Tsitrusviljade patogeenide ja Cistanche vahelises koostoimes osalevate sekundaarsete metaboliitide seenevastane potentsiaal

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Tsitrusviljadel on oluline mõju maailma majandusele, kuna nende toodang on teiste puuviljadega võrreldes suurim; Näiteks prognoositakse, et 2018/19. aasta apelsinitoodang ulatub maailmas 54,3 miljoni tonnini. Tsitrusviljade kvaliteeti mõjutab peamine tegur pärast koristustseenhaigused,eelkõige Penicillium digitatum põhjustatud roheline hallitus, mis põhjustab 90 protsenti tsitrusviljade kadudest koristusjärgsel perioodil1,3. Koristusjärgsete haiguste tõrjeks kasutatakse laialdaselt sünteetilisi fungitsiide, mis põhjustavad tervise- ja keskkonnaprobleeme. Lisaks on mõned seenetüved välja töötanud resistentsuse tavaliselt kasutatavate fungitsiidide suhtes. Naguseenevastaneresistentsus on muutumas oluliseks probleemiks, uute bioaktiivsete ühendite otsimisel on oluline roll fungitsiidide ulatuslikust kasutamisest kõrvalehoidmisel7. Mikroorganismid on kasuliku bioloogilise aktiivsusega ehk potentsiaaliga looduslike saaduste üks peamisi allikaidseenevastased ained, antibiootikumid, vähivastased ained, pindaktiivsed ained. Kuid lisaks mikroobide geneetilisele potentsiaalile ja mitmekesisusele ei aktiveeru laboris kasutatavates ebaloomulikes kultiveerimistingimustes paljud mikroobide biosünteetilised geenid ja ligipääsetavad on vaid mõned metaboliitide osad10. Mikroobsetest allikatest pärinevate looduslike toodete avastamise piirangute ületamiseks rakendatakse mitmeid strateegiaid, st OSMAC-lähenemist10,11, epigeneetiliste modifikatsioonide kasutamist ja kooskasvatamist14. Looduskeskkonda matkivad kaaskultuurid, millel on mikroobide konkurents piiratud ruumi ja toitainete pärast, on osutunud oluliseks ökoloogiliseks jõuks, mis võib aktiveerida vaikseid geeniklastreid ja kaitsemehhanisme, mis võivad viia bioaktiivsete sekundaarsete metaboliitide tekkeni. 1 Keemiainstituut, University of Campinas, CP 6154, 13083-970, Campinas, SP, Brasiilia. 2 Loodus- ja humanitaarteaduste keskus, ABC föderaalne ülikool, 09210-580, Santo André, SP, Brasiilia. 3 Biomolekulaarse keemia osakond, Leibnizi loodustoodete uurimise ja nakkusbioloogia instituut – Hans Knölli instituut, Jena, Saksamaa. 4 Loodustoodete keemia õppetool, Friedrich Schilleri Ülikool Jena, 07743, Jena, Saksamaa. oluline mitte ainult uute ühendite tuvastamiseks, vaid ka keemiliste sündmuste uurimiseks, mis reguleerivad looduses mikroorganismide vahelisi koostoimeid. Siiani puudub teave selle kohta, kuidas tsitrusviljade patogeensed seened suhtlevad teiste mikroorganismidega samas keskkonnas ning millised on ründe- ja kaitsemehhanismid endofüütsete mikroorganismide või muude fütopatogeenide vastu. See teave võib viia uute sekundaarsete metaboliitide avastamiseni, mis on seotud mikroobide koostoimetega, ja anda paremaid teadmisi mikroobide ökoloogia tähtsusest nakkusprotsessi ajal. Siin näitame Penicillium digitatum'i ja Penicillium citrinum'i vahelist koostoimet, mille eesmärk on otsida uusiseenevastaneühendid, mida saaks kasutada koristusjärgsete haiguste tõrjeks. Seda eesmärki silmas pidades rakendati ühiskultuuri strateegiat ja MSI-d, et indutseerida sekundaarsete metaboliitide tootmist ja anda esmane ülevaade nende bioloogilisest rollist, lähtudes nende ruumilisest jaotusest interaktsioonis. Huvipakkuvad metaboliidid eraldati ja kõik struktuurid selgitati massispektromeetria ja NMR katsete põhjal. Ometiseenevastaneviidi läbi analüüsid ja konfokaalse mikroskoopia analüüsid, et uurida seente metaboliitide potentsiaali uutena.seenevastaneagendid.

Ürdi TSISTANŠ

Materjalid ja meetodid

Seente kultuur.Uuringutes kasutatud Te P. digitatum (PD) tüvi on deponeeritud Hispaania tüüpkultuuride kollektsiooni (CECT) registreerimiskoodi CECT20796 all. P. citrinum (PC) tüve hankis Sylvio Moreira Citrus Center (Cordeirópolis, SP, Brasiilia). P. digitatum ja P. citrinum kultiveeriti kaubanduslikul kartulidekstroosiagaril (PDA) (Acumedia). PDA autoklaaviti 103 KPa (121 kraadi) juures 15 minutit. PDA-plaate hoiti 25 kraadi juures 7 päeva pimedas. Eosed koguti, pestes agari pinda steriilse destilleeritud veega ja lahjendades lõppkontsentratsioonini 106 või 105 spoori ml-1.

Kooskultuuri kasvutingimused seened eoste lahus (106 spoori ml-1) inokuleeriti vastaskülgedel. Plaate inkubeeriti pimedas 25 kraadi juures 7 päeva.

MSI analüüside ja konfokaalse mikroskoopia jaoks valmistati in vitro kaaskultuur, asetades Petri tassile steriilse mikroskoobi alusklaasi, millele järgnes 11 ml PDA22 valamine ja inokulaadid valmistati mikroskoobi alusklaasi kohale. Plaate inkubeeriti pimedas 25 kraadi juures 72 tundi. In vivo kooskultuuri jaoks steriliseeriti küpsed apelsinid (Citrus sinensis) pinnal ja haavati23. Haavakohta inokuleeriti väike tükk PDA-d, mis sisaldas P. citrinum'i. Nakatunud ja kontrollapelsine hoiti steriilsetes 500 ml keeduklaasides pimedas 25 kraadi juures. 10 päeva pärast haavati viljad P. citrinum inokulaadi vastassuunas ekvatoriaalpiirkonnas ja nakatati P. digitatum 106 spoori ml-1 lahusega. Vilju hoiti üle 5 päeva pimedas 25 kraadi juures.

Massispektromeetria kujutise (MSI) analüüs ja MS kujutise genereerimine.

Pärast inkubatsiooniperioodi eemaldati mikroskoobi slaidid Petri tassidelt ja pandi 1 tunniks vaakummeksikaatorisse, et agar täielikult dehüdreerida (Angolini et al., 2015). MSI analüüsid viidi läbi otse kaaskultuuri sisaldava mikroskoobiga positiivses režiimis, kasutades desorptsioonielektropihustusionisatsiooni (DESI) allikat Prosolia Model Omni Spray 2D®-3201), mis oli ühendatud Thermo Scientific QExactive® hübriidkvadrupool-orbitrapiga. Massispektromeeter. MSI andmed saadi massilahutusvõimega 70.000 m/z 200 juures. Kasutatud DESI konfiguratsioon oli sama, mis eelmises töös22. Kujutised genereeriti lahtri laiusega Δm/z=± 0,07 Firefly andmete teisendustarkvaraga (versioon 2.1.05) ja töödeldi BioMap tarkvaraga (versioon 3.8.0.4), mille on välja töötanud Novartis Institutes for BioMedical Research. BioMapis reguleeriti iga pildi töötlemise ajal värviskaala fikseeritud väärtusele. MS-spektreid töödeldi Xcalibur tarkvaraga (versioon 3.0.63), mille töötas välja Thermo Fisher Scientific.

Metaboliitide ekstraheerimine ühiskultuuri katsetest.

Kogu kaaskultuuri sisu in vitro lõigati väikesteks tükkideks ja viidi Erlenmeyeri kolbi. Ekstraheerimine viidi läbi metanooliga. Kolbe töödeldi ultraheliga 1 tund ultrahelivannis ja vaakumfiltreeriti. Lahusti eemaldati alandatud rõhul ja lõplikku ekstrakti säilitati temperatuuril -20 °C.

In vivo kooskultuuri jaoks lõigati apelsinikoored (2 cm × 2 cm) mikroorganismide vahelises liidese tsoonis ja ekstraheeriti 5 ml metanooliga 1 tund ultrahelivannis. Ekstraktid filtriti, kuivatati N2 all ja säilitati temperatuuril -20 °C.

Massispektromeetria analüüs (MS).

Ekstraktid lahjendati metanoolis ja analüüsiti Thermo Scientific QExactive® hübriidkvadrupool-orbitrap massispektromeetriga. Analüüsid viidi läbi positiivses režiimis m/z vahemikus 115–1500, kapillaarpinge 3,4 kV, sisselaske kapillaari temperatuur 280 kraadi, S-lääts 100 V. Süstiti 5 µl proovi. Statsionaarne faas: Termo Scientific kolonn Accucore C18 2,6 µm (2,1 mm × 100 mm). Liikuv faas: 0,1% sipelghape (A) ja atsetonitriil (B). Eluendi profiil (A/B): 95/5 kuni 2/98 15 minuti jooksul, hoidke 5 minutit, kuni 95/5 1,2 minuti jooksul ja hoidke 7,8 minutit. Töötamise koguaeg oli iga käigu kohta 29 minutit ja voolukiirus oli 0,2 ml min-1. Süstimismaht: 5 µL.MS/MS viidi läbi põrkest põhjustatud dissotsiatsiooni (CID) abil m/z vahemikuga 100–800 ja kokkupõrke energia oli vahemikus 10–50 V. Proovid infundeeriti otse elektropihustusega voolukiirusega 5,0 µL min-1. MS ja MS/MS andmeid töödeldi Xcalibur tarkvaraga (versioon 3.0.63), mille töötas välja Thermo Fisher Scientific.

KASUTAGE TSISTANŠE LISAND: PARANDAGE IMmuunsust

Metaboliitide eraldamine (HPLC analüüs).

Sekundaarsete metaboliitide eraldamiseks kasutati Phenomenex kolonni Luna 5 µm Phenyl-Hexyl (25{{10}} × 4,6 mm) ja SHIMADZU silmapaistvat HPLC LC-20AT, mis oli varustatud CBM{{6} }Side siini moodul, SPD-M20A fotodioodide massiivi detektor ja SIL-20automaatne proovivõttur. Liikuv faas: vesi (0,1% sipelghape) (A) ja atsetonitriil (B). Eluendi profiil (A/B): 65/35 kuni 50/50 50 minuti jooksul, kuni 40/60 20 minuti jooksul. Kogu tööaeg oli 70 minutit ja voolukiirus 1,0 ml min-1. Süstimismaht oli 5 µl. Preparatiivne HPLC puhastamine viidi läbi Phenomenex kolonnis Luna 5 µm fenüül-heksüül (250 x 10 mm), kasutades Waters 1525 binaarset HPLC pumpa, mis oli varustatud Waters 2998 fotodioodide massiividetektoriga ja Waters Fraction Collector III, kasutades samu optimeeritud gradiendi tingimusi. Voolukiiruseks määrati 4,7 ml min-1 ja süstimismaht oli 200 µL.

NMR spektroskoopia.

1H NMR, 13C NMR ja 2D katsed viidi läbi seadmetega Bruker Avance III 500 (1H 500,13MHz ja 13C 125,7MHz) ja Bruker Avance III 600 (1H 600,17MHz). Lahustina ja sisemise võrdlusalusena kasutati deutereeritud kloroformi (CDCl3; 7,23 ppm), dimetüülsulfoksiidi (DMSO; 2,50 ppm ja 39,51 ppm) ja tetrametüülsilaani (TMS; 0,0 ppm). Keemilised nihked (δ) väljendati (ppm) ja sidestuskonstandid (J) hertsides (Hz).

Molekulaarse võrgustiku analüüs.

P. citrinum metaboliitide molekulaarne võrgustik loodi Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) veebipõhise töövoo abil (http://gnps.ucsd.edu). Andmed filtreeriti, eemaldades kõik MS/MS piigid pluss /-17 Da piires prekursori m/z-st. MS/MS spektrid filtreeriti akendega, valides kogu spektri ulatuses ainult 6 ülemist piiki pluss /−5{4}}Da aknas. Seejärel koondati andmed konsensusspektrite loomiseks MS-klastrisse, mille lähtemassi tolerants oli 0,2 Da ja MS/MS fragmendi ioonide taluvus 0,2 Da. Lisaks jäeti kõrvale konsensusspektrid, mis sisaldasid vähem kui 2 spektrit. Seejärel loodi võrk, kus servad filtreeriti, et saada koosinusskoor üle 0,65 ja rohkem kui 2 sobitatud piiki. Täiendavaid servi kahe sõlme vahel hoiti võrgus ainult siis, kui iga sõlm kuulus üksteise kümne kõige sarnasema sõlme hulka. Seejärel otsiti võrgus olevaid spektreid GNPS-i spektraalraamatukogude alusel. Raamatukogu spektrid filtreeriti samal viisil kui sisendandmed. Kõigi võrguspektrite ja raamatukogu spektrite vahel peetud vastete skoor pidi olema üle 0,5 ja vähemalt 5 sobitatud piiki.

Seenevastased testid.

Kooskultuuri ekstrakti põhilahus valmistati metanoolis ja lahjendati täiendavalt PDA-s kontsentratsioonini 0,5 mgmL-1. 15 ml saadud lahust valati Petri tassi, millele järgnes 15 ul 105 spoori ml-1 P. digitatum'i lahuse inokuleerimine agariplaadi keskele. Viidi läbi ka kontrollanalüüs. Plaate inkubeeriti pimedas 25 kraadi juures 96 tundi. Sestseenevastaneanalüüsides lisati 2,5 ml PDA-le 6, 9 ja 10 (400 µgmL-1) ning iga lahus valati 6-süvendiga mikroplaadile. Iga agariplaadi keskele inokuleeriti 5 ul 105 spoori ml-1 P. digitatum lahust. Negatiivsed kontrollid viidi läbi kolmes eksemplaris. Mikroplaati inkubeeriti pimedas 25 kraadi juures 96 tundi. Ühendite 1 ja 4 minimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (MIC) määramiseks viidi läbi mikropuljongi lahjendusanalüüs, nagu soovitas Clinical and Laboratory Standards Institute (2008)24 koos väheste muudatustega. Põhilahused 1 ja 4 valmistati vees (5 protsenti metanoolis) ja lahjendati täiendavalt YES söötmes kontsentratsioonivahemikus 600 µg ml-1 kuni 1 µg ml-1. 195 ul igast lahusest kanti üle 96-süvendiga mikroplaadile, millele järgnes 5 ul 105 spoori ml-1 P. digitatum'i lahuse inokuleerimine. Analüüsid tehti kahes eksemplaris ja kontrollid kolmes korduses. Positiivse kontrollina kasutati itrakonasooli (100 µgmL-1). Negatiivsed kontrollid viidi läbi metanooliga YES-s. Mikroplaate inkubeeriti pimedas 25 kraadi juures 96 tundi.

Konfokaalne laserskaneeriv mikroskoopia.

Pärast inkubatsiooniperioodi eemaldati mikroskoobi slaidid Petri tassist. In vitro kooskultuuri proove värviti 20 minuti jooksul Kongo punasega (0,25 massiprotsenti vees) ja pesti korraks destilleeritud veega. Proove analüüsiti Leica TCS SP5 mikroskoobiga. Ergastus toimus He-Ne laseri 543 nm emissioonijoonega ja koguti 570 ja 680 nm vahel kiiratud valgus.

KASUCISTANCHE: PARANDAGE IMmuunsust

Tulemused ja arutlus

MSI näitab potentsiaalseid seenevastaseid aineid P. digitatum'i ja P. citrinum'i vahelises koostoimes.

Uue kuvamiseksseenevastaneühendeid, mis võivad kaitsta tsitrusvilju ja tõrjuda koristusjärgseid haigusi, rakendasime kaaskultuuristrateegiat, mis hõlmas P. digitatum'i ja teist tsitruseliste patogeeni P. citrinum. Ühiskultuur on loodusest inspireeritud strateegia, mille käigus mikroorganismidevaheline konkurents võib indutseerida uute metaboliitide tootmist. Eelmises töös kutsus Trichophyton rubrumi ja Bionectria ochroleuca vaheline kultiveerimine esile uue PS-990 sulfaaditud analoogi tootmise, mis viitab sellele, et see ühend sulfaaditakse seente interaktsiooni ajal veelgi. Veel üks näide seente interaktsioonist saadud ühendist on eraldatud tetrapeptiidtsüklo-(L-leutsüül-trans-4-hüdroksü-L-prolüül-D-leutsüül-trans-4-hüdroksü-L-proliin). Phomopsis sp. K38 ja Alternaria sp. E33; tsüklilisel tetrapeptiidil oli mõõdukas kuni kõrge inhibeeriv toime fütopatogeensete seente vastu, võrreldes kaubandusliku fungitsiidi triadimefon27-ga. Seega on kooskasvatamise katsed elujõuline lähenemisviis, et leida ühendeid, mis võivad pärssida peamisi tsitruseliste fütopatogeene, eriti P. digitatum'i põhjustatud rohehallitust.

Nii oranžis (in vivo) kui ka sünteetilises söötmes (in vitro) läbiviidud kokultiveerimisel täheldasime visuaalselt P. citrinum'i ja P. digitatum'i kasvu pikamaa kasvu pärssimist. Seente interaktsioonis võivad vaikivad geenid aktiveeruda ja kahjulikud metaboliidid saab ühelt partnerilt teisele kahjutuks teha16,28. Tese-indutseeritud metaboliidid lokaliseeritakse tavaliselt vastasseisu tsoonis kaaskultuuride tahkes keskkonnas16. Regulaarsed meetodid, mida kasutatakse metaboliitide tuvastamiseks ja selgitamiseks, näiteks vedeliku (LC-MS) või gaasi (GC-MS) kromatograafiaga ühendatud massispektromeetria, ei anna teavet molekulide ruumilise jaotuse kohta.

Teavet molekulaarse ruumilise jaotuse kohta saab massispektromeetria kujutise (MSI) abil, mis on võimas tööriist, mis genereerib pilte iga massispektris tuvastatud iooni kohta16. MSI kasutamine mikroobsete süsteemide ja nende sekundaarsete metaboliitide mõistmiseks ei ole uus ja uuringuid, kus seda tehnikat edukalt rakendati, võib leida kirjandusest30. Näiteks kasutati MSI-d Bacillus subtilis 3610 ja Streptomyces coelicolor A3 vahelise koostoime uurimiseks. Bakterite kaaskultuuri DESI-kujutis näitas 57 signaali, mis olid ruumiliselt lokaliseeritud bakterikolooniatele, mille tulemusel tuvastati mõned sekundaarsed metaboliidid, nagu surfaktiin ja plipastatiin31. Lisaks näitas MSI analüüs ka seda, et S. coelicoloril on teatud sekundaarsete metaboliitide tootmine inhibeeritud B. subtilise juuresolekul, mis näitab bakterite vahelist koostoimet31.

Seetõttu rakendasime tsitrusviljade patogeenide vahelises interaktsioonis osalevate sekundaarsete metaboliitide tuvastamiseks DESI-MSI otse kaaskultuuri agari pinnale, et visualiseerida ühendite difusiooni vastasseisu tsooni. MSI signaalid saadi ioonide kohta [M pluss H] pluss m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960, m/z 459,1645, m/z 625,3942, m/z 625,3942, m/z z 527,2862, m/z 511,2894 ja m/z 448,2938 (joonised S1–S10). Täheldasime, et kõik mainitud ioonid tuvastati ja kontsentreeriti seente vastasseisu tsooni (joonis 1). Need ühendid võivad olla seotud seene-seene vastasmõjuga ja võivad olla potentsiaalselt uued antimikroobsed ained. M/z 625, 609, 527, 511 ja 448 ioone tootis P. citrinum, samas kui ioonid m/z 519, 503, 475, 460 ja 459 juures tundusid olevat P. digitatum vasturünnak. , paljastades keemilise sõjapidamise nende kahe tsitruseliste patogeeni vahel. MSI analüüside kaudu in vitro tuvastatud ioone tuvastati ka kaaskultuuride ekstraktides in vivo (joonised S11-S20), kasutades substraadina apelsine (joonis 2).

Interaktsioonis osalevate metaboliitide iseloomustamiseks saadi suuremahulise kultiveerimise katsest kaaskultuuri ekstrakt ja huvipakkuvad ühendid, mis tuvastati algselt MSI analüüsidega, eraldati preparatiivse HPLC abil ja iseloomustati tandem-massispektromeetria ja NMR analüüsidega.

DESI-MSI analüüsidega saadud täpsete masside (tabel 1) abil oli võimalik kinnitada P. digitatum'i toodetud indoolalkaloidide olemasolu. Ioonid [M pluss H] pluss m/z 519,1857, m/z 503,1908, m/z 475,1590, m/z 460,1960 ja m/z 459,1645, mis vastavad vastavalt trüptokvialaniinile A (1), trüptokvialaniinile (kvialanoon) 3), 15-dimetüül-2-epi-fumikinasoliin A (4) ja desoksütrüptokvialanoon (5) (keemilised struktuurid on kujutatud joonisel 3). Need ühendid on osa trüptokvialaniinide biosünteesi rajast32 ja need tuvastati varem rohelise hallituse haigusega nakatunud apelsinide DESI-MSI analüüsi käigus23. Ühendist 1 teatati P. digitatum33 toodetud peamise sekundaarse metaboliidina. Siiski näitas selle 1 biosünteesi reguleerimise eest vastutava geeni deletsioon, et 1 ei ole seotud P. digitatumi patogeensusega tsitrusviljade suhtes, kuna mutantide nakatumisvõime ei muutunud34. Trüptokvialaniinide täpne bioloogiline roll on endiselt teadmata34 ja see uuring annab trüptokvialaniinide uue bioloogilise aktiivsuse nende alkaloidide kaasamisega seente koostoimesse. Iooni MS/MS [M pluss H] pluss m/z juures 625,3951 andis fragmentidele m/z 594,3533, 576,3427, 449,2430 ja 431,2325 (joonis S21), sama fragmentatsioonimuster, mis saadi tsitriin A (6) puhul. uuringus, mis hõlmas P. citrinum'i ja Pseudoalteromonas sp. OT5919. Samuti viitas GNPS-i andmebaas, et ioon m/z 625 juures võib olla tsitriniin A. Selle ühendi jaoks saadud tandemmassispekter jagas viit ühist fragmenti tandemmassispektriga 6, mis on andmebaasi hoiustatud (joonis S22). Lisaks on sellel sarnane MS/MS fragmentatsioonimuster tsitriniin A-ga, mille on kirjeldanud Moree et al. (2014). Teatati, et tsitrinadiinid tekivad rohkem ühiskultuuri tingimustes ja kontsentreeriti ühiskultuuri liidestes, mis viitab P. citrinum'i kaitsereaktsioonile teiste mikroorganismide vastu. Eraldatud ühendite molekulaarne võrgustikuanalüüs näitas, et kaaskultuuris osaleb teine ​​tsitriniin. interaktsiooni. Täheldasime, et ioon m/z 609 juures, mis tuvastati algselt MSI analüüsiga, on rühmitatud ühendi 6 (m/z 625) samasse klastrisse (joonis S23), mis viitab sellele, et see ühend on tsitriniinitaoline metaboliit. Molekulaarse võrgustiku analüüsis on seotud metaboliidid rühmitatud samadesse klastritesse, kuna neil on sarnane MS / MS spekter.

Iooni [M pluss H] pluss saadud täpne mass m/z 609,4010 juures vastab ühendile molekulvalemiga C35H53N4O5. Fragmenteerumismuster andis fragmentidele m/z 578,3583, 464,2905, 451,2586 ja 433,2482 (täiendav joonis S24). Puhastatud metaboliidi jaoks saadud 1H NMR ja 1 H-1 H COZY spektrid (joonised S25–S26 ja tabel S1) näitasid sarnaseid sünteesitud desoksütsitrinadiin A signaale, millest teatasid Bian et al. (2013)37. Epoksiidi iseloomulik signaal δH 4, 0 juures selles derivaadis puudus ja vyniili vesiniku signaali võis täheldada δ H 6, 9 juures, mis näitab epoksiidrühma puudumist ja kaksiksideme olemasolu võrreldes tsitriniin A37-ga. See on esimene kord, kui desoksütsitrinadiin A (7) on kirjanduses kirjeldatud mikroorganismi poolt toodetud sekundaarse metaboliidina.

DESI-MSI abil saadud täpsed ioonide massid [M pluss H] pluss m/z juures 527,2862 ja 511,2894 näitasid ühendeid, mille elementaarne koostis oli vastavalt C28H38N4O6 ja C28H38N4O5. MS/MS näitas, et ioonil m/z 511 juures on sarnane struktuur võrreldes m/z 527-ga, välja arvatud hapnikuaatomi puudumine. Iooni killustumine m/z 527 juures andis fragmentidele m/z 281, 247, 219, 182 ja 120 (joonis S27), samas kui ioon m/z 511 juures andis tulemuseks m/z 265, 247, 219, 166 ja 120 (joonis S30). Sama fragmentatsioonimustrit teatati ka Penicillium canescens'i tetrapeptiidide Phe-Val-Val-Tyr (8) järjestusest. Siiski teatati hiljuti tetrapeptiididest 8 ja Phe-Val-Val-Phe (9) kui sekundaarsetest metaboliitidest, mida toodab Penicillium roqueforti. Eraldatud ühendite 1H ja 13C NMR analüüsid (joonised S28–S32 ja tabelid S2-S3) kinnitasid MS/MS abil saadud tulemusi, järeldades, et ioonid m/z 527 ja m/z 511 juures vastavad 8 ja 9 vastavalt. Nende tetrapeptiidide tootmine seente keemilises sõjas ei ole üllatav, sest väikesed peptiidid on tuntud oma antimikroobse toime poolest40. See on esimene aruanne P. citrinum'i sekundaarsete metaboliitide 8 ja 9 kohta. Iooni [M pluss H] pluss m/z 448,2938 korral viitas täpne mass ühendile molekulvalemiga C28H38N3O2, mis on sekundaarse metaboliidi krüsogenamiid A (10) sama koostis (viga =–4,6 ppm). Ühend 10 eraldati ning1H ja13C NMR analüüsid (joonised S33–S34 ja tabel S4) kinnitasid selle struktuuri; see on esimene teade, et krüsogenamiid A osaleb seente koostoimes. Ühendist 10 teatati esmakordselt Penicillium chrysogenum nr 005 sekundaarse metaboliidina, mis on taimega seotud endofüütne seene.Cistanche deserticola. Samuti teatati, et 10 on P. citrinum'i tüve sekundaarne metaboliit42. P. citrinum'i toodetud metaboliitide struktuurid on kujutatud joonisel 4.

Seenevastased testid.

Uurisimeseenevastanekaaskultuuris toodetud metaboliitide aktiivsus ja P. digitatum inokuleeriti agarisöötmesse, mis sisaldas kaaskultuuri ekstrakti. Võrreldes kontrolliga, täheldasime P. digitatumi radiaalse kasvu vähenemist 67 protsenti (joonis S35), mis näitab, et seenesõjas osalevad metaboliidid võivad olla seenevastased ained. Selle hüpoteesi kinnitamiseks testisime isoleeritud ühendeid ja täheldasime, et ühendid 6, 9 ja 10 (400 µg ml-1) vähendasid vastavalt 48%, 41% ja 61% P. digitatum radiaalsest kasvust, võrreldes kontrollrühmaga. (joonis 5), mis kinnitab seenevastast toimet. Leiti, et tsitrinadiinid osalevad P. citrinum'i vastuses kaaskultuurides teistele mikroorganismidele, kuid nende bioloogiline roll bioloogilistes keskkondades on siiani teadmata19. Ühendit 6 testiti Buruli haavandivastase toime suhtes Mycobacterium ulcerans MN209 peal, kuid huvitavat MIC-d ei täheldatud43; samuti teatati 6 tsütotoksilisusest leukeemia- ja kartsinoomirakkude vastu44. Meie tulemused on esimene aruanne tsitrinadiinide antimikroobse toime kohta kirjanduses ja võivad anda esimese ülevaate nende ühendite bioloogilisest rollist seente ja seente koostoimes. Lisaks ei ole krüsogenamiid A-st kunagi teatatud antimikroobse ainena. Ühendil 10 oli neurotsüütidele kaitsev toime oksüdatiivsest stressist põhjustatud rakusurma vastu41, kuid kirjanduses ei ole ühendi 10 jaoks muud bioloogilist aktiivsust kirjeldatud. D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr-iga tehtud seenevastased testid näitasid, et sellel tetrapeptiidil on inhibeeriv toime B. subtiitrite ja sojaoa fütopatogeeni Fusarium virguliforme38 suhtes. Seevastu ei inhibeeriti E. coli, B. subtilis ja S. cerevisiae D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr või D-Phe-L-Val-D-Val-L juuresolekul. -Phe täheldati39. Samuti hinnati trüptokvialaniinide seenevastast toimet, kuna need ühendid tundusid olevat P. digitatumi keemiline reaktsioon P. citrinum'ile keemilises sõjas. Trüptokvialaniine 1 ja 4 testiti ja need näitasid seenevastast toimet P. citrinum'i vastu. Ühendite 1 ja 4 MIC oli 300 µgmL-1, inhibeerides P. citrinum spooride tootmist (joonis S36). Meie teadmiste kohaselt on see esimene aruanne trüptokvialaniinide antimikroobse toime kohta. Hiljuti demonstreeriti, et 1 on insektitsiidne ühend Ae vastu. aegypti vastsed23; seenevastane toime võib anda rohkem arusaamist trüptokvialaniinide rollist tsitruseliste patogeeni keskkonnas, kui need ühendid pole P. digitatum virulentsuse jaoks vajalikud.

KASUCISTANCH: antibakteriaalne

Keemiline sõda muudab P. digitatumi rakuseina ühiskultuuris.

Sekundaarsete metaboliitide toime uurimiseksseenhaigusinteraktsiooni korral värviti kaaskultuuri proovid Congo Rediga ja vaadeldi konfokaalse laserskaneeriva mikroskoopia abil. Kongo punast kasutatakse tavaliselt 1,4 sidet sisaldavate polüsahhariidide värvimiseks, näiteksseenhaigusrakuseina komponent kitiin45,46. P. digitatum hüüfid täheldati vastasseisu tsoonis (proov) ja võrreldi liidese piirkonnast (kontroll) kaugel asuvate hüüfidega (joonis S37). Kontrollhüüfid värviti homogeenselt Kongo punasega, samas kui liidese piirkonnas esines muutunud värvimismuster (joonis 6) ebakorrapäraste laikudega. Sarnased värvimismustrid saadi knockout mutantsete seente puhul, milles kustutatud geenidel oli roll rakuseina organiseerimisel; selle tulemusena ilmnesid mutantidel defektsed rakuseinad ja ebaregulaarne värvumine 25, 46, 47. Siiski täheldati 36 kraadiga töödeldud P. ostreatus P89 ebanormaalset värvimist Calcofluor White'iga; kõrgel temperatuuril muutunud kitiini jaotus ja rakuseina terviklikkus48. Need andmed näitavad, et P. digitatum hyphae'l, mis puutub kokku kaaskultuuri käigus hajutatud metaboliitidega, on defektne rakusein, kuna Kongo punane seondub seente rakuseina struktuuridega. Seene rakusein on antimikroobikumide atraktiivne sihtmärk, kuna neid ei esine imetajarakkudes 49, 50. Kokkuvõttes kinnitavad mikroskoopiaanalüüs ja seenevastased testid, et seente koostoimes osalevatel metaboliitidel on potentsiaalseenevastaneSee võib olla mehhanism, mille need fütopatogeenid on loonud, et konkureerida teiste mikroorganismidega peremeesorganismi pärast (joonis 7).

Järeldused

Uute looduslike antimikroobikumide otsimine on paljulubav valdkond loodustoodete uurimisel, mis käsitleb koristusjärgsete haiguste majanduslikku mõju kogu maailma põllumajandusele. Veelgi enam, fungitsiidide suhtes resistentsete seenetüvede ilmumine muudab uute avastamiseseenevastanesünteetilisi ühendeid asendavad ained äärmiselt olulised. Kasutades sama peremehe, P. digitatum'i ja P. citrinum'i pärast konkureerivate fütopatogeenide kokultiveerimist, täheldasime seente koostoimet. MSI tehnika abil tuvastasime sekundaarsed metaboliidid, mis olid defundeeritud mikroorganismide vahelise liidese tsooni. Trüptokvialaniinid, tsitrinadiinid, kürsogenamiid A ja tetrapeptiidid avaldasid suurt seenevastast toimet, kinnitades, et kaaskultuurid ja MSI tehnika on hea kombinatsioon uute looduslike antimikroobsete ainete otsimisel.

Kuni selle kuupäevani ei ole olnud teavet tsitruseliste patogeensete seente koostoime kohta. Meie andmed näitasid ühendeid, mis mängivad rolli tsitrusviljade mikroobide ökoloogias. Lisaks näitasime, et uuritud metaboliitidel on suur potentsiaalseenevastaneained, kuna seente rakuseinad on üks peamisi sihtmärkeseenevastaneühendid. Tuvastatud ühendite kasutamist looduslike seenevastaste ainetena sünteetiliste fungitsiidide asemel tuleks täiendavalt uurida. See artikkel avab uusi uurimisvõimalusi ning aitab kaasa keskkonna ja inimeste tervisele, aidates looduslikest allikatest saadud ühendite kasutamise kaudu otsida põllumajanduse jaoks ohutumaid strateegiaid.

KASUCISTANHE LISAND: PARANDAGE IMmuunsust