1. OSA Cistanche Tubulosa ekstrakti antidepressantidega sarnane toime kroonilisele ettearvamatule stressile rottidel soolestiku mikrobiota homöostaasi taastamise kaudu

Üha rohkem tõendeid näitab, et neuropsühhiaatrilised häired, nagu depressioon, on soolestiku mikrobioomiga seotud soolestiku-aju telje kaudu.Cistanches Herbaon hästi tuntud "neeru-yangi" puudulikkuse raviks traditsioonilises hiina meditsiinis (TCM) ja seda on viimastel aastatel kasutatud neurodegeneratiivsete haiguste raviks. Selles uuringus loodi kroonilise ettearvamatu stressi (CUS) põhjustatud depressiooni mudel, et uuridaCistanche tubulosaekstrakt (CTE) käitumistestide, monoamiini neurotransmitterite ja neurotroofsete tegurite kohta hipokampuses ja käärsooles, soolestiku mikrobiota koostis ja lühikese ahelaga rasvhapete (SCFA) tootmine. Lisaks kasutati korrelatsioonianalüüsi, et hinnata funktsionaalset seost muutunud soolestiku mikrobiota, muutunud neurotransmitterite ja neurotrofiinide vahel hipokampuses ja käärsooles ning SCFA-de häiritud kontsentratsiooni vahel. CTE parandas oluliselt CUS-i all olevate rottide depressioonitaolist käitumist. CTE-ga taastati aju 5-hüdroksütrüptamiini (5-HT) ja ajust pärineva neurotroofse faktori (BDNF) ekspressiooni tase CUS-rottidel. Soolestiku mikrobiota suhtelist arvukust ning atsetaadi ja heksaanhappe kontsentratsioone saab samuti moduleerida CTE-raviga. Lisaks näitasime, et CTE kasutamine CUS-rottidel tõi kaasa tugeva korrelatsiooni häiritud soolestiku mikrobiota koostise, hipokampuse neurotransmitterite taseme ja neuroaktiivsete metaboliitide SCFA-de tootmise vahel. Kokkuvõttes näitavad need tulemused CTE-d kui potentsiaalset depressiivsete sümptomite ravi, taastades soolestiku mikrobiota homöostaasi mikrobiota-soolestiku-aju telje häirete korral, avades uusi võimalusi neuropsühhofarmakoloogia valdkonnas.

Märksõnad: Cistanche tubulosa, antidepressant, krooniline ettearvamatu stress, soolestiku mikrobioota, mikrobioota-soolestiku-aju telg

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

SISSEJUHATUS

Cistanches Herba(hiina keeles Rou Cong-Rong) on ​​ametlikult registreeritud kui kuivatatud mahlakad varredCistanche deserticola(YC Ma) jaCistanche tubulosa(Schrenk) Hiina farmakopöa komisjonis (2015). See on tuntud traditsiooniline hiina meditsiin (TCM) neerupuudulikkuse, impotentsuse, naiste viljatuse, haigusliku leukorröa, rohke metrorraagia,

ehhinakosiidin cistanche võib soodustadahaavade paranemist

ja seniilne kõhukinnisus (Hiina farmakopöa komisjon, 2015). Varasemad uuringud on näidanud mitmeid peamisi keemilisi koostisosiCistanches Herba, sealhulgas fenüületanoidglükosiidid (PhG-d), iridoidid ja iridoidglükosiidid, lignaanid, alditoolid, oligosahhariidid ja polüsahhariidid. Farmakoloogiline analüüs on näidanud, et Cistanches Herbal on lai valik neuroprotektiivseid, immunomoduleerivaid, põletikuvastaseid ja hepatoprotektiivseid toimeid (Jiang ja Tu, 2009; Fu et al., 2017). PhG-sid on peetud Cistanches Herba peamisteks aktiivseteks komponentideks, millel on mitmesugused farmakoloogilised toimed, nagu neuroprotektiivne, immunomoduleeriv, põletikuvastane, hepatoprotektiivne, antioksüdatiivne jne (Jiang ja Tu, 2009; Fu et al., 2017). Cistanches Herba salvestati algselt ravimtaimede klassikasse (hiina keeles "Shennong Bencao Jing"), mis on tuntud ravimtaimede raamatus, mis on kirjutatud umbes aastatel 200–250 pKr. ) pinged ja seitse (ülesöömine, viha, niiskus, külm, mure, tuul ja vihm ning hirm) kahjustusi" (Huang, 1982). Tänapäeval on Cistanches Herba laialdaselt tunnustatud kui taimne toonik üldise nõrkuse korral (Fu et al., 2017).C. tubulosaglükosiidikapslid (Memoregain®) on kasutusel Alzheimeri tõve raviks (Guo et al., 2013). Düsfunktsionaalne dopamiinergiline süsteem on depressiooni monoamiini hüpoteesi üks peamisi patogeneesi (Duman et al., 1997; Krishnan ja Nestler, 2008). On leitud, et ehhinakosiid (üks PhG-dest) ja Cistanche salsa PhG-d kaitsevad dopamiinergilisi neuroneid dopamiini (DA) neurotoksilisuse eest, mida põhjustab 1-metüül-4-fenüül-1,2,3,{ {8}}tetrahüdropüridiin (MPTP), mis võib suurendada DA taset C57 hiirte juttkehas (Tian ja Pu, 2005; Geng et al., 2007). Lisaks on katalpol ja geniposiid Cistanches Herbas kaks tüüpilist iridoidi ning on leitud, et need leevendavad kroonilist ettearvamatust stressist (CUS) põhjustatud depressioonitaolist käitumist, taastades hüpotalamuse-hüpofüüsi-neerupealise (HPA) telje düsfunktsioonid ja katalpol võib aju- tuletatud neurotroofse faktori (BDNF) ekspressioon (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). Lisaks annab viimane väljaanne värskeid tõendeid selle kohta, et Cistanches Herba keetmine vähendas märkimisväärselt liikumatusperioodi hiire saba riputamise testis, mis viitab tugevalt sellele, et Cistanches Herbal on potentsiaalsed antidepressandilaadsed omadused (WangD. et al., 2017).

Traditsiooniline hiina meditsiin tõmbab depressiooniravina üha enam tähelepanu selle suhteliselt mõõdukate kõrvalmõjude tõttu (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). Erinevat tüüpi TCM-id, näiteks üksikud ühendid toorravimitest (ginsenosiid Rb1, ginsenosiid Rg3 ja Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang GL et al., 2017 ), üksikud Hiina meditsiinilised materjalid (Panaxi ženšenni juur, Acorus tatarinowii risoom ja Morinda Officinalis) (Dang et al., 2009; Han jt, 2013; Xu jt, 2016) ja TCM-i keetmised (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan ja Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su jt, 2011; Su et al., 2014; Yan jt, 2016) on põhjalikult uuritud ja näidatud depressioonitaoliste sümptomite ümberpööramiseks või leevendamiseks. Näiteks leiti, et Kai-Xin-San leevendab märkimisväärselt CUS-i indutseeritud depressiivsete rottide sümptomeid, suurendades neurotransmitterite, neurotroofsete tegurite ja neile vastavate retseptorite arvu ning soodustades sünaptotagmiini ekspressiooni ja dendriitset lülisamba tihedust (Yan et al. , 2016).

Sellegipoolest tuginevad varasemad TCM-i uuringud depressantide sarnaste käitumistestide tulemustele ja keskenduvad tavapärasele farmakoloogilisele toimemehhanismile. Suukaudselt manustatud TCM-i antidepressandi efektiivsuse ja soolestiku mikrobiota seost ei mõisteta hästi. Kasvavad tõendid kinnitavad, et soolestiku mikrobiota mängib otsustavat rolli ajufunktsioonide, eriti depressiooni ja muude stressiga seotud häirete reguleerimisel (Foster ja Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). Näiteks põhjustab krooniline stress roti soolestiku mikroobide struktuuri düsregulatsiooni, millega kaasneb Firmicutes / Bacteroidetes'i suhte vähenemine ja täpsemalt Lactobacilluse suhtelise arvukuse vähenemine ja Oscillibacter'i suurenemine (Meng et al., 2017). Lisaks andis düsreguleeritud mikrobiota väljaheite siirdamine depressiooniga patsientidelt mikroobivabadele hiirtele nendele loomadele depressioonitaolise fenotüübi, mis näitab, et düsreguleeritud soolestiku mikrobiota põhjustab depressiooni ja ärevuse käitumuslikke ja füsioloogilisi sümptomeid (Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016). Loomkatsetes leiti, et mõned mikrobiota modulaatorid, nagu probiootikumid ja prebiootikumid, parandavad kroonilise stressi all kannatavate hiirte depressioonitaolist käitumist, parandades soolestiku mikrobiootat (Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017). ).

Arvestades seost soolestiku mikrobiota ja haiguste arengu vahel ning soolestiku mikrobiota struktuuri plastilisust, otsustasime uurida soolestiku mikrobiota mõju depressiooni vahendamisel, mis köitis meie tähelepanu ja seda uuriti (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). Selle saavutamiseks viidi soolestiku mikrobiota koostise analüüsimiseks läbi 16S rRNA geenide sekveneerimise kombineeritud metastatistika analüüs (White et al., 2009). Käesolevas uuringusC. tubulosavaliti selle antidepressandilaadse toime hindamiseks, kuna sellel on kõrgem PhG-de tase võrreldesC. deserticola. Selle mõju uurimiseks loodi roti CUS-i põhjustatud depressiooni mudelC. tubulosa ekstrakt(CTE, mis koosneb 48,6 protsendist PhG-dest, 6,9 protsendist iridoidglükosiididest ja 20,0 protsendist üldsahhariididest) käitumistestide, monoamiini neurotransmitterite ja neurotroofsete tegurite kohta hipokampuses ja käärsooles, soolestiku mikrobiota koostis ja lühikese ahelaga rasvhapete (SCFA) tootmine. Veelgi enam, funktsionaalne seos muutunud soolestiku mikrobiota vahel muutis neurotransmittereid ja neurotrofiine nii hipokampuses kui ka käärsooles ning uuriti SCFA-de häiritud kontsentratsiooni. Korrelatsioonianalüüsi kasutati tõendite tõendamiseks, et CTE on suunatud soolestiku mikrobiotile depressiooni raviks, moduleerides mikrobiota-soolestiku-aju telge.

MATERJALID JA MEETODID

Materjalid

Fluoksetiin (FLX) osteti ettevõttelt Aladdin Industrial Inc. (Shanghai, Hiina). 5-hüdroksütrüptamiini (5-HT), norepinefriini (NE) ja BDNF ELISA komplektid osteti ettevõttest Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Hiina). HPLC puhtusastmega atsetonitriil osteti firmalt Merck (Darmstadt, Saksamaa). Deioniseeritud vesi valmistati destilleeritud veest, kasutades Milli-Q veepuhastussüsteemi (Millipore, Bedford, MA, Ameerika Ühendriigid). Kõik muud kasutatud reaktiivid ja kemikaalid olid analüütiliselt puhtad.

Kuivatatud varredC. tubulosakoguti Hetiani maakonnast (Xinjiang, Hiina). Voucheri näidised kinnitas prof Xiaobo Li ja deponeeriti Shanghai Jiao Tongi ülikooli farmaatsiakooli herbaariumis (Shanghai, Hiina). Homogeenne pulbristatudC. tubulosavarred suspendeeriti kümnekordses 70-protsendilises etanoolis ja kuumutati püstjahutiga kolm korda, igaüks 1 tund 100 kraadi juures. Ekstraktid filtriti marli abil, aurustati vaakumis 65 kraadi juures ja lüofiliseeriti. Proov lahustati uuesti ja eraldati seejärel makropoorse vaiguga D101. Pärast adsorptsiooni veega elueeritud fraktsioon visati ära. CTE saadi pärast elueerimist 40% etanooliga, seejärel aurustati vaakumis 65 kraadi juures ja lüofiliseeriti.

CTE keemilise koostise analüüs

PhG-de suhteline sisaldus CTE-s määrati UV-spektrofotomeetria abil 330 nm juures, kasutades standardina ehhinakosiidi. Iridoidide ja iridoidglükosiidide suhtelist sisaldust mõõdeti UV-spektrofotomeetria abil kahe lainepikkuse meetodil, et vältida PhG-de spektraalseid häireid (spektroskoopiliseks kvantifitseerimiseks kasutati 237 nm, võrdluslainepikkuseks kasutati isosbestilist punkti 280 nm), kasutati geniposiidi. kui standard. CTE kogu süsivesikute sisaldus määrati fenool-väävelhappe kolorimeetrilise meetodiga, kasutades standardina glükoosi (Chow ja Landhausser, 2004).

CTE peamisi keemilisi koostisosi iseloomustati UPLC-Q-TOF-MS abil. UPLC-Q-TOF-MS analüüs viidi läbi Waters ACQUITY UPLC süsteemiga (Waters Corp., Milford, MA, Ameerika Ühendriigid) kolonniga ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm x 2,1). mm id, 1,7 µm, Waters Corp., Ameerika Ühendriigid) gradientelueerimise teel, kasutades 0,1 protsenti sipelghappe atsetonitriili (A) ja 0,1 protsenti sipelghapet vees (B) temperatuuril voolukiirus 0,4 ml/min. Gradiendi profiil oli: 0-5 min (A: 5-20 protsenti), 5-7,5 min (A: 20-30 protsenti), 7.5-10 min ( A: 30-70 protsenti ), 10-11 min (A: 70-100 protsenti ) ja hoitud 1,5 minutit. Gradient taaskasutati 5 protsendini 0,5 minutiga ja hoiti järgmise jooksu jaoks 2,5 minutit. Süstimismaht oli 3 [il. Kolonnahju temperatuur seati 35 kraadini.

Massispektromeetria viidi läbi, kasutades Waters Vion IMS massispektromeetrit (Waters Corp., Milford, MA, Ameerika Ühendriigid). Ioniseerimine viidi läbi negatiivse elektropihustus (ESI) režiimis. MS parameetrid olid järgmised: kapillaarpinge, 2.0 kV; koonuse pinge, 20 V; lähtetemperatuur, 120 kraadi ; desolvatsioonitemperatuur, 500 kraadi ; koonuse ja desolvatatsiooni gaasivoolud, vastavalt 50 ja 1, 000 L/h. Massi täpseks mõõtmiseks kasutati [MH]-iooni (m/z 554,2615) tekitamiseks lukumassina leutsiini-enkefaliini. MSE (mass SpectrometryElevatedEnergy) katse kahe skaneerimisfunktsiooniga viidi läbi järgmiselt: funktsioon 1 (madal energia): m/z 50-1, 000, 0,25 s skaneerimisaeg, 0,02 s skaneerimise vaheline viivitus , 6 eV kokkupõrkeenergia; funktsioon 2 (suur energia): m/z 50-1, 000, 0,25 s skaneerimisaeg, 0,02 s skaneerimisevaheline viivitus, kokkupõrke energia ramp 20-45 eV. Andmeid töödeldi UNIFI 1.8.1 tarkvara abil (Waters Corp., Milford, MA, Ameerika Ühendriigid).

cistanchesaabparandada neerufunktsiooni

Loomkatsed

Isased Sprague-Dawley rotid (200 土 20 g) hangiti ettevõttest Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, Hiina) ja majutati Shanghai Jiao Tongi ülikooli laboriloomade keskuses (Shanghai, Hiina). Loomi hoiti rühmades kontrollitud toatemperatuuril (25 °C 2 °C, suhteline õhuniiskus 55 °C 10 protsenti) valguse-pimeduse tsükliga 12:12 h. Rottidele võimaldati ühe nädala jooksul vaba juurdepääs tavalisele laborirottide toidule ja veele. Loomade rajatised ja protokollid kiitis heaks Shanghai Jiao Tongi ülikooli (Shanghai, Hiina) loomaeetika komitee.

Pärast 1-nädalast aklimatiseerumist tehti 40 naiivsele rotile 72-tunnine sahharoositreening ja sahharoosi algtaseme testimine. Rotid jagati sahharoosi algtaseme testis nende sahharoosieelistuse alusel viide rühma (n=8) (täiendav joonis S1). Kontrollrühmale ja CUS-rühmale anti soolalahust (10 ml/kg). Ülejäänud kolme rühma puhul CTE suure annusega (CTEH) (400 mg/kg), väikese annusega (CTEL) (200 mg/kg) ja FLX (10 mg/kg) manustati intragastraalselt 1 tund enne CUS-protseduuri (kell 8.00 kuni 9.00) 4 nädala jooksul.

Krooniline ettearvamatu stress töötati välja nagu eelnevalt kirjeldatud (Willner, 1997; Xue et al., 2013), välja arvatud stressivaba kontrollrühma puhul, rakendati rottidele mitmeid stressoreid: üleöö madala intensiivsusega stroboskoopiline valgustus (120 välku / min), valge müra (100 dB) 1 h, veepuudus 24 h, tühjad veepudelid 1 h (pärast veepuudust), toidupuudus 24 h, sundujumine (5 min), füüsiline ohjeldamine ({{11) }} h), määrdunud puur 24 h (200 ml vett 100 g saepuru allapanus), saba pigistamine (1 min), 45 kraadi puuri kalle 24 h, šokk 30 min ja üleöö valgustus (12 h). Stressoreid rakendati pidevalt ja juhuslikult 4 nädala jooksul, mille üksikasju on kirjeldatud täiendavas tabelis S1. Toit ja vesi olid vabalt kättesaadavad kontroll-stressivabadele rottidele, kes jäid segamatult teise ruumi, välja arvatud 14-tunnine ilmajäämise periood enne igat sahharoositesti. Üks rott suri CUS-i protseduuri ajal. Pärast seda tehti sunnitud ujumise test (FST).

4 päeva akuutset manustamist ja pärast 28 päeva stressi viidi läbi sahharoosi eelistuse test (SPT) (29. päev), avatud väli test (OFT) (31. päev) ja uudsuse allasurutud söötmise test (NSFT) (33. päev). CUS-i ja käitumistestide kavandi ülevaade on näidatud lisajoonisel S2.

Sundujumise test viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (Porsolt et al., 1978). Protseduur koosnes eeltestist ja katseseanssidest, kasutades samu seadmeid ja tingimusi (läbimõõt 20 cm, kõrgus 45 cm, sisaldades 25 cm vett, mida hoiti 26 kraadi juures). Testieelse seansi ajal sunniti rotte ujuma 15 minutit; 24 tundi hiljem paigutati rotid 5-minutiliseks ujumistestiks samasse seadmesse. Ujumiskäitumine sees

5 min jälgiti videokaameraga ning mõõdeti ja analüüsiti liikumatuse kestust.

SPT puhul treeniti rotte kõigepealt 72 tundi enne SPT-d tarbima 1% (maht/maht) sahharoosilahust. Sahharoosi algtaseme test enne CUS-protseduuri ja SPT CUS-i lõpus viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (Xue et al., 2013).

Avatud väli test viidi läbi CUS-protseduuri lõpus, aparaat ja meetod olid samad, mis eelnevalt üksikasjalikult kirjeldatud (Xue et al., 2013). Kogu läbitud vahemaa salvestamiseks kasutati videojälgimissüsteemi (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.).

Uudsuse allasurutud toitumistesti hinnati vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Xue et al., 2013) ning 5 minuti jooksul söömise alustamise latentsus registreeriti ja analüüsiti.

Neurotransmitterite ja neurotroofsete tegurite mõõtmine

Pärast käitumisteste saadi igalt rotilt vähemalt neli väljaheite graanulit, mis pandi steriilsetesse koonilistesse katsutitesse ja külmutati kohe temperatuuril -80 °C mikroobikoosluse ja SCFA-de analüüsimiseks. Pärast seda ohverdati rotid; hipokampus ja käärsool eraldati ja kaaluti kohe. Koeproovid pesti soolalahusega, külmutati vedelas lämmastikus ja hoiti säilitamiseks temperatuuril -80 °C. Pärast järjestikust sulatamist temperatuuril –20 °C ja 4 °C homogeniseeriti koeproovid soolalahuses ja tsentrifuugiti 25 minutit kiirusel 2500 p/min/4OC. Saadud supernatant koguti ja säilitati kasutamiseni temperatuuril 4 °C. 5-HT tasemed hipokampuses ja käärsooles, NE tasemed hipokampuses ja BDNF tasemed hipokampuses määrati kaubanduslike ELISA komplektidega vastavalt tootja protokollidele (Hou et al., 2017).

Soolestiku mikrobiota koostisprofiili analüüs

Soolestiku mikrobiota kogu DNA väljaheiteproovidest ekstraheeriti vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Wei et al., 20{{20}}4). Iga roojaproov (0,2 g) segati 1 ml PBS-s ja homogeniseeriti kaks korda täielikult, seejärel tsentrifuugiti 200 g juures 6 minutit. Supernatandile lisati 20 x 20% PVP-d ja tsentrifuugiti 300 g juures 6 minutit. Saadud supernatanti tsentrifuugiti seejärel 12,{11}} g juures 6 minutit ja rakusademed koguti. Rakupelleteid pesti PBS-ga ja seejärel resuspendeeriti 300 lüsaadis I (150 mM NaCl, 100 mM EDTA・Na2・2H2, pH 8,0). Suspensioon segati 100 µl lüsosüümi lahuse (100 mg/ml) ja 20 µl 1 protsendi RNaasiga, 37°C soojas vannis 30 minutit, seejärel lisati 300 µl lüsaati II (100 mM NaCl, 500 mM Tris.0 alust). . Rakususpensioon segati õrnalt 50 x 20% SDS-ga ja vannitati jäävannis 5 minutit. Seejärel puhastati DNA järjestikuse ekstraheerimisega 1% PVP-ga, Tris-tasakaalustatud fenooli ja kloroform-isoamüülalkoholiga (maht/maht/maht/maht, 3,125:25:24:1) ja kloroform-isoamüülalkohol (maht/maht, 24). :1), millele järgneb sadestamine temperatuuril -20 °C 2 tundi kahe mahu etanooli ja 50 [il 3 M NaAc-ga. DNA koguti tsentrifuugimisega, kuivatati õhu käes ja lahustati 100 ui steriilses deioniseeritud vees. Nukleiinhappe puhtust testiti spektrofotomeetriga NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Ameerika Ühendriigid). Seejärel amplifitseeriti kogu genoomset DNA-d PCR-iga, kasutades praimereid, mis on spetsiifilised 16S rRNA geeni V3-V4 piirkondadele: päripraimer 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') ja pöördpraimer 806R (5). „-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3”). PCR amplikonid puhastati Agencourt AMPure bead'idega (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, Ameerika Ühendriigid) ja kvantifitseeriti, kasutades PicoGreen dsDNA analüüsikomplekti (Invitrogen, Carlsbad, CA, Ameerika Ühendriigid). Pärast individuaalset kvantifitseerimisetappi ühendati amplikonid võrdsetes kogustes ja paariotsa 2 x 300 bp sekveneerimine viidi läbi Illumina MiSeq platvormi ja MiSeq Reagent Kit v3 abil ettevõttes Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, Hiina). Paarisotsa lugemised koostati FLASH-tarkvara (versioon 1.2.7) abil, töötlemata järjestuste lugemist kärbiti QIIME tarkvara abil (versioon 1.8.0), et eemaldada sobimatud vöötkoodid ja jadad, mis jäid alla pikkuse läve. Seejärel rühmitati filtreeritud järjestused operatiivseteks taksonoomilisteks üksusteks (OTU), mille järjestuse sarnasus oli 97%, kasutades QIIME-d koos UCLUSTiga. Beeta mitmekesisus viidi läbi QIIME abil kaalutud UniFraci põhikoordinaatide analüüsi (PCoA) jaoks. Lõpuks kasutati Meta statistika tarkvara, et võrrelda soolestiku mikroobide taksonoomilise koostise erinevusi erinevate rühmade vahel.

SCFA-de kontsentratsiooni analüüs

SCFA-de (sealhulgas atsetaat, propionaat, butüraat, isobutüraat, palderjanhape, isovaleriinhape ja heksaanhape) kontsentratsioon roti väljaheiteproovides määrati GC{{0}} gaasikromatograafiga (Shimadzu, Jaapan), mis oli paigaldatud. DB-FFAP kolonniga (30 mx 0,25 mm x {{10}},25 cm, Agilent, Ameerika Ühendriigid). Atsetaadi, propionaadi, butüraadi, isobutüraadi, palderjanhappe, isovaleriinhappe ja heksaanhappe standardlahused valmistati 1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0,01 ja 0,005 mg/ml eetriga (sh sisestandardina 2- metüülpalderiinhape 0,1 mg/ml). Iga väljaheiteproov (0,2 g) segati 0,8 ml deioniseeritud vees keerise segamise ja tsentrifuugimise teel 5, 000 pööret minutis 20 minutit temperatuuril 4 °C, 450 ui supernatanti lisati 50 l 50% H2SO4 ja 500 l sisestandardit. lahust, segades vorteksiga 1 minut ja tsentrifuugiti kiirusel 12, 000 p/min 10 minutit, seejärel asetati segu 30 minutiks 4 °C-sse. Supernatant võeti GC analüüsiks. SCFA-de analüüs viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (Wang et al., 2016).

Statistiline analüüs

Kõik andmed esitati keskmisena 土 SEM. Statistiline analüüs viidi läbi tarkvara SPSS 21.{1}} abil (SPSS Inc., Chicago, IL, Ameerika Ühendriigid) ühesuunalise ANOVA-ga, millele järgnes Dunnetti test või Studenti t-test. Andmed jäeti analüüsidest välja, kui need olid keskmisest suuremad kui kaks standardhälvet. Väärtusi p < 0,05="" peeti="" statistiliselt="" olulisteks.="" pearsoni="" korrelatsioonianalüüsi="" kasutati,="" et="" hinnata="" seost="" soolestiku="" mikrobiota,="" scfa-de,="" hipokampuse="" 5-ht,="" ne="" ja="" bdnf="" tasemete="" ning="" käärsoole="" 5-ht="" suhtelise="" arvukuse="">

TULEMUSED

CTE keemilise koostise analüüs

Esmalt analüüsiti põhjalikult CTE keemilist koostist. Nagu on näidatud tabelis 1, olid PhG-d CTE põhikomponendiks suhtelise sisaldusega 48,6 protsenti, iridoidide ja iridoidglükosiidide sisaldus 6,9 protsenti ning sahhariidide üldsisaldus 20,0 protsenti. Need

Seejärel iseloomustati CTE komponente UPLC-Q-TOF-MS abil. Kokku tuvastati ja identifitseeriti 27 koostisainet, sealhulgas 20 PhG-de komponenti, viis iridoidi ja iridoidglükosiidi ning kaks oligosahhariidi. Üksikasjalik teave, sealhulgas retentsiooniaeg, täpne MS ja MS / MS fragmentioonid, on loetletud tugiteabes (täiendav tabel S2). CTE UPLC-Q-TOF-MS koguioonkromatogramm (TIC) on näidatud lisajoonisel S3.

CTE parandas CUS-rottide depressiivset käitumist

CUS-rottidel vähendas CTE-ravi märkimisväärselt kogu liikumatusaeg FST-s ja söömise latentsus NSFT-s ning sahharoosi eelistus SPT-s ja OFT-s läbitud kogukaugus suurenes.

Joonis 1A illustreerib CTE ägedat mõju liikumatuse ajale FST-s CUS-rottidel. Võrreldes CUS-i mudelirühmaga vähendas CTE äge suukaudne manustamine 3- päeva jooksul oluliselt kogu liikumatusaega FST-s [ühesuunaline ANOVA, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. Edasine posthoc analüüs näitas, et manustamine

TABEL 1|keemiline koostisC. tubulosaCTE ekstrakt.suure doosi rühmaga (Dunnetti test, p < {{0}},05) ja väikese annuse rühmaga (Dunnetti test, p < 0,05) näitas FST kogu liikumatusaja märkimisväärset vähenemist .

CTE mõju sahharoosi eelistusele SPT-s CUS-rottidel on näidatud joonisel 1B. 28 päeva kestnud stressiprotseduur põhjustas sahharoosi eelistuse olulise vähenemise CUS-i mudelrühmas võrreldes stressivaba kontrollrottidega [ühesuunaline ANOVA, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{10}}09; Dunnetti test, p < 0,05],="" mis="" näitab,="" et="" cus-mudel="" töötati="" edukalt="" välja.="" positiivse="" kontrollina="" suurendas="" flx="" rühm="" märkimisväärselt="" sahharoosi="" eelistust="" cus-rottidel="" [ühesuunaline="" anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" dunnetti="" test,="" p="">< 0,05],="" mis="" näitab="" cus-mudeli="" ennustavat="" kehtivust.="" cte="" krooniline="" suukaudne="" manustamine="" suurte="" annuste="" rühmas="" näitas="" peamist="" mõju="" sahharoosi="" eelistustele="" [ühesuunaline="" anova,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" dunnetti="" test,="" p="">< 0,01],="" mis="" taastas="" selle="" cus-rottidel="" normaalsele="" tasemele.="" väikese="" annuse="" rühmas="" esines="" cte="" kasvutendentsi,="" kuid="" mõju="" ei="" olnud="" statistiliselt="" oluline="" (dunnetti="" test,="" p="">

Nagu on näidatud joonisel 1C, kasutati OFT-ga läbitud kogukaugust ka CTE mõju hindamiseks CUS-rottidele. Võrreldes stressivabade rottidega oli CUS-i mudelirühmal palju lühem kogukaugus [ühesuunaline ANOVA, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}01; Dunnetti test, p < 0,001]="" pärast="" 4-nädalast="" kokkupuudet="" cus-ga="" ja="" positiivse="" kontrolli="" flx-ravi="" suurendasid="" cus-rottide="" kogukaugust="" [ühesuunaline="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" dunnetti="" test,="" p="">< 0,05].="" cte="" igapäevane="" suukaudne="" manustamine="" suurte="" ja="" väikeste="" annustega="" näitas="" cus-rottide="" kogukaugusele="" ilmset="" mõju="" [ühesuunaline="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" dunnetti="" test,="" p="">< 0,01="" kõrge="" annuse="" rühmas,="" p="">< 0,001="" vastavalt="" väikese="" annuse="" rühmas].="" täiendav="" joonis="" s4="" näitab="" aktiivsusraja="" kaarti="">

Joonisel 1D on näidatud CTE mõju NSFT-s söömise latentsusele CUS-rottidel. Kakskümmend kaheksa päeva kestnud stressiprotseduur põhjustas CUS-i mudelrühmas söömise alustamise latentsusaja märkimisväärse suurenemise võrreldes stressivaba kontrollrottidega [ühesuunaline ANOVA, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{10}}19; Dunnetti test, p < 0,05],="" mis="" näitab,="" et="" cus-mudel="" töötati="" edukalt="" välja.="" cte="" pikaajaline="" suukaudne="" manustamine="" suure="" annusega="" näitas="" ilmset="" mõju="" söömise="" alustamise="" latentsusele="" võrreldes="" cus-rühmaga="" (studendi="" t-test,="" t="2.759," p="">< 0,05),="" samas="" kui="" cte="" väike="" annus="" näitas="" ei="" mingit="">

CTE taastas CUS-rottide neurotransmitterite ja neurotroofsete tegurite taseme

CTE mõju {{{{10}}}}HT ja NE tasemele CUS-rottide hipokampuses on näidatud joonistel 2A, 2B. Neljanädalane stressiprotseduur põhjustas 5-HT olulise vähenemise [ühesuunaline ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0{{39 }}01; Dunnetti test, p < 0.001]="" ja="" ne="" [ühesuunaline="" anova,="" f(4,34)="6.376," p="0.0006;" dunnetti="" test,="" p="">< 0,001]="" kontsentratsioon="" cus-rottide="" hipokampuses="" võrreldes="" kontrollrühma="" omaga,="" ja="" antidepressant="" flx="" taastasid="" oluliselt="" 5-ht="" tasemed="" hipokampuses="" [ühesuunaline="" anova,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001;" dunnetti="" test,="" p="">< 0,001].="" pärast="" cte="" suukaudset="" manustamist="" suurte="" annuste="" rühmas="" täheldati="" 5-ht="" taseme="" olulist="" tõusu="" [ühesuunaline="" anova,="" f(4,34)="17.13," p="0.0001" ;="" dunnetti="" test,="" p="">< 0,001],="" samas="" kui="" ne="" kontsentratsioone="" ei="" muudetud.="" samamoodi="" vähenes="" bdnf-i="" ekspressioon="" oluliselt="" cus-mudeli="" rühmas="" võrreldes="" stressivabade="" rottidega="" (student'i="" t-test,="" t="4.171," p="">< 0,01)="" (joonis="" 2c).="" nii="" cte="" pikaajaline="" suukaudne="" manustamine="" suure="" annusega="" (õpilase="" t-test,="" t="2.548," p="">< 0,05)="" kui="" ka="" flx="" (õpilase="" t-test,="" t="2.263," p="">< 0,05)="" )="" suurendas="" bdnf-i="" ekspressiooni="" võrreldes="" cus-i="" mudelirühmaga.="" väikese="" annusega="" cte="" ei="" avaldanud="" olulist="" mõju="" bdnf="">

{{0}}HT tase CUS-rottide käärsooles erines hipokampuse tasemest ja 4-nädalane stressiprotseduur ei mõjutanud käärsoole 5-HT-d (joonis 2D ). Vastupidi, CTE suukaudne manustamine suure annusega stimuleeris 5-HT taset käärsooles võrreldes CUS-i mudelirühmaga (õpilase t-test, t=2.173, p < 0,05).="" madala="" annusega="" cte="" ei="" avaldanud="" mõju="" käärsoole="" 5-ht="">

CTE reguleeris CUS-rottide soolestiku mikroobide koostist

CTE mõju CUS-rottide soolestiku mikroobide koostisele hinnati 16S rRNA geenide sekveneerimisel põhineva meetodiga. Leiti, et 28-päevane CTE suukaudne manustamine muutis CUS-rottide soolestiku mikroobide koostist ja mõjutas erinevaid

mikroobide taksonoomilised tasemed rotirühmade hulgas (1. klassi tase, 1. järgu tase, 1. perekonna tase, 8. perekonna tase ja 2. liigitase). See viitab sellele, et soolestiku mikroobide kogukond võib mängida rolli CTE depressioonivastases toimes. Üksikasjalik teave oluliselt muutunud soolestiku mikroobide taksonite kohta erinevatel taksonoomilistel tasemetel on näidatud tabelis 2.

MiSeqi sekveneerimine andis pärast kvaliteedikontrolli, müra vähendamise ja kimääri eemaldamise protsessi kokku 2 132 980 töötlemata lugemist. Järgmisena koondati lugemised OTU-desse, mis määrati taksonitele varjupaigast liigi tasemele. Beeta mitmekesisuse analüüsi uuring viidi läbi, et uurida viie rotirühma bakterikoosluste mustrite sarnasust. PCoA, mis põhineb soolestiku mikrobiota kaalutud UniFrac-i kaugustel viies uuringurühmas, on näidatud joonisel 3A. PCoA beeta mitmekesisuse analüüs näitas mikroobide kogukonna selget eraldumist kontrollrühmast ja CUS-i mudelrühmast, samas kui suure annuse rühmaga CTE oli CUS-rühmaga võrreldes kontrollrühmale lähemal.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 protsenti. Nagu on näidatud lisajoonistel S5A, B, põhjustas 4-nädalane stressiprotseduur CUS-i mudelirühmas kontrollrühmaga võrreldes ebaolulise suundumuse Firmicutes'i taseme tõusule ja Bacteroidetes'i ebaolulisele vähenemisele. Pärast CTE igapäevast manustamist suurte ja väikeste annustega taastus Firmicutes'i ja Bacteroidetes'i suhteline arvukus kontrollrühma sarnasele tasemele, kuigi see ei olnud statistiliselt oluline. Ja kuigi rotirühmades täheldati Firmicutes / Bacteroidetes'i suhte osas sarnaseid muutusi, ei näidatud statistilisi erinevusi (täiendav joonis S5C). CUS-i mudelrühmas leiti mitteoluline suundumus phyla Cyanobacteria taseme langusele võrreldes stressivaba kontrollrottidega; arvestades, et CTE manustamine suure annusega suurendas oluliselt tsüanobakterite suhtelist arvukust võrreldes CUS-rühmaga (täiendav joonis S5D).

Perekonna tasandil olid Bacteroides ja Ruminococcus kaks kõige rikkalikumat mikroobset taksonit, mille suhteline arvukus oli kõigis viies rotirühmas ligikaudu 30 protsenti. Neljanädalane stressiprotseduur põhjustas Bacteroides'i suhtelise arvukuse olulise vähenemise ja Ruminococcus'e märkimisväärse suurenemise CUS-mudeli rühmas võrreldes stressivaba kontrollrottidega (joonised 4A, B). CTE pikaajaline manustamine põhjustas Bacteroides'i arvukuse märkimisväärse suurenemise ja Ruminococcus'i märkimisväärse vähenemise võrreldes CUS-rottidega. Lisaks näitasid kuus perekonda Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus ja Brachybacterium statistiliselt olulisi erinevusi CUS-i mudelrühma ja kontrollrühma vahel (joonised 4C-H). Pärast 28-päevast CTE-ravi muutus ülalmainitud kuue perekonna suhteline arvukus vastavalt kontrollrühmaga sarnasele tasemele.

CUS-rottide rühmas tuvastati Deinococcus'e madal arvukus erinevatel taksonoomilistel tasemetel, sealhulgas klassi tasemel (Deinococci), järgu tasemel (Deinococcales), perekonna tasemel (Deinococcaceae) ja perekonna tasemel (Deinococcus), samas kui seda ei õnnestunud tuvastada kontrollrühmas. rühm ja manustamisrühmad (joonised 5A-D).

Liigi tasandil oli Weissella beninensis CUS-rühmas palju madalam kui kontrollrühmas ja pärast CTE suure annuse manustamist täheldati suhtelise arvukuse olulist suurenemist (joonis 5E). Vastupidi, CTE manustamine muutis CUS-rottidel täheldatud Brachybacterium konglomeraadi suhtelise arvukuse olulise suurenemise (joonis 5F).

CTE-moduleeritud SCFA-d CUS-rottides

SCFA-de kontsentratsioone (sealhulgas atsetaat, propionaat, butüraat, isobutüraat, palderjanhape, isovaleriinhape ja heksaanhape) roti väljaheiteproovides analüüsiti GC abil ja need on näidatud joonisel 6. Atsetaadi tasemed [ühesuunaline ANOVA, F( 4,32)=2.721, p=0.0467; Dunnetti test, p < 0.05]="" ja="" heksaanhape="" [ühesuunaline="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" dunnetti="" test,="" p="">< 0,05],="" suurenes="" oluliselt="" cus-i="" mudelrühma="" rottidel="" võrreldes="" kontrollrühmaga.="" pärast="" cte="" pikaajalist="" manustamist="" suurte="" annustega="" atsetaadi="" (student'i="" t-test,="" t="2.182," p="">< 0,05)="" ja="" heksaanhappega="" [ühesuunaline="" anova,="" f(4,30)="3" .028,="" p="0.0328;" dunnetti="" testis,="" p="">< 0,05]="" kontsentratsioonid="" olid="" cus-rühmaga="" võrreldes="" valdavalt="" vähenenud,="" mis="" näitab,="" et="" cte="" võib="" avaldada="" oma="" antidepressantset="" toimet="" korrastamata="" neuroaktiivsete="" metaboliitide="" scfa-de="" moduleerimise="" kaudu.="" cte="" manustamine="" väikese="" annuse="" rühmaga="" näitas="" langustendentsi,="" kuid="" ei="" avaldanud="" märkimisväärset="" mõju="" atsetaadi="" ja="" heksaanhappe="">

Soolestiku mikrobiota, neurotransmitterite ja neurotropiinide korrelatsioonianalüüs hipokampuses, 5-HT käärsooles ja SCFA-d

Et uurida soolestiku muutunud mikrobiota funktsionaalset seost perekonna tasemel, muutunud neurotransmitterite ja neurotrofiinide vahel hipokampuses ja käärsooles ning SCFA-de häirivat kontsentratsiooni, töötati välja Pearsoni korrelatsioonikoefitsiendid (Meng et al., 2017). Nendevahelised korrelatsioonid (r > 0.4 või r < -0.4,="" p="">< 0.05)="" on="" näidatud="" joonisel="" 7.="" koefitsiendid="" näitasid="" tugevat="" korrelatsiooni="" soolestiku="" mikrobiota="" muutunud="" koostise="" ja="" kontsentratsiooni="" vahel="" perekonna="" tasandil.="" seitset="" tüüpi="" scfa-d="" ja="" depressiooniga="" seotud="" monoamiini="" neurotransmitterid="" (5-ht="" ja="" ne).="" ruminococcus'e="" arvukus="" näitas="" olulist="" negatiivset="" korrelatsiooni="" 5-ht="" kontsentratsiooniga="" hipokampuses,="" mis="" tähendab,="" et="" cus-protseduur="" toob="" kaasa="" ruminococcus'e="" suhtelise="" arvukuse="" suurenemise="" ja="" 5-ht="" kontsentratsiooni="" vähenemise.="" pärast="" ravi="" cte-ga="" vähenes="" ruminococcus'e="" suhteline="" arvukus="" kontrollrühma="" tasemele="" ja="" 5-ht="" tase="" leiti="" olevat="" paranenud.="" lisaks="" oli="" bacteroides'i="" suhteline="" arvukus="" positiivses="" korrelatsioonis="" 5-ht="">

hipokampus ja on negatiivselt seotud butüraadi, isobutüraadi, palderjanhappe, isovaleriinhappe ja heksaanhappe kontsentratsiooniga; Parabacteroides'i arvukus näitas olulist positiivset korrelatsiooni 5-HT tasemega hipokampuses ja propionaadi kontsentratsiooniga, samas kui see näitas negatiivset korrelatsiooni isobutüraadi ja isovaleriinhappe kontsentratsiooniga; täheldati ka oluliselt positiivset seost Butyricimonase suhtelise arvukuse ja NE taseme vahel hipokampuses ning Deinococcus'e suhteline arvukus oli positiivses korrelatsioonis atsetaadi kontsentratsiooniga. See näitas, et CTE võib avaldada oma depressioonivastast toimet, muutes soolestiku mikrobiota koostist, häirides hipokampuse neurotransmitterite taset ja taastades neuroaktiivseid metaboliite SCFA-sid. Korrelatsioonianalüüsi üksikasjalikud andmed on näidatud täiendavas tabelis S3.

cistanchesaab ravidadiabeet

ARUTELU

CTE depressioonivastase toime ja selle kliiniliste eeliste tuvastamine

Selles uuringus hinnati CTE antidepressantset toimet CUS-rottidel, kinnitati in vivo mudelite (nt FST, SPT, OFT ja NSFT) efektiivsust ning antidepressiivset toimet.C. tubulosaCUS-rottidel, mida kasutatakse sageli neerupuudulikkuse, impotentsuse ja emaste viljatuse raviks TCM-is. Praegu on kõige sagedamini välja kirjutatud antidepressandid serotoniini ja norepinefriini tagasihaarde inhibiitor (SNRI) venlafaksiin, millele järgneb selektiivne serotoniini tagasihaarde inhibiitor (SSRI) FLX (Thase et al., 2001; Mcintyre, 2017). Siiski on näidatud, et neil antidepressantidel on tõsised kõrvaltoimed, sealhulgas südametoksilisus, vererõhk, seksuaalfunktsiooni häired ja unehäired (Ferguson, 2001; Jin et al., 2015). Kõigist antidepressantide klassidest on SSRI ja SNRI korrelatsioonis seksuaalse düsfunktsiooni kõrgeima esinemissagedusega (Montejogonzalez et al., 1997; Clayton jt, 2014). Erilist tähelepanu väärib üldine seksuaalse düsfunktsiooni esinemissagedus, mis on 59,1 protsenti (604/1022), kui võtta arvesse kõiki antidepressante tervikuna; ja ligikaudu 40 protsendil patsientidest on madal tolerantsus seksuaalse düsfunktsiooni suhtes, mistõttu on ravimi järgimine tõsiselt mõjutatud (Clayton, 2001). Arvestades praeguse depressiooniravi puudusi, näitab Cistanches Herba suurt potentsiaali kliiniliseks kasutamiseks mitte ainult tänu oma tugevale antidepressandile sarnasele toimele, vaid ka seetõttu, etCistanches Herbaon traditsiooniliselt kasutatud impotentsuse raviks, mis peaks kõrvaldama vähemalt ühe mure, mis on seotud teiste antidepressantide kõige levinumate kõrvalmõjudega (Fu et al., 2017). Lisaks ei ilmne Cistanches Herbal toksilisuse märke ega raviga seotud muutusi