Ilmne BMAL{0}}sõltuva skeletilihaste ja neerude ristkõne puudumine hiirtel

Abstraktne:BMAL1 on imetajate tsirkadiaankella transkriptsioonifaktor, mis vastutab tuhandete geenide ekspressiooni reguleerimise eest. Varem on isaseid skeletilihas-spetsiifilisi BMAL1-indutseeritava knockoutiga (iMS-BMAL1 KO) hiiri kirjeldatud mudelina, millel on vananemisele sarnanev fenotüüp.muutunud kõnnak, liikumispuudega,lihaste nõrkusjaglükoosi kahjustuskasutuselevõtt. Arvestades seda vananemisfenotüüpi ja sedakrooniline neeruhaiguson vananemisega seotud haigus, selle uuringu eesmärk oli kindlaks teha, kas iMS-BMAL1 KO hiirtel onneeru fenotüüp. Isased iMS-BMAL1 KO ja kontrollhiired nakatati amadala kaaliumisisaldusega dieetviieks päevaks. Mõlemad genotüübid reageerisid asjakohaselt, säilitades uriini kaaliumi. iMS-BMAL1 KO hiired eritasid normaalse dieedi ajal puhkefaasis vähem kaaliumi, kuid aktiivses faasis genotüübi erinevust ei esinenud. Järgmisena kasutati neerukahjustuse markerite võrdlemiseks ja hindamiseks iMS-BMAL1 KO ja kontrollhiirineerufunktsioonenne ja pärast faasi eelprotokolli. Pärast faasi edasiliikumist ei tuvastatud iMS-BMAL1 KO hiirte neerude mitokondriaalses funktsioonis kontrollhiirtega võrreldes erinevusi.

Lisaks olid glomerulaarfiltratsiooni kiirus ja neerude morfoloogia rühmade vahel sarnased vastuseks faasi edenemisele. Kella häirimine skeletilihaskoes aktiveerib isaste hiirte neerudes põletikulisi teid ja on tõendeid selle kohta, et see mõjutab teisi organeid, näiteks kopse. Siiski ei ilmnenud testitud tingimustes mingeid märke neerukahjustusest ega muutunud funktsioonist pärast skeletilihaste kella katkestamist.

TAIMNE VALMISTUS KROONILINE NEERUHAIGUS

Märksõnad: ööpäevase kella geenid; neerufunktsioon; integreeriv füsioloogia

1. Sissejuhatus

Tsirkadiaanrütmid on enamikus füsioloogilistes protsessides silmapaistvad. Nende rütmide juhtimist vahendab osaliselt keskkell, mis asub aju suprahiasmaatilises tuumas, kuid perifeersed ööpäevased kellad mõjutavad ka füsioloogilise funktsiooni rütme [1]. Molekulaarne kell koosneb transkriptsiooni-tõlke tagasisideahelast. Lühidalt, tuumavalgud arüül-süsivesinik-retseptor-tuuma-translokaatoritaoline valk (ARNTL; või BMAL1) ja tsirkadiaansed lokomotoorsed väljundtsüklid kaput (CLOCK) reguleerivad positiivselt perioodi ja krüptokroomi geenide transkriptsiooni; Period (PER) ja Cryptochrome (CRY) valgud annavad tagasisidet ja pärsivad BMAL1/CLOCK aktiivsust (vaadatud [2,3]). Tsirkadiaaniga kontrollitud protsesside katkemist seostatakse paljude patoloogiatega, sealhulgas südame-veresoonkonna ja neeruhaigustega [4,5]. Siiani ei ole sihipärase tsirkadiaanse katkestuse järgsest eri organsüsteemide vahelisest läbirääkimisest hästi aru saadud. See uuring keskendub kella tuuma valgu BMAL1 kustutamisele skeletilihastes ja selle kella häire võimalikele tagajärgedele neerudele.

Varem on kirjeldatud skeletilihas-spetsiifilise BMAL1-indutseeritava knockouti (iMS-BMAL1 KO) hiiremudelit, millel on vananemisel täheldatuga sarnased omadused. Nendel hiirtel on muutunud kõnnak, vähenenud liikuvus, lihasnõrkus ja häiritud glükoosi omastamine [6,7]. Neeruhaigus on vananemise sünonüüm, kuna neeruhaiguste levimus suureneb koos vanusega [8]. Veel üks iMS-BMAL1 KO hiirtel kirjeldatud omadus on see, et neil on suurenenud kõõluste lupjumine [6]. Neerude roll happe-aluse tasakaalus ja mineraalide homöostaasis seob luude tervise otseselt neeruhaigusega. Järelikult püstitasime hüpoteesi, et iMS-BMAL1 KO hiired võivad olla neeruhaiguse mudeliks.

Selle uuringu eesmärk oli kindlaks teha, kas skeletilihaste kella häirimine põhjustab neerufunktsiooni häireid. BMAL1 deletsioon skeletilihastes põhjustab põletikuliste markerite suurenemist neerudes. Siiski ei näi iMS-BMAL1 KO mõjutavat neerufunktsiooni ega neeru histoloogiat. Need andmed viitavad sellele, et skeletilihaste kella katkemise tagajärjed põhjustavad testitud tingimustes minimaalseid muutusi neerudes.

2. Materjalid ja meetodid

Loomad. Selles uuringus kasutatud hiiremudel loodi flokseeritud eksoniga 8 BMAL1 hiirtega [9], mis olid ristatud skeletilihas-spetsiifiliste Cre-rekombinaasi hiirtega (inimese skeleti aktiin-Cre). Cre aktiveeriti tamoksifeeni süstimisega (valmistatud 15% etanoolis päevalilleseemneõlis) 5 nädalat enne uuringut (2 mg/päevas; 5 päeva ip.), et luua iMS BMAL1 KO. Kontrollidena kasutati kandjaga (15% etanooli päevalilleseemneõlis) süstitud Cre+ hiiri. Isaseid neitsihiiri uuriti 17–19 nädala vanuselt ja vanu hiiri 13–14 kuud. Kõik katsed viisid läbi riiklike tervishoiuinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhend ning neid kiitsid heaks ja jälgisid Florida ülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee ning Põhja-Florida/Lõuna-Georgia veteranide administratsiooni institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee. Hiiri hoiti temperatuuri (20–26 ◦C) ja niiskuse kontrolliga 12:12 h valguse-pimeduse tsükliga ruumides. Hiirtele võimaldati ad libitum juurdepääs veele ja standardsele 18% valgusisaldusega näriliste toidule (nr 2918, Harlan Teklad/Envigo, Madison, WI, USA), kui pole märgitud teisiti.

Metaboolse puuri uuring. Noorte isaste hiirte rühma (5 kontroll- ja 5 KS-BMAL1 KO) hoiti uriini kogumiseks ja toidu/vee tarbimise jälgimiseks metaboolsetes puurides [10]. Valmistati pulbripõhine geeldieet (Envigo Teklad Custom Diet), mis sisaldas 1% agarit, ja seda kasutati metaboolsete puuride kogudes. Hiirtele anti 3 päeva aega metaboolsete puuridega kohanemiseks enne kogumise algust kontrolldieedil ({{10}},25% NaCl; 0,6% K; Envigo 99131). Pärast ühepäevast registreerimist kontrolldieediga raviti hiiri viie päeva jooksul kaaliumipuuduse dieediga (0,25% NaCl; 0,0001% K; Envigo 99134). Uriiniproovid koguti iga 12 tunni järel päevavalguse ja öise perioodi lõpus (Zeitgeberi aeg 0 ja 12). Registreeriti uriinieritus, toidu tarbimine ja vee tarbimine. Uriini elektrolüütide kontsentratsiooni mõõdeti leekfotomeetriga (Cole-Parmer Model 2655- 00, Vernon Hills, IL, USA) vastavalt tootja juhistele. Hiired surmati ja kude koguti Zeitgeberi ajal 6.

HERBAL CISTANCHE FOR CHRONIC KIDNEY DISEASE

Keha koostis. Keha koostis kvantifitseeriti teadvusel noortel isastel hiirtel enne ja viis päeva pärast kaaliumivaese dieedi manustamist. Mõõtmised viidi läbi Zeitgeberi ajal 4–6, kasutades EchoMRI kvantitatiivse magnetresonantsi kehakoostise analüsaatorit (Echo Medical Systems, Houston, TX, USA) [11].

Faasi eelprotokoll. Eraldi ealiste isaste hiirte rühm peeti üksikult puurides, mis olid varustatud jooksva rattaga, millel oli ad libitum juurdepääs toidule (nr 2918, Harlan Teklad) ja veele. Puure hoiti pideva õhuvahetusega valgusega juhitavas kastis (Actimetrics, Wilmette, IL, USA). Valgustuse ajakava järgiti 12:12 h valguse-pimeduse tsüklis, kasutades rohelist LED-valgusallikat (~ 200 luksi). Pärast ühenädalast algväärtust nihkus pimedustsükkel 7 tunni võrra edasi ja hiiri kasutati ühe nädala jooksul selle uue 12:12-tunnise hele-pimeduse tsükli ajakava järgi. Seda protsessi korrati teist korda, et tekitada 14-tunnine faasiedenemine. Hiired surmati Zeitbegeri ajal 2 2–3-liikmelistes rühmades ja kude koguti 7–10 päeva pärast faasi edasiliikumise teist nädalat.

HERBAL CISTANCHE FOR CHRONIC KIDNEY DISEASE

Glomerulaarfiltratsiooni kiiruse mõõtmine. Glomerulaarfiltratsiooni kiirust (GFR) mõõdeti eakatel isastel hiirtel enne ja 6–8 päeva pärast 14-h faasi edenemise protokolli, kasutades transdermaalset monitori (MediBeacon GmbH, St. Louis, MO, USA). Hiired eemaldati valgusega juhitavatest kastidest, kuid neid hoiti pimedas. Kasutades ainult punast valgust, süstiti sabaveeni kaudu fluorestseiini isotiotsüanaadi (FITC) märgistatud sinistriini transkutaanset mõõtmist, et hinnata GFR-i Zeitgeberi ajal 18–21 (7,5 mg sinistriini 100 g kehamassi kohta kuni 100 µl soolalahuses).

Rekombinatsiooni spetsiifilisus. Bmal1 rekombinatsiooni spetsiifilisuse kinnitamiseks lõpetasime PCR-i, kasutades 40 ng skeletilihaste genoomset DNA-d ja praimereid rekombineeritud ja rekombineerimata alleelide jaoks. (fwd praimer: ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG, rev-praimer: CTGACCAACTTGCTAACAATTA, rekombinatsioonipraimer: CTCCTAACTTG GTTTTTGTCTGT). Floksitud Bmal1 alleeli päri- ja tagurpidi praimerid annavad 431-bp produkti. Rekombineeritud produkti tuvastamiseks lisati teine pärisuunaline praimer 50 -CTCCTAACTTGGTTTTTGTCTGT-30, mille riba on 572 bp. PCR reaktsiooniproduktid töödeldi 1, 7% agaroosgeelil ning genoomse riba ja rekombinatsioonispetsiifilise riba tuvastamine kinnitas, et kõik tamoksifeeniga ravitud loomad olid koespetsiifilised KO, nagu eelnevalt kirjeldatud [7, 12].

HERBAL CISTANCHE FOR CHRONIC KIDNEY DISEASE

Immunohistokeemia. Inhaleeritava isofluraaniga anesteseerimisel koguti paremad neerud ja lõigati kohe põiki pooleks, seejärel säilitati perjodaadi-lüsiin -2% paraformaldehüüdis ligikaudu 48 tundi temperatuuril 4 °C. Seejärel muudeti vedelik töötlemiseks ettevalmistamiseks PBS-ks. Iga looma neeruproovid sisestati parafiini ning 4-mikromeetri paksused lõigud lõigati ja paigaldati alusklaasidele. Sektsioonid värviti hematoksüliini ja eosiiniga või värviti 3,30 -diaminobensidiini kromogeense substraadiga (vektor), et sihtida BMAL1 (D2L7G rakusignaal; 1:3000; RRID: AB_2728705, Danvers, MA, USA). Sektsioone vaadeldi valgusmikroskoopia abil (Nikon E600, mis oli varustatud Nikon DXM1200F digikaameraga, Melville, New York, NY, USA). Grupi identifikaatorideemaldati igalt slaidilt ja BMAL1 ekspressiooni uuriti või slaide hinnati tubulaarsete vigastuste suhtes, kasutades järgmisi kriteeriume: torukeste protsent, millel ilmnesid tubulaarse nekroosi tunnused, pintsli serva puudumine, torukujuline laienemine ja valkude moodustumine.

Immunoblotanalüüs. Noorte isaste hiirte neerude kortikaalsed piirkonnad lõigati lahti. Kude homogeniseeriti, kasutades T-PER Tissue Protein Extraction Reagenti ja proteaasi-fosfataasi inhibiitori kokteili (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Iga proovi valgukontsentratsioon määrati BCA (Pierce, Thermo Scientific) abil. Valk (25 µg) eraldati 4–20% Tris-HCL eelvalmistatud geelil (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja kanti polüvinülideendifluoriidmembraanile. Membraan värviti 5 minutit Ponceau'ga ja pildistati enne Tris-puhverdatud soolalahusega (TBS) pesemist. Membraan blokeeriti üleöö temperatuuril 4 °C 5% BSA-ga TBS-is pluss 0,1% Tween (TBS T) ja inkubeeriti seejärel üleöö temperatuuril 4 °C lahtiühendamisvastase valguga 1 (UCP1; U6382 MilliporeSigma; 1:1000; RRID: AB). _261838, St. Louis, MO, USA) või anti-GAPDH (14C10 Cell Signaling 2110; RRID: AB_561053). Membraani pesti 30 minutit TBS-T-s ja seejärel

inkubeeriti mädarõika-peroksidaasiga konjugeeritud küülikuvastase sekundaarse antikehaga. Pärast 30-minutilist täiendavat pesemist TBS-T-ga viidi tuvastamine läbi SignalFire ECL reaktiivi (Cell Signaling Technology) abil pildistamiseks 30-sekundilise kokkupuuteajaga. Densitomeetria viidi läbi Fidži abil ja valgu arvukus normaliseeriti Ponceau värvimisega.

Mitmekordsed immuunanalüüsid. Vanadel isastel hiirtel lõigati poolest neerust lahti kortikaalsed ja medullaarsed piirkonnad. Kude homogeniseeriti kas 300 µL (ajukoor) või 250 µL (medulla) puhvris (1% proteaasi-fosfataasi inhibiitori kokteil (Thermo Scientific) 1% 1 M etüleendiamiintetraäädikhapet, 0,1% Tween 20 fosfaadis puhverdatud soolalahus). Iga proovi valgukontsentratsioon määrati BCA (Pierce, Thermo Scientific) abil. Homogenaate mõõdeti valitud analüütide puhul kahes eksemplaris, kasutades MILLIPLEX®-il kaubanduslikke multipleksseid immuunanalüüsi komplekte (cat#'s MCYTOMAG-70K, MBNMAG-41K ja MKI1MAG-94K; EMD MilliporeSigma). Analyzer 3.1 xPONENT System (Luminex 200, Austin, TX, USA) koos andmete analüüsiga tarkvara MILLIPLEX Analyst kaudu. Keskmised analüüsisisesed CV-d olid<5% and the average inter-assay CVs were <15%. The data were converted from pg/mL to pg/mg, using the previously determined protein concentrations.

Neerude mitokondrite eraldamine ja respiromeetria. Pärast faasi edasiliikumist lõigati hiirtelt välja värske neerukoore kude. Mitokondrid eraldati, kasutades mitokondrite isolatsioonikomplekti kudede jaoks (#ab110169; Abcam, Waltham, MA, USA), järgides tootja juhiseid. Mitokondriaalse preparaadi valgukontsentratsioon määrati BCA Protein Assay Kit (Pierce, Thermo Scientific) abil. Isolaadi mitokondriaalne hingamine määrati kahes eksemplaris eelnevalt kalibreeritud ksülograafi kambris, mida hoiti temperatuuril 37 ◦C (Oroboros O2K; Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria), mis sisaldas hingamispuhvrit (MiR05; 0.5). mM EGTA, 3 mM MgCl2·6H2O, 60 mM laktobioonhapet, 20 mM tauriini, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES-i, 110 mM D-sahharoosi ja 1 ui g/l BSA sisuliselt rasvhappevaba, pH 7,1) [13]. Hingamispuhvri hapnikukontsentratsiooni hoiti õhuküllastuse (~200 uM) ja 50 uM vahel. Hapnikutarbimise kiirust (OCR; ρmol O2/s/mg mitokondriaalset valku) mõõdeti, kasutades järgmist substraadi-lahti-inhibiitori-tiitrimise (SUIT) protokolli (sulgudes märgitud reaktiivide kontsentratsioon on kambrites lõplik): (1) LEAK (L) ) hingamist hinnati pärast TCA-tsükli stimuleerimist NADH-seotud substraatide püruvaadi (5 mM), malaadiga (2 mM) ja glutamaadiga (10 mM), et toetada elektronide voolu läbi elektronide transpordisüsteemi (ETS; E) kompleksi I (CI). ); (2) oksüdatiivset fosforüülimist (OXPHOS; P) stimuleeriti adenosiindifosfaadiga (ADP; 2,5 mM) ja registreeriti PCI-na; (3) suktsinaadi (10 mM) lisamine toetas konvergentset elektronide voolu läbi ETS (PCI+II) komplekside I ja II; (4) mitokondriaalse preparaadi kvaliteeti hinnati mitokondri välismembraani terviklikkuse testimise teel, lisades tsütokroom c (10 uM); (5) lahtisiduvat karbonüültsüaniid 4-(trifluorometoksü)fenüülhüdrasooni (FCCP; 0,5 µL-astmed 0,1 mM põhilahust) tiitriti astmeliselt, kuni saavutati maksimaalne lahtihingamine ja registreeriti maksimaalse ETS-i mahuna (ECI+). II); (6) rotenooni (0,5 uM) lisamine inhibeeris ETS-i kompleksi I ja järelejäänud OCR registreeriti maksimaalse ETS-i võimsusena, mida toetab kompleks II substraat (ECII); (7) antimütsiin A (2,5 uM) lisamine inhibeeris ETS-i kompleksi III ja seeläbi kogu elektronide transporti kompleksi IV ning järelejäänud OCR registreeriti mittemitokondriaalse hapnikutarbimisena (ROX) ja lahutati kõigist eelnevatest OCR-idest. ; (8) Seejärel stimuleeriti hapnikutarbimist uuesti N,N,N0,N0 -tetrametüül-p-fenüleendiamiindivesinikkloriidi (TMPD; 0,5 mM; askorbaadi (2 mM) juuresolekul, et vältida kontrollimatut autooksüdatsiooni) lisamisega. TMPD) kunstliku substraadina tsütokroom c vähendamiseks; (9) keemilise tausta oksüdatsioonikiirust TMPD/askorbaadi juuresolekul hinnati kompleksi IV inhibiitori naatriumasiidi (100 mM) lisamisega ja lahutati eelnevast voolust, mille tulemuseks oli tsütokroom c oksüdaasi aktiivsuse (ECIV) maksimaalne võime. Hapniku tarbimise andmed koguti ja analüüsiti DatLab vs. 7.4 (Oroboros Instruments) abil. Flux control suhtarvud (FCR) arvutati hapnikutarbimisena mis tahes hingamisseisundis maksimaalse ETS võimsuse (ECI+II) suhtes.

Voolutsütomeetria. Kopsukoe seediti ja voolutsütomeetriline analüüs viidi läbi, nagu eelnevalt kirjeldatud [14].

HERBAL CISTANCHE FOR CHRONIC KIDNEY DISEASE

Statistilised analüüsid. Graafilised andmed on esitatud kui keskmine ± SEM. Nelja rühma vaheliste erinevuste analüüsimiseks kasutati kahesuunalist ANOVA-d, võimaluse korral korduvate mõõtmistega. Hiirerühmade võrdlemiseks ravirühmadega kasutati Sidaki mitmekordse võrdluse testi. Kahe rühma võrdlemiseks kasutati Studenti t-testi. Analüüs viidi läbi tarkvara GraphPad Prism versiooni 9.2 abil (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).

Statistiline olulisus määrati p < 0,05.

Wecistanche'i tugiteenus:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950