubeeriti primaarsete Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), NAMPT (sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1 (07-131 1:1000, MilliporeSigma) vastaste antikehadega. , Burlington, MA, USA), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Jaapan) ja glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaas (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Membraane pesti ja inkubeeriti sekundaarsete antikehadega 60 minutit toatemperatuuril. Antikeha-antigeeni reaktsioonide kohad visualiseeriti, kasutades täiustatud kemoluminestsentssubstraati (Merck, Kenilworth, NJ, USA). Laadimiskontrollina kasutati GAPDH-d. Pilte analüüsiti kvantitatiivselt, kasutades ChemiDoc Touchi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
4.5. Histoloogiline analüüs viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [29]. Hiirte neerukoed fikseeriti 4-protsendilise paraformaldehüüdiga ja sisestati seejärel parafiini. Sektsioonid (paksused 4 um) värviti PAS- ja MT-plekkidega. Glomerulaarpiirkonna hindamiseks mõõdeti ja keskmistati 50 glomeruli hiire kohta. Kõik pildid saadi BZ-9000 mikroskoobiga (Keyence Corp., Osaka, Jaapan).
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEEREDIALÜÜSI
4.6. SA- -al värvimine Hiirte neerukoed külmutati kiiresti ja paigaldati optimaalse lõiketemperatuuri segusse (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokyo, Jaapan). Lõiked (paksused 4 μm) valmistati krüostaadi (HM550-VPD) abil; Thermo Fisher Scientific) ja paigaldatud klaasalustele. SA- -gal aktiivsust mõõdeti vananemise tuvastamise komplektiga (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, USA) vastavalt tootja protokollidele. Proove vaadeldi ereda välja all × 100 suurendusega, kasutades BZ-9000mikroskoopi (Keyence Corp.. 4.7. Electron MicroscopyElektronmikroskoopia analüüs viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [30]. Hiired anesteseeriti isofluraaniga ja perfuseeriti läbi parema aordikaare hepariniseeritud (5 U/ml) füsioloogilise soolalahuse ja 2,5% glutaaraldehüüdiga 0,1 mol/l fosfaatpuhvris pH 7,4 juures. Transmissioonelektronmikroskoopia proovid sukeldati 2 tunniks 1% osmiumtetroksiidi, dehüdreeriti järjestikku etanoolis ja sisestati Epon segusse. Ulitratiini lõigud värviti uranüülatsetaadi ja pliitsitraadiga ning uuriti Hitachi H-7500 ülekandeelektronmikroskoobiga, mis töötas 80 kV juures (Hitachi, Ltd., Tokyo, Jaapan). Sektsioone vaadeldi × 5000 suurendusega ja pildistati laenguga ühendatud kaameraga.
4.8.Biokeemiline analüüsVereproovid koguti toidetud olekus südame punktsiooniga. Plasma eraldamiseks tsentrifuugiti täisvereproove kiirusel 3000 p/min (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokyo, Jaapan) 10 minutit temperatuuril 4 kraadi. Saadud plasmaproove säilitati -80 kraadi juures. Plasma kreatiniini, ÜRO ja uriini kreatiniini taset mõõdeti Hitachi 7180 autoanalüsaatoriga (Hitachi, Ltd., Tokyo, Jaapan).
4.9. Statistiline analüüs Statistilised analüüsid viidi läbi GraphPad Prism tarkvara abil (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Andmed on esitatud kui keskmine ± SEM. Vehiikli-kontroll- ja AA-rühmade erinevuste võrdlemiseks kasutati paarita Studenti f-testi.p<0.05 was="" considered="" statistically="">
5. KokkuvõttedAA manustamise põhjusedneerudvananemine, koos tubulointerstitsiaalse fibroosi ja neerude atroofiaga. Tulemused viitavad sellele, et neerufibroos on tihedalt seotud neerude vananemisega ja et AAN võib olla kasulik aneerud-spetsiifiline vananemismudel.