Aptameri rakendused neuroteaduses, 1. osa

Abstraktne:

Neuroloogilised haigused, mis on puude peamine põhjus, on pälvinud ülemaailmse terviseringkonna palju tähelepanu.

Närvisüsteem on inimkeha oluline osa. See vastutab inimese taju, mõtlemise, liikumise, psühholoogia ja emotsioonide eest. Siiski võivad mõnedel inimestel esineda neuroloogilisi probleeme, mis mõjutavad nende mälu. Närvisüsteemi haigused viitavad patoloogilistele muutustele kesknärvisüsteemis ja perifeerses närvisüsteemis, nagu insult, Parkinsoni tõbi, Alzheimeri tõbi jne. Need haigused mõjutavad mälu, kuid me kõik saame neist üle aktiivsete meetoditega. Parandage seda.

Esimene on insult. Statistika kohaselt mõjutab insult igal aastal miljoneid inimesi ja üks levinumaid sümptomeid on mälukaotus. Insult on kehale väga kahjulik, kuna mõjutab neid ajuosi, mis varustavad hapnikku ja verd. Insulte saame aga ennetada treenides ja oma toitumisharjumusi muutes. Näiteks võib õige treening, normaalkaalu hoidmine ja tervislik toitumine tõhusalt vähendada insuldiriski ja seeläbi säilitada paremat mälu.

Järgmine on Parkinsoni tõbi. See on liikumishäirega haigus, mis on põhjustatud neuronite surmast. Parkinsoni tõbi võib lisaks liikumisele mõjutada ka mälu. Uuringud näitavad, et enamikul patsientidel tekib kognitiivne häire, sealhulgas mälukaotus. Siiski võivad patsiendid võtta kasutusele erinevaid meetmeid haiguse progresseerumise edasilükkamiseks, näiteks saada regulaarselt professionaalset ravi ja taastusravi. Hobid, nagu muusika kuulamine, lugemine ja uute oskuste õppimine, võivad samuti olla kasulikud aju lõdvestamisel ja mälu taastumisel.

Lõpuks on Alzheimeri tõbi. See on haigus, mis põhjustab kognitiivseid häireid, mille üks ilmsemaid ja levinumaid sümptomeid on mälukaotus. Kuid Alzheimeri tõbi on ka haigus, mis võib taanduda. Uuringud näitavad, et treenimine, tervislik toitumine, uute oskuste õppimine ja vabatahtlik tegevus võivad aidata aeglustada haiguse progresseerumist ja parandada mälu.

Peaksime alati säilitama positiivse hoiaku ja kasutama aktiivseid meetodeid neuroloogiliste haiguste ennetamiseks ja raviks, et parandada oma mälu. Isegi kui meid see mõjutab, saame rakendada erinevaid meetmeid, et parandada oma vastupanuvõimet ja võimet haigusega võidelda. Kuni jätkame, leiame parema ja tervislikuma tee mälukaotuse ennetamiseks ja raviks. On näha, et me peame parandama mälu ja Cistanche deserticola võib oluliselt parandada mälu, sest Cistanche deserticola on traditsiooniline Hiina ravimmaterjal, millel on palju ainulaadseid toimeid, millest üks on mälu parandamine. Cistanche deserticola efektiivsus tuleneb selles sisalduvatest mitmetest aktiivsetest koostisosadest, sealhulgas parkhape, polüsahhariidid, flavonoidglükosiidid jne. Need koostisosad võivad mitmel viisil edendada aju tervist.

Lühimälu parandamiseks klõpsake nuppu Tea

Üle miljardi inimese kannatab ühe järgmistest neuroloogilistest häiretest: dementsus, epilepsia, insult, migreen, meningiit, Alzheimeri tõbi, Parkinsoni tõbi, hulgiskleroos, amüotroofne lateraalskleroos, Huntingtoni tõbi, priondtõbi või ajukasvajad. Paljude nende haiguste diagnoosimine ja ravivõimalused on piiratud.

Aptameerid, mis on väikesed ja mitteimmunogeensed nukleiinhappemolekulid, mida on lihtne keemiliselt modifitseerida, pakuvad potentsiaalseid diagnostilisi ja terapeutilisi rakendusi nende vajaduste rahuldamiseks.

See ülevaade hõlmab teedrajavaid uuringuid aptameeride rakendamisel, mis näitavad lubadust neuroloogiliste häirete tulevaseks diagnostikaks ja raviks, mis kujutavad endast üha tõsisemaid ülemaailmseid terviseprobleeme.

Märksõnad: aptamer; neuroteadus; neuroloogilised haigused; neuroloogilised häired; neurotoksiinid; vähk.

1. Sissejuhatus

Aptameerid on üheahelalised DNA, RNA või sünteetilised XNA molekulid, mis võivad voltida ainulaadseteks kolmemõõtmelisteks (3D) struktuurideks, millega nad seovad oma sihtmolekule kõrge spetsiifilisuse ja afiinsusega [1, 2].

Aptameeride valimise lähenemisviisi saavutasid 1990. aastal kolm eraldi rühma [3–5]. Seda meetodit tuntakse nüüd kui ligandide süstemaatilise evolutsiooni eksponentsiaalse rikastamise teel (SELEX). Sellest ajast alates on põhiteaduste valdkondades kasutamiseks välja valitud palju aptameere ja üha suurem arv aptameere on teraapias, diagnostikas ja pildistamises kasutamiseks vähearenenud [6–10].

SELEX-meetod simuleerib Darwini evolutsiooni in vitro. See hõlmab mitut valikuvooru ja iga vooru järel viiakse läbi "kõige sobivamate" oligonukleotiidide (oligode) eksponentsiaalne amplifikatsioon.

Traditsioonilise SELEXi üks voor sisaldab kolme etappi järjekorras (1) soovitud sihtmolekuli inkubeerimine oligokogumiga, mille keskne 20–60 nukleotiidist koosnev randomiseeritud järjestuse piirkond on ümbritsetud konstantse järjestuse terminaalsete piirkondadega, mis on hilisemate polümeraasi ahelreaktsioonide (PCR) mallideks. ),(2) püüda kinni kogumis olevad oligod, mis edukalt sihtmärki seovad, ja (3) amplifitseerida püütud oligosid kas PCR või pöördtranskriptsiooni-PCR (rt-PCR) abil, olenevalt oligo, DNA või RNA tüübist.

Kaasatud on ka vastuvaliku voorud, mille käigus nukleiinhapete kogum juhitakse üle tühja tugimaatriksi, ilma soovitud sihtmärgita või üle tugimaatriksi koos ühe või mitme muu molekuliga, mis võivad olla sihtmolekuliga struktuuriliselt seotud.

Vastuvaliku korral püütakse kinni oligod, mis ei seo tugimaatriksit ega struktuurselt sarnaseid molekule, ja jätkatakse SELEXi rohkemate voorude kaudu.

Vastuselektsiooni tehakse mitmel eesmärgil, näiteks oligode kõrvaldamiseks, mis interakteeruvad (1) tugimaatriksiga, (2) analoogide või molekulidega, mis on struktuurilt sarnased sihtmärgiga või (3) molekulidega, mis esinevad bioloogilises maatriksis (nt seerum) suurtes kontsentratsioonides. või koeekstrakt), milles valitud aptameer toimib.

Vastuselektsiooni peamine eesmärk on suurendada aptameeri spetsiifilisust soovitud sihtmärgi suhtes võrreldes teiste potentsiaalsete molekulaarsete konkurentidega. Lisaks tavapärasele SELEXile on populaarseks muutumas hiljuti välja töötatud struktuurivahetus SELEX [11–13].

Selle lähenemisviisi korral peavad oligod sihtmärgiga suhtlemisel oma struktuure muutma, et dissotsieeruda komplementaarsest püüdmisjärjestusest. See tagab, et valitud aptameeride struktuur muutub ligandi sidumisel. Muud alternatiivsed SELEX-meetodid on välja töötatud, sealhulgas CE-SELEX, Cell-SELEX ja in vivo SELEX, nagu on kokku võetud tabelis 1.

On täiesti võimalik kombineerida erinevaid SELEX protseduure, et arendada veelgi keerulisemaid tehnikaid. Pärast seda, kui SELEX on aptameerid valinud, modifitseeritakse neid veelgi, et parandada nende spetsiifilisust ja afiinsust mitme lähenemisviisi abil, mida võib kokkuvõttes nimetada küpsemiseks.

Aptameeride valimisel ja küpsemisel on mitmeid kaalutlusi. Esiteks mõjutavad aptameeride struktuure ja aptameeri-sihtmärgi interaktsioone temperatuur ja puhvri komponendid, sealhulgas ioonid, ioontugevus ja pH.

Seega on SELEXi disaini üks olulisemaid punkte matkida selektsiooni ajal keskkonda (bioloogiline maatriks või soola/puhverkompositsioon), milles aptameeri molekulaarne sihtmärk leitakse ning toimub aptameeri ja sihtmärgi vaheline interaktsioon.

Sobivate puhverkompositsioonide ja inkubatsioonitemperatuuride valimine tagab valitud aptameeride optimaalse jõudluse tingimustes, milles neid kasutatakse [4,30–32].

Teiseks, aptameeri stabiilsust võib olla vaja parandada, kuna DNA ja RNA aptameerid on potentsiaalsed nukleaasirünnakute sihtmärgid. See kehtib eriti RNA puhul 20OH rühma tõttu, mida ribonukleaasid kasutavad hüdrolüüsiks nukleiinhappe karkassi fosfaadi elektrofiilsel rünnakul.

Seega on RNA kõrgete temperatuuride ja pH suhtes labiilsem kui DNA. Aptameere saab küpseda selektsioonijärgsete keemiliste modifikatsioonidega, et seda tundlikkust ületada. Sellised modifikatsioonid võivad aga kaasa tuua aptameeri spetsiifilisuse ja/või afiinsuse kaotuse.

Seetõttu on tavaliselt SELEXi ajal parem kaasata modifitseeritud nukleotiide. Paljud võimalikud aptameeri modifikatsioonid on loetletud tabelis 2.

Valida saab aptameere, mis seovad selektiivselt enamikku kõrge afiinsusega viiruseid, rakke, baktereid, valke, toksiine ja peptiide [45–48]. Neid saab kasutada mitu korda, ilma et see häiriks tegevust. Teisisõnu saab neid edasiseks kasutamiseks sihtmärkidest eraldada.

Seevastu antikehi saab kasutada vaid paar korda, enne kui nad kaotavad funktsionaalsuse. Nukleiinhappe aptameere saab ka küpseda stabiilsemaks kui antikehad ja ensüümid, eriti kõrgematel temperatuuridel [2].

Pealegi, kui aptameeri nende järjestus on teada, on selle keemiline süntees ja puhastamine homogeensuseni väga reprodutseeritav ja odav. Need omadused annavad aptameeridele võimaluse asendada sensoorsete üksuste komponentidena antikehi [49].

Aptameeride struktuuride paindlikkus ja nende võime "maskeerida" aptameeride järjestuse piirkondi komplementaarsete oligodega pakub signaaliülekande võimalusi, mis võimaldavad lisada aptameerid paljudele anduriplatvormidele, mis ei ole antikehadega kergesti kohandatavad. Need omadused motiveerivad aptameeripõhist biosensori arendamist [50–52].

Uute diagnostikavahendite väljatöötamine on biosensorite valdkonnas üks silmapaistvamaid valdkondi, kusjuures paljud uurijad soovivad luua lihtsaid, tõhusaid ja odavamaid meetodeid varajase diagnoosimise ja täppismeditsiini saavutamiseks.

Aptameeride kaasamine biosensoritesse (nimega "aptasensorid") juurdus 1990. aastatel.

Varaseks näiteks aptameeridest kui biotuvastuselementidest on optiline biosensor, mis kasutas homogeenses testis inimese neutrofiilide elastaasi suhtes fluorestsentsmärgistatud aptameere [53].

Sellest ajast alates on teatatud paljudest aptasensori konstruktsioonidest, millest enamik on tahketel alustel aptameeridega ning elektrokeemiliste, optiliste, mehaaniliste ja akustiliste signaalidega [45,54–56]. Mõningaid näiteid arutatakse käesolevas artiklis hiljem.

Aptameere on kasutatud ka teraapias. Modifikatsioonid, mille tulemuseks on poolväärtusaja pikenemine ja paranenud farmakokineetika, muudavad mõned aptameerid heaks kliiniliseks kasutamiseks. Võrreldes antikehadega on aptameerid palju vähem immunogeensed ja nende toimet saab pärssida vastupidiste komplementaarsete oligonukleotiididega (Munzar et al., 2019).

Need olulised omadused soovitavad aptameere arendada raviainetena. Macugen (pegaptaniibnaatrium), mis tunneb selektiivselt ära veresoonte endoteeli kasvufaktori (VEGF), oli esimene aptameer, mis kiideti heaks raviainena (Tobin, 2006).

Sellest ajast alates on mitmed aptameerid jõudnud kliiniliste uuringute eri etappidesse, kus neid testitakse selliste haigusseisundite, nagu väikerakk-kopsuvähi, von Willebrandi faktoriga seotud häire, angioomide ja neerurakk-kartsinoomide raviks [51,57–60].

Teine potentsiaalne aptameeride terapeutiline rakendus hõlmab manustamissüsteeme [61,62]. Nendes süsteemides tõhusate tulemuste saavutamiseks peaksid aptameerid ära tundma rakupinna valgud oma natiivsetes vormides.

Cell-SELEX töötati välja selleks, et selekteerida rakupinna valke, mida on nende natiivsel kujul sageli raske puhastada [63]. Aptameer, mis tunneb ära atsellu pinnavalgu, võib koopteerida retseptorit, et internaliseerida aptameeri külge kinnitatud lasti. Selle meetodi abil saab valida aptameerid retseptoritele, mis ekspresseeritakse peamiselt ühes rakutüübis, mida saab sihtida in vivo [57].

Näiteks töötati välja anti-PSMA (eesnäärme-spetsiifiline membraanantigeen) aptameerid siRNA-de kohaletoimetamiseks hiirte või kultiveeritud rakkude kasvajatesse [62, 64–66].

Neuroteaduses on aptameeride kasutamine seni olnud piiratud, kuigi sellel on väga lai valik potentsiaalseid rakendusi. Aptameere on kirjeldatud kui võimalikke ravivõimalusi neurodegeneratiivsete haiguste korral, mis põhjustavad kesknärvisüsteemi (KNS) struktuuri ja funktsioonide kaotust, sealhulgas Alzheimeri tõbi (AD), Parkinsoni tõbi (PD), Creutzfeldt-Jakobi tõbi, motoorsete neuronite haigused ja Huntingtoni tõbi. haigus (HD) (joonis 1). Praegu kannatab maailmas umbes 50 miljonit inimest dementsusega, mille ülemaailmsed tervishoiukulud on ligi triljon USA dollarit aastas.

See teeb dementsusest meie ühiskonna ühe suurima meditsiinilise ja majandusliku probleemi [67]. Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ja Maailma Terviseorganisatsiooni andmetel kahekordistub üle 65-aastane elanikkond 2050. aastaks.

Seetõttu nõuavad vanusest sõltuvad neurodegeneratiivsed haigused diagnoosimiseks ja raviks üha suuremaid kulutusi [67].

Neid kriitilisi nõudmisi varajase diagnoosimise ja uute terapeutiliste rakenduste hõlbustamiseks kasutatavate meetodite järele võivad rahuldada aptameerid, mis võivad olla ka lahendused mõnele tüsistusele [68, 69].

Aptameere töötatakse välja rakendusteks aju kuvamistehnoloogiates (MRI, PET jne), neurotransmitterite visualiseerimiseks, diagnoosimiseks ning ajukasvajate ja muude ajuga seotud haiguste raviks. Paljude nende lähenemisviiside puhul märgistatakse aptameerid PET-pildistamiseks radioaktiivsete märgistega, nagu fluor{1}} [70]. Selles ülevaates käsitleme aptameeride aju kuvamisel ja närvihaigustel rakendamisel saavutatud saavutusi ja väljakutseid.

2. Molekulaarne tuvastamine

2.1. Neurotoksiinide tuvastamine
Neurotoksiinid on keemiliselt mitmekesine farmakoloogiliselt aktiivsete ühendite rühm. Nad avaldavad selget bioloogilist mõju organismide närvisüsteemile, kuid erinevad oma keemilise struktuuri ja toimemehhanismide poolest.

Need muudavad aktsioonipotentsiaali ja häirivad närviimpulsside ülekannet. Nende inimeste tervise- ja keskkonnamõjude riskide nõuetekohaseks hindamiseks on nende täpseks tuvastamiseks oluline kasutada piisavalt tundlikke tehnikaid.

Nukleiinhappe aptameere on kasutatud nende toksiinide olemasolu kinnitamiseks vees ja bioloogilistes proovides kõrge tundlikkuse ja selektiivsusega [71]. On teatatud uuringutest, mis näitavad botuliinneurotoksiinide (Botulinum A, E), saksitoksiini, brevotoksiini, parakvaadi ja tetrodotoksiini täpset tuvastamist aptasensorite abil.

Botuliini neurotoksiinid (BoNT-d) on ühed surmavamad neurotoksiinid ja neid võib potentsiaalselt kasutada bioterrorismi ainetena. Et lahendada ülioluline vajadus tundliku, tõhusa ja reaalajas BoNT-de tuvastamise süsteemi järele, kasutati sool-geelipõhist SELEX-i, et isoleerida DNA aptameerid E tüüpi botuliinneurotoksiini (BoNT-E) vastu [47].

Aptamercandidate järjestusi analüüsiti pärast viiendat vooru järgmise põlvkonna sekveneerimisega (NGS) ja iseloomustati kõrgsageduslikke aptameere. Nendes aptameeriperekondades oli aptamerBT5.6 BoNT-E suhtes kõrge afiinsus, 53 nM Kd, ja see immobiliseeriti grafeenoksiidi platvormile. See andur näitas BoNT-E tuvastamispiiri (LoD) 0,83 nM.

Brevotoksiinid (BTX) ja saksitoksiinid on mere neurotoksiinid, mis põhjustavad neuroloogilist karpide mürgitust (NSP). BTX-sid iseloomustab kõrge toksilisus ja NSP kiire tekkimine. Nende analüüsiga seotud tehnilised raskused on innustanud teadlasi otsima alternatiivseid, tõhusaid ja odavaid meetodeid nende tugevate neurotoksiinide tuvastamiseks.

Sel eesmärgil töötati BTX{0}} tuvastamiseks välja elektrokeemiline aptasensor, mille jaoks neid valitud DNA aptameere iseloomustati elektrokeemilise impedantsi spektroskoopia (EIS) ja fluorestsentsi abil.

Aptameer BT10, mille afiinsus BTX-2 suhtes oli 42 nM, lisati märgisevabasse konkureerivasse impedimeetrilisse biosensorisse, mis näitas BTX-2 tuvastamispiiriks 95 pM.

See aptasensor suutis karpide maatriksi juuresolekul usaldusväärse vastusega tuvastada BTX-2 teravdatud karpide ekstraktis [72]. Mere neurotoksiinide teise klassina iseloomustati saksitoksiini rahvatervise tähtsusega.

Sobivate alternatiividena tuli välja töötada uudsed uuringud praegu kasutatavate süsteemide tehniliste ja eetiliste probleemide tõttu. Selle vajaduse lahendamiseks töötati välja etiketivaba optilise biokihi interferomeetria konkureeriv aptasensor. Biosensori saksitoksiini avastamispiir on 1,66 nM, millel on kõrge selektiivsus ja tundlikkus, hea stabiilsus ja kiire tuvastamise võimalus [73].

Sarnaselt meretoksiinidega on maohammustuse korral vabanevad neurotoksiinid ühed võimsamad ja surmavamad toksiinid. Kahjuks ei saa tavapärane maohammustuse diagnostika, mis põhineb vere hüübimisanalüüsidel ja kliinilistel sümptomitel, anda täpset diagnoosi. Samuti raskendavad partiist sõltuvad antikehade jõudluse variatsioonid nende kasutamist diagnostikas.

Kõrge afiinsusega kärbitud versioon -Tox-FL aptameerist, mis algselt selekteeriti Bungarus multicinctus'e ( -Tox-T2) bungarotoksiini vastu kõrgema afiinsusega (Kd=2,8 nM) kui algsel -Tox-FL (18) nM), rakendati ensüümiga seotud aptameeri analüüsi vormingus.

Selle seadistuse korral suudab -Tox-T2 aptameer tuvastada toksiini vaid 2 ng toormürgis, mis näitas selle potentsiaali Bungarus caeruleus'e mürgi tuvastamisel [74].

2.2. Neurotransmitterite tuvastamine

Aju funktsionaalsete keerukuse uurimiseks võib kasutada neurotransmitterite aktiivsuse ja signaaliradade jälgimist. Neurotransmitterid on rakkudevaheliseks teabevahetuseks hädavajalikud ja mängivad võtmerolli neuroloogiliste häirete, nagu epilepsia, Parkinsoni tõbi (PD) ja Alzheimeri tõve (AD) korral.

Mitmetes uuringutes on dopamiini, epinefriini või serotoniini suhtes spetsiifilisi aptameere kasutatud aptameeripõhiste biosensorite väljatöötamiseks neurotransmitterite tuvastamiseks in vivo ja in vitro [75].

Katehhoolamiini neurotransmitter, dopamiin (DA) reguleerib inimese ainevahetuse aspekte ning südame-veresoonkonna ja neerusüsteemi funktsioone. Näidati, et mitmed neurodegeneratiivsed haigused, eriti PD, on otseses korrelatsioonis DA ebanormaalse metabolismiga [76].

Seega on väga tundlike ja selektiivsete biosensorite väljatöötamine DA määramiseks olulised inbioloogilised süsteemid. Esimene DA-vastane RNA aptameer, dopa2, sidus DA-d afiinsusega, mida esindab Kd=2,8 nM [77].

Seda aptameeri kasutades tuvastas grafeeni-polüaniliini komposiitkilel põhinev märgisevaba elektrokeemiline aptasensor edukalt DA ebainimliku seerumi olemasolu, mille LoD oli 1, 98 pM [78]. Hiljutises uuringus töötati välja veel üks DA aptasensor, mis koosnes sensorina DNA aptameerist ja muundurina rohukarbi naha kollageengrafeenoksiidi (GCSC-GO) komposiidist.

Komposiit valmistati ultraheliga ja seda iseloomustati infrapuna- (IR) ja Ramani spektroskoopia, aatomi jõumikroskoopia ja EIS-iga. See süsteem hõlmas aptameeri immobiliseerimist kollageeniks, millele järgnes diferentsiaalimpulsi voltammeetria.

Kuigi aptasensor näitas kõrgemat LoD-d 0,75 nM, võrreldes varasema anduriga 2 pM, näitas see suurt selektiivsust DA liiga lähedaste ühendite suhtes ja mõõdeti täpselt DA-d 10% seerumi juuresolekul [79].

Erinevate vaba märgistuse, kõrge tundlikkuse ja selektiivsusega molekulide analüüsimiseks teatati hiljuti aptameeridega mikrokonsooli massiivi andurist. Andur koosneb 12 mikrokonsooli massiivist, mida on modifitseeritud tioolitud DA-aptameeridega, ja kasutab kuldnanoosakesi (AuNP), mis on konjugeeritud DNA lõiguga, mis on komplementaarne DAaptameeriga mikrokonsooli pinnal.

Algselt DA aptameeriga hübridiseerituna vabanevad AuNP-DNA konjugaadid, kui aptameer seob DA-d, mis suurendab massiivi pindpinget umbes 15 korda ja suurendab läbipainde.

Süsteemi lineaarne reaktsioon on vahemikus 0,5 kuni 4 µM DA-d, mille LoD on 77 nM. Selle spetsiifilisust demonstreeriti 12 struktuurse ja funktsionaalse analoogiga, sealhulgas L-DOPA, millest ükski ei põhjustanud kõrvalekaldeid [80].

For more information:1950477648nn@gmail.com