Tõrva kõrbes kasvatatud põletikuvastased Iridoidid Cistanche Deserticola varredest

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

ABSTRAKTNE

Selleks, et määrata kindlaks keemilised koostisosadCistanche deserticolaTarimi kõrbes kultiveeritud süstemaatiliselt viidi läbi fütokeemiline uurimine. Koostisosad isoleeriti ränidioksiidigeeli, Sephadex LH-20, MCI geeli, ODS-kolonnikromatograafia ja poolpreparatiivse HPLC poolt. Nende struktuurid määrati kindlaks MS ja NMR spektroskoopsete analüüside põhjal, keemiliste meetoditega ja/või kirjanduse andmetega võrdlemisel. Isolaatide põletikuvastast toimet hinnati nende inhibeeriva toime tõttu lipopolüsahhariidi (LPS) indutseeritud lämmastikoksiidi (NO) tootmisele BV-2 hiire mikrogliiarakkudes. Üheksa iridoidi isoleeriti ja tuvastati kuicistanche desertosideA (1), tsistaniin (2), tsistakloriin (3), 6-desoksükatalpol (4), glurosiid (5), kankanosiid A (6), ajugol (7), bartsiosiid (8) ja 8-epi-logaanhape (9). Ühend 9 näitas no-tootmises tugevat inhibeerimist, mille IC50 väärtus oli 5,2 μmol· L−1, võrreldav positiivse kontrollkvertsetiiniga (4.3 μmol· L−1). Ühend 1 oli uus iridoid ja ühendid 5, 6 ja 8 eraldati sellest liigist esimest korda.

[VÕTMESÕNAD] Cistanche deserticola; Iridoidid; Struktuuri selgitamine; Põletikuvastane toime

Cistanche deserticola

Sissejuhatus

Tsistanches HerbaOrobanchaceae perekonda kuuluv (hiina keeles Roucongrong) levitatakse peamiselt Põhja-Aafrikas, Araabias ja Aasia riikides[1]. Tuntud toonikuna traditsioonilises hiina meditsiinis (TCM) onCistanchedeserticolajaCistanchetubulosaon Hiinas ja Jaapanis juba pikka aega kasutatud neerupuuduse, naiste viljatuse, morbiidse leucorröa, neurasteenia ja seniilse kõhukinnisuse raviks [2-3]. Varasemad fütokeemilised uuringud on

[Teadusuuringute rahastamine] Seda projekti toetasid rahaliselt Hiina Riiklik Loodusteaduste Sihtasutus (nr 81222051), Traditsioonilise Hiina meditsiini teadusuuringute projekt (nr 201307002) ja Hiina riiklik võtmetehnoloogia teadus- ja arendustegevuse programm "Uus narkootikumide innovatsioon".

Neil autoritel ei ole huvide konflikti deklareerida. Väljaandja: Elsevier B.V. Kõik kaitstud õigused näitasid, etfenüületanoidi glükosiidid(PhG-d), iridoidid, lignaanid ja polüsahhariididCistancheliigid [4] ja mõned isolaadid esitasid neuroprotektiivset, hepatoprotektiivset, põletikuvastast, antibakteriaalset, viirusevastast ja antioksüdantset toimet [5-6].

1990. aastate lõpus, et kaitsta Tazhongi naftavälja ja kontrollida kõrbe, liiva fikseerimise taim Haloxylon ammodendron (C. A. Mey.) Bunge, peremeesCistanchedeserticola, võeti kasutusele põhjast lõunasse Xinjiangist ja suurtes kogustesC. deserticolaNeid kasvatati. Lõunas asuvad kliimatingimused ja kasvukeskkond on väga erinevad Xinjiangi põhjaosa kliimatingimustest. Kas keemilised koostisosadCistanchedeserticolaLõuna-Xinjiangis kasvatatud erinevad või mitte, ei ole selge. Selleks, et määrata kindlaks keemilised koostisosadCistanchedeserticolaTarimi kõrbes kultiveeritud süstemaatiliselt fütokemiline uurimine viidi läbi käesolevas uuringus. Siin teatatakse uue iridoidglükosiidi (1) isoleerimisest ja struktuursest selgitamisest koos kaheksa teadaoleva analoogiga (2–9) koos nende põletikuvastase tegevusega.

Põletikuvastane toimeCistanche deserticola

Tulemused ja arutelu

Varre 85% vesietanooli ekstraktCistanchedeserticolapeatati H2O-s (10 L) ja ekstraheeriti järjest etoaciga (10 L × 3) ja n-BuOH-ga. EtOAc ja n-BuOH ekstraktid allutati ränidioksiidi geelile, Sephadex LH-20- le, MCI geelile ja ODS-kolonnikromatograafiale (CC) ning poolpreparatiivsele HPLC-le, et endale lubada ühte uut (1) ja kaheksat teadaolevat iridoidi (2-9) (joonis 1).

Ühend 1 eraldati negatiivse optilise pöördega valge amorfse pulbrina ([a]20 –118,0, c 0,1, MeOH). Selle IR-spekter näitas tugevaid neeldumisribasid umbes 3 393 cm−1 juures, mis oli hüdroksürühmadele kirjeldatav. Sellel on molekulaarne valem C16H26O9, mis on määratud kvaasimolekulaarse iooniga m/z 385.148 5 [M + Na]+ (calcd. for C16H26O9Na, 385.146 9) ja m/z 401.122 8 [M + K]+ (kaltsüüd. C H O K puhul, 401.120 8) korrelatsioonid H-1 kuni C-1′, H-10 kuni C-7, C-8 ja C-9 ning H-11 kuni C-3, C-4, ja C-5 toetas ka ülaltoodud selgitust.

1. ühendi stereokeemia määrati keemiliste nihete ja sidumiskonstantide võrdlemisel kirjandusandmetega ning NOESY spektri analüüsiga. H-5 ja H-9 suhe määrati cis-na nende sidumiskonstandist (10,5 Hz) [8-9]. Kõige loomulikumate iridoidide puhul on C-1-OH, H-5 ja H-9 konfiguratsioonid β ning C-1 ja C-1′ 13C NMR keemilised nihked on üldiselt vastavalt δC 93–98 ja 97–101. Kuigi α-konfiguratsiooniga inimeste puhul on C-1 ja C-1′ resonantsid keskmiselt 5–6 allapoole nihkunud [10-11]. Com-16 26 9 13C NMR-andmed (+)-HR-ESIMS-is ja neid toetavad 13C NMR-andmed (tabel 1), mis näitab 4 kraadi küllastumata. Happe hüdrolüüs−1Table 1 1H NMR (500 MHz) ja 13C NMR (125 MHz) andmed 1 (δ ppm, J in Hz) ühendist 1 koos 2 mol, L trifluoroacetic acid andis D-glükoosi, mis tuvastati selle silane derivaatide analüüsiga GC analüüsiga. Glükosüüli anomeerse keskuse suhteline konfiguratsioon määrati β haakekonstandist 8,0 Hz. 1. ühendi 1H ja 13C NMR-andmed (tabel1), mis määrati ühemõtteliselt erinevate 2D NMR-katsetega, näitasid signaale, mida saab määrata kahele metüülile δH 1,23 (3H, s, H-10) ja 1,52 (3H, br s, H-11), üks metüleen δH 1,70 juures (1H, dt, J = 13,5, 5,5 Hz, H-6α) ja 1,92–1,98 (1H, m, H-6β), kolm metiini δH 2,47 (1H, 1H, br d, J= 10,5 Hz, H-9), 2,67–2,72 (1H, m, H-5) ja 3,62 (1H, t-like, J= 5,5 Hz, H-7) ja α, β küllastumata atsetaalrühm δH 5,40 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-1), 5,92 (1H, br s, H-3), koos β-D-glükkopüranosüülnosüül prootoniga δH 4,61(1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′). 1. ühendi 1H ja 13C NMR andmed olid väga sarnased Lanka A-poole (6) andmetega, välja arvatud H-7 [δH 3,62 (1H, t-like, J = 5,5 Hz)] ja C-7 (δC 79,8) ilmsed varjatud signaalid, mis näitavad C-7 positsiooni hüdroksülatsiooni [7]. Seda mahaarvamist toetasid H-1/H-9/H-5/H-6/H-7 1H COSY ja H-HMBC korrelatsioonide analüüsid H-7 kuni C-5, C-6, C-8, C-8, C-9 ja C-10 (joonis 2). Teine HMBC

Siin teatatud nael 1 (tabel 1) näitas C-1-OH, H-5 ja H-9 normaalseid β konfiguratsioone. H-7 ja H3-10 suhtelised konfiguratsioonid määrati NOESY spektrist (joonis 2), kus NOE korrelatsioonid H-1 ja H3-10 vahel ning H3-10 ja H-7 vahel näitasid, et need prootonid on kõik samal näol. Ükski NOESY korrelatsioon H3-10 ja H-9 vahel ei viidanud sellele, et H-9 ja H3-10 on molekuli vastasküljel. Seetõttu selgitati ühendi 1 struktuuri 7-hüdroksüül-Lankapoolseks küljeks nimegacistadesertosideA.

Teadaolevad ühendid tuvastati kindlatena (2) [12],cistachlorin(3) [12], 6-deksoksükatalpol (4) [13], glükosiid (5) [14], Lanka pool A (6) [7], lugol (7) [15], bartsiosiid (8) [16] ja 8-epiorgaaniline hape (9) [17] võrreldes NMR-andmetega, mis on esitatud kirjanduses. Nende isoleeritud iridoidide põletikuvastast toimet hinnati nende inhibeeriva toime tõttu LPS-indutseeritud NO tootmisele BV-2 mikrogliiarakkudes ja nende tsütotoksilisust testiti esmakordselt BV-2 rakkudes LPS-raviga 24 tundi. Isolaatide puhtused on kõik suuremad kui 95%, tuginedes 1 H NMR spektroskoopilisele analüüsile. Kõigil isolaatidel ei ilmnenud olulist tsütotoksilisust kontsentratsiooniga 40 μmol· L−1 BV-2 rakkudes (tabel 2). Ühend 9 näitas tugevat inhibeerivat toimet NO tootmisele, mille IC50 väärtus oli 5,2 μmol· L−1 , võrreldav positiivse kontrollkvertsetiiniga (4,3 μmol· L−1 ), samas kui teistel ei ilmnenud märkimisväärset mõju testitud kontsentratsioonile 40 μmol· L−1 (tabel 2). Esialgne struktuuri-aktiivsuse suhte analüüs näitas, et karboksüülrühma olemasolu C-4 positsioonis ühendis 9 võib olla seotud selle olulise aktiivsusega. Kokkuvõtteks võib öelda, et üks uus ja kaheksa teadaolevat iridoidi eraldatiC. deserticolakasvatatud Tarimi kõrbes ja ühendis 9 oli märkimisväärne inhibeeriv toime LPS-indutseeritud NO tootmisele BV-2 mikrogliiarakkudes. Kõik teadaolevad iridoidid on varem loodusest teatatudC. deserticola[7, 12-17] ja seega ei ole iridoidide ja fenüületanoidide keemilises konstitutsioonis ilmset erinevustC. deserticolakasvatatakse Tarimi kõrbes koos teiste elupaikadega, võttes ühiselt arvesse meie viimast aruannet [19].

Cistanche deserticola: Põletikuvastane toime

Eksperimentaalne

Üldised eksperimentaalsed protseduurid

IR-spektrid salvestati Nicolet Nexus 470 FT infrapunaspektromeetril. NMR-spektrid saadi Varian Inova-500 spektromeetril. HR-massispektrit mõõdeti Bruker APEX IV FT-MS (7,0 T) massisüsteemil, mis oli varustatud ESI allikaga. ESI-MS mõõdeti Agilent 6320 ioonilõksuga MS spektromeetril. Optilisi pöördeid mõõdeti Rudolph AUTOPOL IV polarimeetril. Sulamistemperatuurid määrati X-4 digitaalse ekraani mikrosulatuspunkti seadmel (korrigeerimata). Poolpreparaatiivset HPLC-d kanti ODS-kolonniga (Alltech, 250 mm × 10 mm ID,5 μm) instrumendil Waters 600. GC analüüsid viidi läbi VARIAN CP-3800 gaasikromatograafil DB-5 veeruga (0,25 mm × 30 m). Kolonnikromatograafia viidi läbi ränidioksiidigeelil (200–300 võrgusilma, Qingdao Marine Chemistry Ltd., Hiina), MCI geelil (CHP20P, 75–150 μmol· L−1 , Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Jaapan), Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences, Rootsi) ja ODS C18 (40–63 μm; Merck, Saksamaa). TLC viidi läbi klaasist eelkokootud ränidioksiidi geelil GF254 plaatidel. Laigud visualiseeriti UV-valguses või pihustades 5% väävelhappe etanooli lahusega.

Taimne materjal

C. deserticola varred koguti Tarimi kõrbes, Xinjiangi Uiguri autonoomses piirkonnas, Hiinas ja identifitseeris prof TU Peng-Fei. Kande näidis (nr. CD201011) deponeeriti Pekingi ülikooli traditsioonilise hiina meditsiini kaasaegse uurimiskeskuse herbaariumis. Ekstraheerimine ja isoleerimine C. deserticola (15,3 kg) kuivatatud varred lõigati peeneks ja ekstraheeriti 85% vesietanooliga (120 L × 1 h × 3). Kontsentreeritud jääk (4,5 kg) peatati H2O-s (10 L) ja ekstraheeriti järjest etoaci (10 L × 3) ja n-BuOH-ga (10 NAN Ze-Dong jt / Chin J Nat Med, 2016, 14(1): 6165 – 64 – L × 3). Ühendid 2–6 saadi EtOaci ekstraktist, samas kui ühendid 1 ja 7–9 saadi n-BuOH ekstraktist.

Etoaci ekstrakt (65,8 g) allutati ränidioksiidigeelile CC (200–300 võrgusilma), kasutades CHCl3/MeOH astmiklahustisüsteemi (50: 1, 1, 20: 1, 1, 10: 1, 6: 1, 2: 1 ja 1: 1), et endale lubada kümmet fraktsiooni (Fr. 1–Fr. 10). Fr. 2 (5,3 g) eraldati Sephadex LH-20 CC-ga, elades CHCl3/MeOH-ga (1: 1), et anda kolm peamist fraktsiooni (Fr. 2-1, Fr. 2-2 ja Fr. 2-3). Fr. 2-3 eraldati ränidioksiidgeel CC-ga, kasutades PE/Me2CO-d (50 : 1, 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1, 2 : 1, 1 ja 0 : 1) nelja fraktsiooni (Fr. 2-3-1–Fr. 2-3-4) abil. Fr. 2-3-2 eraldati ränidioksiidi geeliga CC, mis eluting koos PE / CHCl3 / MeOH (8: 8: 1), et saada ühend 3 (20,6 mg). Ühend 2 saadi Fr. 2-3-3-st pärast puhastamist kromatograafia abil ränidioksiidgeel CC-l, eluting koos PE/CHCl3/MeOH-ga (5: 5: 1). Fr. 4 (2,5 g) eraldati Sephadex LH-20 CC-ga, elades CHCl3/MeOH-ga (1: 1), et anda kolm fraktsiooni (Fr. 4-1, Fr. 4-2 ja Fr. 4-3). Fr. 4-2 allutati MCI geelile CC (MeOH/H2O, 10: 90 kuni 90: 10, V/V), et endale lubada kolme peamist fraktsiooni (Fr. 4-2-1, Fr. 4-2-2 ja Fr. 4-2-3). Fr. 4-2-1 puhastati poolpreparatiivse HPLC [CH3CN-H2O (10: 80)] abil, et saada ühend 4 (32,3 mg) ja 5 (15,0 mg), samas kui Fr. 4-2-2 puhastati poolparaatiivse HPLC [CH3CN-H2O (10: 80)] abil, et saada ühend 6 (8,3 mg). N-BuOH ekstrakt (536 g) allutati ränidioksiidigeelile CC (200–300 võrgusilma), kasutades chcl3/meOH gradientlahustite süsteemi (20: 1, 10: 1, 1, 6: 1, 2: 1, 1, 1: 1, 0: 1), et endale lubada kümmet suurt fraktsiooni (Fr. D1–Fr. D10). Fr. D5 (3,0 g) allutati MCI geeli cc (MeOH/H2O, 10: 90 kuni 80: 20, V/V), et endale lubada kolme fraktsiooni (Fr. D5-1–Fr. D5-3). Fr. D5-2 (120 mg) eraldati ränidioksiidi geeliga CC (200–300 võrgusilma, 10,0 g; PE/EtOAc/MeOH 3 : 3 : 1) ühendi 8 (12,5 mg) andmiseks. Fr. D8 (4,5 g) eraldati Sephadex LH-20 CC-ga, elades MeOH-ga, et saada kolm fraktsiooni (Fr. D8-1–Fr. D8-3). Fr. D8-3 eraldati avatava ODS-veeruga (MeOH / H2O, 20: 80 kuni 80: 20, V / V), et endale lubada kolme fraktsiooni (Fr. D8-3-1–Fr. D8-3-3). Fr. D8-3-1 allutati poolpreparatiivsele HPLC-le [CH3CN-H2O (8: 90)]), et anda ühend 1 (2,3 mg). Fr. D9 (10,1 g) eraldati Sephadex LH-20 veeruga, mis elas MeOH-ga, et anda kolm peamist fraktsiooni (Fr. D9-1–Fr. D9-3). Fr. D9-3 allutati MCI geeli kolonnile (MeOH/H2O, 0: 100 kuni 50: 50, V/V), et anda ühendeid 7 (15,3 mg) ja 9 (45,5 mg). Cistadesertoside A (1): valge amorfne pulber. [] 20 D –118,0 (c 0,1, MeOH); IR (KBr) νmax: 3 393, 1 071, 1 028 cm−1 ; (+)-HRESI-MS m/z 385.146 9 [M + Na]+ (Calcd. for C16H26O9Na, 385.148 5) ja m/z 401.120 8 [M + K]+ (Calcd. for C16H26O9K, 401.122 8); 1 H NMR ja 13C NMR andmed, vt tabel 1.

Ühendi happeline hüdrolüüs 1

Ühendit 1 (1,0 mg) segati 90 °C juures 5 tunni jooksul 2 mol· L−1 CF3COOH (EtOH: H2O, 1: 1, 2 ml). Pärast toatemperatuurini jahutamist koondati lahus vähendatud rõhu alla. Jääk lahustati 2 ml püridiinis 0,1 mol· L−1 L-tsüsteiini metüülestervesinistervesinikkloriid ja segatakse temperatuuril 60 °C 1,5 tundi. Pärast jahutamist ja kontsentreerumist töödeldi segu trimetüülklorosilaaniga (TMSCl) ja heksamethüüldisilasaaniga (HMDS) (1: 2, V/V, 0,5 ml) püridiinis (2 ml), millele järgnes segamine 60 °C juures 0,5 h. Seejärel kontsentreerus lahus kuivaks ja jääk jaotati H2O ja n-heksaaniga (2 × 3 ml) [18]. N-heksaani fraktsiooni analüüsis GC DB-5 veeruga (0,25 mm × 30 m). Nii pihusti kui ka detektori temperatuurid olid 220 °C juures. Ahjule rakendati temperatuuri gradientsüsteem, mis algas 140 °C juures 1 min ja tõusis kuni 250 °C kiirusega 4 °C·min−1. Suhkru derivaadi hüdrolüsaadi tipp tuvastati säilitusaja võrdlemisel D-glükoosi autentse prooviga (19,24 min) pärast sarnast ravi TMSCl/ HMDS-iga.NO-tootmise pärssimine

Isoleeritud ühendite NO inhibeerivat toimet hinnati LPS-indutseeritud BV-2 mikrogliiarakkude vastu Griessi meetodil NO analüüsikomplekti abil (Nanjing-Jianchengi Biotehnoloogia Instituut, Nanjing, Jiangsu, Hiina) nagu varem kirjeldatud [19] ja kvertsetiini kasutati positiivse kontrollina. Lisaks hindas MTT analüüs rakkude võimeid.

Cistanche kasu: põletikuvastane

Viited

[1] Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa N jt. Uued fenüületanoidi glükosiidid alatesCistanche tubulosa(Schrenk) Konks. f. I [J]. Chem Pharm Bull, 1987, 35(8): 3309-3314.

[2] Xinjiangi põhiravimite kultuuritehnikad [M]. Xinjiang: Xinjiangi traditsiooniliste hiina ja etnoloogiliste ravimite instituut Ed, Xinjiangi teadus- ja tehnoloogiaajakiri, 2004: 84-88.

[3] Hiina farmakopöakomitee, Hiina farmakopöa [M]. Vol. Mina, Peking: Hiina meditsiiniteaduse ja tehnoloogia ajakirjandus, 2010: 126.

[4] Jiang Y, Tu PF. Cistanche keemiliste koostisosade analüüs

liigid [J]. J Chromatogr A, 2009, 1216(11): 1970-1979.

[5] Pan J, Yuan CS, Lin CJ jt. Looduslike fenüülpropanoidglükosiidide farmakoloogiline toime ja mehhanismid [J]. Pharmazie, 2003, 58(11): 767-775.

[6] Fu GM, Pang HH, Wong Y. Looduslikult esinevad fenüületaanoidglükosiidid: võimalikud juhtlõngad uute ravimite jaoks [J]. Curr Med Chem, 2008, 15(25): 2592-2613.

[7] Xie HH, Morikawa T, Matsuda H jt. Monoterpene koostisosad alatesCistanche tubulosa-kankanosiidide A-E ja kankanol [J] keemilised struktuurid. Chem Pharm Bull, 2006, 54(5): 669-675.

[8] Foderaro TA, Stermitz FR. Scrophulariaceae keemia. 24. osa. Iridoidglükosiidid Penstemoni liikidest: A C-5, C-9 trans-iridoid ja C-8 epimeersed paarid [J]. Fütokeemia, 1992, 31(12): 4191-4195.

[9] Krull RE, Stermitz FR. Trans-sulatatud iridoid glükosiidid Penstemon mucronatusest [J]. Fütokeemia, 1998, lk 49(8): 2413-2415.

[10] Takeda Y, Yagi T, Matsumoto T jt. Nepetanudosides ja iridoid glükosiidid, millel on uudne stereokeemia Nepeta nuda ssp. albiflora [J]. Fütokeemia, 1996, 42(4): 1085-1088.

[11] Takeda Y, Ooiso Y, Masuda T, et al. Iridoid ja eugenooli glükosiidid Nepeta kaamerast [J]. Fütokeemia, 1998, lk 49(3): 787-791.

[12] Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, et al. Uuringud Cistanchise herba koostisosade kohta. II. Uute iridoidide isoleerimine ja struktuurid,tsistaniin ja tsiistakloriin[J]. Chem Pharm Bull, 1984, lk 32(5): 1729-1734.

[13] Arslanian RL, Harris GH, Stermitz FR. Scrophulariaceae keemia. 7. Mõned iridoidglükosiidid, sealhulgas uus 6-deoksükatalpol, Castilleja miniataga seotud India pintsliliikidest [J]. J Nat Prod, 1985, lk 48(6): 957-961.

[14] Sticher O, Weisflog A. Iridoidsete glükosiidide määramine ja isoleerimine Galeopsis tetrahitist (Labiatae) ja glurosiidi struktuuri selgitamine [J]. Pharm Acta Helv, 1975, lk 50(11): 394-403.

[15] Nishimura H, Sasaki H, Morota T jt. Keemilised ja bioloogilised uuringud Rehmanniae Radixi kohta. 3. osa. Kuus iridoidglükosiidi Rehmannia glutinosast [J]. Fütokeemia, 1989, 28(10): 2705-2709.

[16] Juunior P. Veel iridoidid Penstemoni liikidest [J]. Planta Med, 1984, 50(6): 530.

[17] Boros CA, Stermitz FR. Iridoids. Uuendatud ülevaade. I osa [J]. J Nat Prod, 1990, 53(5):1055-1147.

[18] Jian R, Zeng KW, Tu PF jt. Spargli cochinchinensise [J] neuroinflammatiivsed koostisosad. Fitoterapia, 2013, 84: 80-84.

[19] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP jt. Fenüületanoidi glükosiidid põletikuvastase toimegaCistanche deserticolakultuur tarimi kõrbes [J]. Fitoterapia, 2013, 89: 167-174.