P-põhise hüdrogeeli vananemisvastane potentsiaal inimese naha pikaealisuse tagamiseks

Märksõnad:aine Cistanche; vananemisvastane toime; põletikuvastane toime; naha imendumine; 3D inimese nahamudel;kosmeetiline koostisosa

Cistanche For Aged Skin hankimiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Naha vananeminetekib erinevate protsesside, sealhulgas sisemiste (rakkude ainevahetus, hormonaalsed muutused ja geneetilised mutatsioonid) ja väliste tegurite (toksiinid, kemikaalid ja ultraviolettkiirgus (UV) kiirgus) tõttu [1–3].Vananenud nahkSeda iseloomustab bioloogiliselt ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) komponentide üldine vähenemine koos lagunenud ja vähenenud kollageeni ja elastiiniga [4,5]. Lisaks anpõletikuline nähtuson tavaliseltindutseeritud vananevale nahale, põhjustadespärisnaha kortsumine ja pakseneminejaepidermis. Põletikulistest rakkudest vabanevad põletikueelsed vahendajadvõib suurendada kollagenaaside, mida nimetatakse maatriksmetalloproteinaasideks (MMP-d), aktiveerimist, mis viib kollageeni lagunemiseni [6–8]. Viimastel päevadel on pakutud välja palju vananemisvastaseid materjale, millel on võime suurendada kollageeni sünteesi. Üks tuntud materjale on kasvufaktor. Kasvufaktoreid on nahahaavade paranemiseks põhjalikult uuritud [9]. Paljud neist, nagu trombotsüütidest tulenev kasvufaktor (VEGF), epidermaalne kasvufaktor (EGF) ja keratinotsüütide kasvufaktor, mõjutavad otseselt kollageeni sünteesi rakuvaheliste ja -siseste signaaliradade võrgustiku kaudu [9, 10]. Paikselt manustatud kasvufaktoritest pole aga vananemisvastaste ainetena kuigi palju abi olnud nende suure molekuli suuruse tõttu, mis piirab nende võimet tungida läbi kitsa sarvkihi [11]. Lisaks kasvufaktoritele on välja töötatud ka palju madala molekulmassiga vananemisvastaseid peptiide. Näiteks palmitoüültripeptiidid takistavad kollageeni lagunemist, segades kollageeni redutseerimist kollagenaaside, nagu MMP1 ja 3, poolt [12]. Lisaks on näidatud, et vasktripeptiidid, kõige paremini uuritud peptiidid, stimuleerivad prokollageeni sünteesi [13].

Kuigi mitmed uuringud on näidanud kollageeni sünteesi soodustamist paikselt manustatavate kasvufaktorite ja peptiidide abil, ei pruugi kollageeni sünteesi üksainus toime ilma põletikuvastase toimeta olla piisav vananemisvastase toime kliiniliseks parandamiseks. Ilmsema toime saavutamiseks tuleb ühend viia naha sügavamatesse kihtidesse. Seetõttu on suur vajadus uute materjalide väljatöötamise järele, millel on kollageeni sünteesi ja põletikuvastase toime kahekordne funktsioon koos suurenenud naha imendumisega. Cistanche (CP), väikese suurusega peptiid, mis koosneb 11 aminohappest, avaldab potentsiaalset haavade paranemise aktiivsust, mis avaldub rakkude proliferatsiooni indutseerimise, kollageeni sünteesi ja põletikuvastase toime kaudu [14–16]. CP terapeutilist kasutamist on aga piiranud selle madal stabiilsus, mis võib selle raviomadusi edasi lükata [17–19]. Eelmises uuringus töötasime välja uudse CP koostise, tuntud kui CP geel, mis suurendab CP stabiilsust erinevates säilitustingimustes [20]. Lisaks stabiilsusele on CP-geel näidanud tõhusamat haavade paranemist kui ainult CP, suurendades keratinotsüütide ja fibroblastide proliferatsiooni. Käesolevas töös oleme laiendanud CP-geeli iseloomustamist ja näidanud selle kollageeni sünteesi ja põletikuvastase toime edendamist vananemisvastaseks toimimiseks. Täiendavalt uuriti ka CP-geeli naha imendumist ja pigmentatsiooni. Meie leiud näitavad, et CP-geelil on suurem vananemisvastane potentsiaal võrreldes ainult CP-ga, millel on suurenenud naha imenduv toime ja seega laiem kosmeetiline kasutatavus.

2. Tulemused

2.1. CP geeli in vitro toksilisus

CP-geeli vananemisvastaseks kasutamiseks on soovitav kõrge toime koos vähese toksilisusega inimese nahale. Seetõttu hinnati CP-geeli in vitro toksilisust inimese dermaalsete fibroblastide (HDF) ja rekonstrueeritud 3D inimese naha keraskin®-FT abil. Esiteks hindasime CP-geeli kahjustavat mõju rakumembraanile, võrreldes ainult CP-ga, laktaatdehüdrogenaasi (LDH) testiga, kasutades HDF-e (joonis 1A). Lisaks eelmisele 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiidile (MTT) kasutati ka LDH analüüsi. test [20] CP-geeli toksilisuse täpsemaks mõõtmiseks. Tulemused näitasid, et ei CP geel ega CP üksi ei näidanud rakumembraani kahjustusi HDF-ide vastu kõigis testitud kontsentratsioonides. Veelgi enam, töötlemine kandjaga, millel puudus CP, ei mõjutanud rakumembraani võrreldes ainult PBS-i sisaldava söötmega. Inimese naha võimaliku ärrituse CP-geelist põhjustatud täiendavaks testimiseks kandsime viimast erinevates kontsentratsioonides täispaksusega nahamudelile keraskin®-FT (joonis 1B, C) kokku 24 tunni jooksul. Kudede elujõulisusele avalduva mõju võrdlemiseks kasutati positiivse kontrollina 5-protsendilist naatriumdodetsüülsulfaati (SDS), mis on tuntud ärritaja. CP-geel (1–10 µg/mL) oli keraskin®-FT-le mittetoksiline, nagu näitas MTT test (joonis 1B), mis näitab, et kontrollrühmaga võrreldes (PBS-ravi) ei esinenud võimalikku nahaärritust. Lisaks näitas histoloogiline uuring, et keraskin®-FT ei olnud CP-geeli tõttu üldse kahjustatud (joonis 1C). Samad tulemused saadi ainult CP-ga ravitud rühmas (joonis S1). Nende tulemuste põhjal leiti, et isegi kõrge CP-geeli kontsentratsioon (10 µg/mL CP-d) ei ole toksiline ega põhjusta nahaärritust.

Joonis 1. Aine Cistanche (CP) geeli mõju HDF-ide elujõulisusele ja in vitro rekonstrueeritud 3D inimese nahale, keraskin@-FT.(A) CP-geeli koostise rakumembraanile kahjustava toime jaoks töödeldi HDF-e PBS-iga. (Con; kontroll), CP üksi või CP geel (1-10 ug/mL) 24 tunni jooksul ja rakkude elujõulisus määrati LDH testiga. (B, C) Naha ärrituvust testiti CP-geeliga (1-10 ug/mL) in vitro rekonstrueeritud 3D inimese nahal keraskin@-pT. Kudede elujõulisust CP-geeliga töödeldud rühmas analüüsiti MTT testiga (B) ja histoloogilise uuringuga (C), PBS-i kasutati kontrollina ja väärtused esindavad kolme sõltumatu katse keskmist pluss SD. Iga väärtust võrreldi kontrolliga Studenti testi abil (** p < 0.01). Skaalariba=500 um. HDF, inimese dermaalne fibroblast; LDH, laktaatdehüdrogenaasMTT, 3-(4.5-dimetüültiasool-2-vl)-2 .5-difenüültetrasooliumbromiid: PBS, fosfaat-või soolalahus, SDS, naatriumdodetsüül sulfaat.

2.2. EffCP Gel kollageeni tootmise kohta

Et uurida CP-geeli mõju kollageeni sünteesile nahal, töödeldi HDF-e CP-geeliga. Meie tulemused näitasid, et CP-geel, mis sisaldas 1–10 µg/mL CP-d, suurendas oluliselt (p < 0,01) I tüüpi prokollageeni tootmist 128,05 ± 5,19, 145,19 ± 6,80 ja 150,68-ni. ± 16,70 protsenti võrreldes kontrollraviga (PBS) (joonis 2A). Muidu, nagu on näidatud joonisel fig 2A, ei täheldatud ainult 1 µg/ml CP-ga töödeldud HDF-ide puhul märkimisväärset erinevust I tüüpi kollageeni tootmises. Kuigi CP üksi avaldas kollageeni tootmist teatud määral kontsentratsioonides 5–10 µg/ml (119,96 ± 3,8 ja 124,77 ± 8,87 protsenti), oli see mõju oluliselt (p < 0,01) madalam kui CP geeli puhul.

Joonis 2. CP-geeli kollageenisisaldust suurendav toime HDF-ides. CP-geeli mõju 1. tüüpi kollageenile (A)MMP-1 (B) ja TIMP-1 (C) mõõdeti HDF-ides. HDF-e töödeldi ainult PBS (Con; kontroll)CP-ga või CP-geeliga (1-10 ug/mL) 24 tundi ja tüübi [prokollageen, MMP-1 ja TIMP{{8} ekspressioon. }}mõõdeti vastavalt Procollagen Type IC-peptide (PIP) EIA komplekti, inimese MMP{{10}} ELISA komplekti ja IIMP-1 ELISA komplekti kasutades. Kontrollina kasutati PBS-i. Väärtused esindavad kolme sõltumatu katse keskmist pluss SD. * p < 0.05, ** p < 0,01 vs. PBS-i sisaldav sööde ilma CP-ta, # p < 0,05# y < 0,01 vs. ainult CP. HDE, inimese dermaalne fibroblast; PBS, fosfaatpuhverdatud soolalahus; MMP-1maatriksi metalloproteinaas-1; TIMP-1, metalloproteinaasi-1 kudede inhibiitorid; EL ISA, ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs.

Järgnevalt. hinnati kollageeni lagunemisega seotud tasemeid CPwegeliga töödeldud HDE-des. Meie tulemused näitasid, et CP-geel, mis sisaldas 1-10 ug/mL CP-d, inhibeeris oluliselt (p < 0,01) MMP-1 taset 62,88 pluss 6,54, 59,54 pluss 8,35 ja 57,44 pluss. 7,69 protsenti võrreldes kontroll HDF-idega (PBS-ravi) (joonis 2B). Ootuspäraselt pärssis CP üksi, mis sisaldas 1-10 ug/mL CP-d, ka MMP-1 taset 80,18 pluss 2,88, 78,48 pluss 6,19 ja 79,84 pluss 15,08 protsenti, kuigi need mõjud olid oluliselt väiksemad kui CP geeli omad. CP-geeliga töödeldud HDF-ides olid CP kontsentratsioonidel 1-10 ug/mL metalloproteinaasi (IIMP)-1, mis põhjustab MMP-1 inhibeerimist, ekspressioonitasemed. tõusis 113,41 pluss 4,74, 116,76 pluss 3,31 ja 115,8 pluss 10,13 protsenti võrreldes kontrollravi (PBS) omaga (joonis 2C). Need tulemused koos viitasid sellele, et CP-geel võib kiirendada I tüüpi prokollageeni tootmist, inhibeerides MMP-1 ja suurendades TIMP-1 ekspressiooni HDF-ides. CP geeli ja ainult CP võrdlev analüüs näitas, et CP geel on kollageeni tootmise esilekutsumisel tõhusam kui CP üksi.

2.3. EffiCP geeli säilivus nahapõletiku korral

Mõju uurimiseksCP geelil põletikuliste tsütokiinide ekspressioonil, uurisime, kas CP geelil on põletikuvastane roll, vähendades IL-1 alfa või -6 ja suurendades IL-10 või transformeerides kasvufaktorit (TGF). )-beeta 1 SDS-indutseeritud inimese epidermaalsetes keratinotsüütides (HEKs). PBS-ga töödeldud rakke peeti negatiivseteks kontrollideks, SDS-stimuleeritud rakke aga positiivsete kontrollidena. Nagu on näidatud joonisel3A, 24-h ravi CP-geeliga (5µg/ml CP-d CP-geelis) oluliselt (p < 0.01) vähendas SDS-indutseeritud IL-1 alfa ja IL-6 ekspressiooni. Teisest küljest on CP geel märkimisväärselt (p < 0.01) suurendas SDS-indutseeritud IL-10 ja TGF-beeta 1 ekspressiooni (joonis3B). Need tulemused viitavad põletikuvastasele toimeleCP geeli kohta HEK-idel.

Joonis 3. CP-geeli põletikuvastane toime SDS-stimuleeritud HEK-des. HEK-e inkubeeriti samaaegselt 0.0015% SDS-i ja CP-geeliga 24 tundi. Rakukultuuri supernatandid koguti ja põletikuliste faktorite taset mõõdeti ELISA komplektidega. Tuvastati põletikueelsete tegurite, IL-1 alfa ja IL-6 (A) ning põletikuvastaste faktorite, IL-10 ja TGF-beeta 1 (B) suhteline suurenemine. nagu on kirjeldatud katseprotseduurides; Kontrollina kasutati PBS-i. Kõik väärtused esindavad kolme sõltumatu katse keskmisi pluss SD. ** p < 0,01 vs. PBS-i sisaldav sööde ilma CP.# p < 0,01 vs. ainult SDS-iga töödeldud HEK-id. HEK, inimese epidermaalne keratinotsüüt; SDS, naatriumdodetsüülsulfaat; ELISA, ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs; PBS, fosfaatpuhverdatud soolalahus; IL, interleukiin.IGF, transformeeriv kasvufaktor.

2.4. CP geeli in vitro naha imendumisomadused

Et hinnata CP-geeli võimalikku kliinilist kasutamist vananemisvastaste omaduste jaoks, uurisime CP-geeli võimet imenduda naha välimisse kihti sarvkihti (SC) ning siseneda epidermisesse ja pärisnahasse. Selle aspekti lahendamiseks kanti 5 ug/ml fluorestseiini isotiotsüanaadi (FITC) märgistatud CP-d sisaldavat CP-geeli paikselt rekonstrueeritud 3D-inimese nahale keraskin@-FT (joonis 4A). Nagu on näidatud joonisel fig 4B, näitasid FlTC-märgistatud CP-d sisaldava geeliga töödeldud nahaosad pärast 1-tunnist pealekandmist märkimisväärset rohelist fluorestsentsi kogu epidermises koos defundeeritud fluorestsentsiga nahakoes, mis viitab CP-geeli võimele imenduda. SC-sse ja sisenevad epidermisesse ja pärisnahasse. 6 ja 24 tunni pärast täheldati CP-geeliga töödeldud nahaosade epidermises ja dermises loomaarsti silmatorkavamat rohelist fluorestsentsi. Seevastu ainult PBS-i paiksel kasutamisel olulist fluorestsentsi ei täheldatud.

Joonis 4. CP-geeli imendumine naha kaudu in vitro rekonstrueeritud 3D inimese nahka, keraskin@-FI. (APBS või CP geel (sisaldab FITC-märgistatud CP-d) kanti keraskin@-FTB sarvkihile) Fluorestsentskujutised näitasid CP geeli imendumise ulatust. PBS-i (töötlemata) või FITC-märgistatud CP-d sisaldavat CP-geeli kasutati paikselt näidatud aja jooksul. Fluorestsentsmikroskoobi all täheldati nahaprobleemide külmunud lõike. Skaalariba=1 mm

Küsi lisa:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp pluss 86 15292862950