Cistanche Deserticola vananemisvastased funktsionaalsed tegurid ja mehhanism Ⅱ

3. Tulemus

3.1 Cistanche deserticola potentsiaalsed toimeained ja sihtmärgid

Kirjanduse läbivaatamisel ja selle uurimisrühma varasemate uurimistöödega kombineerimisel valiti võrkfarmakoloogia uuringute sihtühenditeks 12 keemilist komponenti, sealhulgas fenüületanoolglükosiide, iridoide ja lignaane. Konkreetne teave on näidatud tabelis 3. Pärast duplikaatide andmebaasist eemaldamist saadi 12 potentsiaalse toimeaine jaoks kokku 86 sihtmärki.

Kvaliteetne vananemisvastane tsistanš

3.2 Vananemisega seotud eesmärgid

GeneCardsi ja OMIM-i andmebaasidesse koguti vastavalt 7753 ja 295 vananemisega seotud sihtmärki.

3. 3 Ravimite ja haiguste ühised eesmärgid ning PPI võrgustiku väljaehitamine

Ravimi sihtmärkide ja haiguste sihtmärkide ristumiskohaks oli 75 ristumissihtmärki, mis imporditi võrgu analüüsiplatvormi STRING, võrgu ühendamata sõlmed peideti ja konstrueeriti PPI võrk. Vaadake täiustatud avaldamismaterjale. Kokku on PPI võrgus 45 sõlme ja 59 ühendust. Kaheksa põhilist sihtmärki sõeluti välja topoloogilise analüüsi abil, nagu on näidatud tabelis 4.

3.4 GO rikastamise analüüs ja KEGG rikastamise analüüs

OmicsBeani andmebaasi kaudu viidi põhieesmärkidele läbi GO funktsionaalne rikastamine ja KEGG raja analüüs. GO analüüs hõlmab kolme aspekti: rakukomponent, molekulaarne funktsioon ja bioloogiline protsess. 10 parimat väikseima P-väärtusega üksust on näidatud täiustatud avaldamismaterjalis. Tulemused näitavad, et bioloogilised protsessid hõlmavad peamiselt reaktiivse hapniku metabolismi reguleerimist, immuunvastuste positiivset reguleerimist, valkude lokaliseerimist organellidesse, polüsahhariidide seedimist jne; rakulised komponendid hõlmavad peamiselt endomembraanisüsteemi, rakuvälist piirkonda, plasmamembraani ja membraaniga seotud rakke.

Elundid, ekstratsellulaarsed sekretoorsed kehad, Golgi aparaat jne; molekulaarsed funktsioonid on peamiselt seotud glükosidaasi aktiivsuse, lämmastikoksiidi süntaasi reguleeriva aktiivsuse, süsivesikute sidumise, -fruktoosi furanosidaasi aktiivsusega jne. KEGG rikastamise sõeluuringuga saadi kokku 27 vananemisega seotud rada ja 20 parimat rada kaasati rajale mulldiagramm (vt täiustatud väljaande materjale). Cistanche deserticola aeglustab vananemist.

Tabel 3 Cistanche deserticola toimeained

Tabel 4: Cistanche deserticola peamised eesmärgid vananemise edasilükkamiseks

See hõlmab peamiselt vähi radu, neurosekretoorseid süsteeme ja signaaliülekande radu. Vähirajad hõlmavad peamiselt eesnäärmevähki, rinnavähki ja muid teid; neuroendokriinne süsteem hõlmab östrogeeni signaalirada, GnRH signaaliülekande rada ja insuliini signaalirada (insuliini signaaliülekande rada) ja nii edasi; signaaliradade hulka kuuluvad fosfatidüülinositool 3-kinaas-valgukinaas B (PI3K Akt) signaalirada ja fosfolipaas D signaalirada (fosfolipaas D signaalirada).

3.5 Ravimaterjalid-komponendid-sihtmärgid-teede võrgustiku ehitamine

Cistanche deserticola aktiivsed koostisosad, sihtmärgid ja vananemist aeglustavad rajad kaardistati tarkvara Cytoscape 3.8.{5}} kaudu meditsiinilise materjali-koostisosa-sihtmärgi raja võrgustikku. Selles võrgus on kokku 114 sõlme ja 218 rida (vt täiustatud avaldamismaterjali).

3.6 Cistanche deserticola mõju nematoodide elueale

Toksilisuse testi tulemused on näidatud joonisel 1. Võrreldes kontrollrühmaga Cistanche deserticola 25 ja 50 ug·mL–1

See võib pikendada nematoodide eluiga. 100 ug·mL–1 ei oma ilmset mõju. 200 ja 500 ug·mL–1

Sellel on nematoodidele teatav mürgisus ja see lühendab nende eluiga. Toksilisuse testi tulemuste põhjal valige

N2 nematoodide eluea määramiseks manustati Cistanche deserticola massikontsentratsioonides 25, 50, 75 ja 100 ug·mL–1. Tulemused on toodud tabelis 5. Võrreldes kontrollrühmaga, Cistanche deserticola 25, 50, 75 ug·mL–1

Nematoodide eluiga rühmas pikenes märkimisväärselt, nii et järgnevad katsed viidi läbi 25, 50 ja 75 ug·mL-1 juures.

Joonis 1 Nematoodide ellujäämiskõver pärast Cistanche deserticola erinevate massikontsentratsioonide manustamist

• Legend:

• Punane: kontrollrühm
• Sinine: Cistanche 25 µg·mL⁻¹ rühm
• Roheline: Cistanche 50 µg·mL⁻¹ rühm
• Lilla: Cistanche 100 µg·mL⁻¹ rühm
• Oranž: Cistanche 200 µg·mL⁻¹ rühm
• Pruun: Cistanche 500 µg·mL⁻¹ rühm

• Teljed:

• Y-telg: ellujäämismäär (%)

• X-telg: aeg (t/d)

  
  

3.7 Cistanche deserticola mõju nematoodide stressivõimele

H2O2-indutseeritud oksüdatiivse stressi tingimustes pikenes kontrollrühmaga võrreldes nematoodide eluiga Cistanche deserticola ravirühmas (joonis 2A). Nematoodide keskmine eluiga kontrollrühmas oli (1,44±0.07) h ja Cistanche deserticola 75 ug·mL – 1. rühma nematoodide keskmine eluiga oli (2.02). ±0.05) h ja eluiga pikenes oluliselt (P<0. 001). Under heat stress conditions, compared with the control group, the heat shock resistance of nematodes in the Cistanche deserticola treatment group was improved and their lifespan was extended (Figure 2B). The average lifespan of nematodes in the control group was (19.25±0.20) h, and that of Cistanche deserticola was 75 The average lifespan of nematodes in the μg·mL–1 group was (22.80±0.08) h, and compared with the control group, the lifespan extension effect was significant (P<0.001).

Tabel 5 Cistanche deserticola erinevate massikontsentratsioonide mõju nematoodide elueale (xˉ±s, n=100)

Märkus.Võrreldes kontrollrühmaga, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

3. 8 Cistanche deserticola mõju lipofustsiini akumulatsioonile ja nematoodide keha paindevõimele

Lipofustsiin koguneb vanusega järk-järgult. Võrreldes kontrollrühmaga vähenesid nematoodide sinise fluorestsentsi tasemed Cistanche deserticola 25, 50 ja 75 ug·mL–1 rühmades vastavalt 15,09%, 28,7% ja 39, 86% võrra. 7. päeval (joonis 3A-B); 11. päeval langesid sinise fluorestsentsi tasemed vastavalt 8,55%, 22,36% ja 36,84%, mis näitab, et Cistanche deserticola inhibeeris lipofustsiini akumuleerumist.

Cistanche deserticola mõju nematoodide keha painutamisvõimele on näidatud joonisel 3C. Võrreldes kontrollrühmaga suurenes nematoodide keha paindeaegade arv Cistanche deserticola 75 ug·mL-1 rühmas 30 sekundi jooksul 3. ja 7. päeval vastavalt 25% ja 36%. 17%, mis näitab, et Cistanche deserticola võib soodustada nematoodide keha paindumist.

3.9 Cistanche deserticola mõju nematoodide neelamisvõimele ja paljunemisvõimele

3. ja 7. päeval ei olnud Cistanche deserticola manustamisrühmas (joonis 4A) võrreldes kontrollrühmaga statistiliselt olulist erinevust nematoodide pumpamise kiiruses (neelupumpade arv 60 sekundi jooksul) (joonis 4A), mis näitab, et Cistanche deserticola ei muutnud N2 nematoodide neelu pumpamise kiirust. Toidu tarbimine, Cistanche deserticola poolt vahendatud pikaealisuse mõjud ei sõltu toitumispiirangutest. Ravimiga töödeldud nematoodide munade (joonis 4B) ja järglaste arvus (joonis 4C) võrreldes kontrollrühmaga olulisi muutusi ei toimunud, mis näitab, et Cistanche deserticola ei mõjutanud nematoodide paljunemisvõimet.

3.10 Cistanche deserticola mõju ROS-ile, MDA sisaldusele ja antioksüdantsete ensüümide aktiivsusele

Äge stressitoksilisus põhjustab ROS-i taseme tõusu. Nagu on näidatud joonistel 5A ja 5B, vähenes nematoodide ROS-i akumulatsiooni tase Cistanche deserticola rühmas kontrollrühmaga võrreldes 7. manustamispäeval oluliselt (P<0.05, P<0.01, P<0.001). In order to explore the effect of Cistanche deserticola on the endogenous antioxidant defense ability of nematodes, the activity of antioxidant enzymes in nematodes was measured. Compared with the control group, the SOD, CAT, and GSH-Px activities of nematodes in the Cistanche deserticola 25, 50, and 75 μg·mL–1 groups were significantly increased (Figure 5C~E). MDA is an important biomarker of lipid peroxidation. Compared with the control group, the MDA level in nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced (P<0.05, Figure 5F). The above results show that Cistanche deserticola can effectively alleviate oxidative stress in nematodes.

• Legend:

• Punane: kontrollrühm
• Sinine: Cistanche 25 µg·mL⁻¹ rühm
• Roheline: Cistanche 50 µg·mL⁻¹ rühm
• Lilla: Cistanche 100 µg·mL⁻¹ rühm
• Oranž: Cistanche 200 µg·mL⁻¹ rühm
• Pruun: Cistanche 500 µg·mL⁻¹ rühm

3.11 Cistanche deserticola mõju vananemisega seotud geenide mRNA ekspressioonile

Insuliini (IIS) signaalirada 20 parima KEGG analüüsitud raja hulgas on tihedalt seotud C. elegansi vananemisega ja mehhanismide uurimine on suhteliselt küps [10], mis kinnitab vananemisega seotud geenide ekspressiooni insuliini signaaliülekande rajal. C. elegansis vabanevad insuliinitaolised peptiidid (ILP-d) seonduvad oma retseptoriga DAF-2 ja aktiveerivad arenenud glükoosi lõpp-produkti -1 (AGE-1), mis aktiveerib veelgi proteiinkinaasi B{{ 7}}/2 (Akt-1/2). , fosforüülides transkriptsioonifaktorit DAF{11}}, mille tulemuseks on DAF{12}} aktiivsus ja

Selle migreerumine tuuma on pärsitud [11]. Nagu on näidatud joonisel 6, on DAF-2, AGE-1 ja Akt-1 mRNA ekspressioonitasemed nematoodides Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 võrreldes kontrollrühmaga. rühm vähenes oluliselt (P<0.05, P<0.01) , the expression level of DAF-16 mRNA was significantly increased (P<

0.01). Näidati, et Cistanche deserticola vahendatud eluiga pikendav toime sõltub IIS-i signaaliülekande rajast. Sir-2.1 geen mängib olulist rolli füsioloogilistes tegevustes, nagu nematoodide vananemine, stress ja apoptoos. Geeni sir-2.1 ekspressiooni ülesreguleerimine pikendab nematoodide eluiga [12], kuid pärast ravimi manustamist see ei avalda mõju. Muutis oluliselt SIR-2 väljendustaset. 1 mRNA (joonis 6). HSF-1 ja SKN-1 mängivad olulist rolli C. elegansi oksüdatiivse stressi ja vananemise reguleerimisel [11]. Tulemused näitasid, et võrreldes kontrollrühmaga oli Cistanche deserticola 75 ug·mL–1

HSF-1, HSP-16 väljendustasemed. 1, HSP-16. 2 ja SKN-1 mRNA C. elegansi rühmas suurenesid oluliselt (joonis 6). Transkriptsioonifaktorid DAF-16/forkhead box protein (FOXO) ja SKN-1/nukleaarse transkriptsioonifaktori E2-seotud faktor 2 (Nrf2) on aktiveeritud ja võivad reguleerida paljusid antioksüdantidega seotud geene. valgud [13]. Võrreldes kontrollrühmaga on nematoodide SOD-3, GST-4, CTL-1, CTL-2 ja MTL-1 mRNA ekspressioonitasemed Cistanche deserticola 75 ug·mL-1 rühm suurenes märkimisväärselt, mis näitab, et Cistanche deserticola võib suurendada antioksüdantide võimet. pikendada oma eluiga. Toitumise piiramine võib parandada mitokondriaalset funktsiooni ja pikendada eluiga, piirates toidu tarbimist [14]. EAT-2 mRNA ekspressioonis ei ilmnenud statistiliselt olulist erinevust nematoodides igas rühmas, mis näitab, et Cistanche deserticola poolt vahendatud eluiga pikendav toime ei ilmne toitumispiirangu raja kaudu (joonis 6).

Joonis 4 Cistanche deserticola mõju nematoodide neelamisvõimele ja paljunemisvõimele (xˉ±s, n=5)

Legend:

• 对照组: kontrollrühm
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: Cistanche 25 ug/ml rühm
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组: Cistanche 50 ug/mL rühm
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: Cistanche 75 ug/mL rühm

Graafik B:

• 30 s内水平游泳距离/次: Horisontaalne ujumisdistants 30 sekundiga / aeg
• 第3日: 3. päev
• 第7日: 7. päev

Graafik C:

• 相关水平的百分率: vastava taseme protsent
• 第7日: 7. päev
• 第11日: 11. päev

Graafik A:

• 60 s内爬壁次数: seinatõusude arv 60 sekundi jooksul
• 第{{0}}日: 0. päev
• 第3日: 3. päev
• 第7日: 7. päev

Graafik B:

• 广泛测试得分: avatud välikatse tulemus
• 第1日: 1. päev
• 第2日: 2. päev
• 第3日: 3. päev
• 第4日: 4. päev
• 第5日: 5. päev

Graafik C:

• 千元迷宫次数: Y-labürindi vead
• 第1日: 1. päev
• 第2日: 2. päev
• 第3日: 3. päev
• 第4日: 4. päev
• 第5日: 5. päev

3. 12 Cistanche deserticola mõju nematoodide elueale koos seotud geenimutantidega

Võrreldes kontrollrühmaga oli geenimutantsete nematoodide daf{{0}}, skn-1 ja hsf-1 eluea kõver Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 rühmas. ei nihku pärast ravi oluliselt paremale (joonis 7A~C). Söönud -2 geenimutantsete nematoodide keskmine eluiga pikenes 16,45% (P < 0,001, joonis 7D).

Tulemused näitasid, et Cistanche deserticola poolt vahendatud eluiga pikendav toime oli seotud geenidega daf-16, hsf-1 ja skn-1, kuid mitte geeniga eat-2 .

3. 13 Cistanche deserticola mõju DAF-16 ja SKN-1 valkude tuuma translokatsioonile

Tüüpilised pildid DAF{0}} valgu ekspressioonist tsütoplasmas, rakkudevahelises ruumis ja tuumas on näidatud joonisel 8A. Võrreldes kontrollrühmaga oli pärast Cistanche deserticola manustamist DAF-16 valgu tuuma lokaliseerimise suhe nematoodidel oluliselt suurenenud ja tsütoplasmaatiline lokalisatsiooni suhe oluliselt vähenenud (P<0.05, P<0.01, P<0.001, Figure 8C). Representative pictures of SKN-1 protein expression in the cytoplasm and nucleus are shown in Figure 8B. Compared with the control group, the proportion of SKN-1 protein localized in the cytoplasm of nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced, while the proportion of nuclear localized protein was significantly increased (P<0.05, Figure 8D).

Joonis 5 Cistanche deserticola mõju ROS-ile, MDA sisaldusele ja antioksüdantsete ensüümide aktiivsusele nematoodidel (xˉ±s, n=100)

Legend:

• 对照组: kontrollrühm
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: Cistanche 25 ug/ml rühm
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组: Cistanche 50 ug/mL rühm
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: Cistanche 75 ug/mL rühm

Graafik B:

• 30 s内水平游泳距离/次: Horisontaalne ujumisdistants 30 sekundiga / aeg
• 第3日: 3. päev
• 第7日: 7. päev

Graafik C:

• 相关水平的百分率: vastava taseme protsent
• 第7日: 7. päev
• 第11日: 11. päev

Graafik A:

• 60 s内爬壁次数: seinatõusude arv 60 sekundi jooksul
• 第{{0}}日: 0. päev
• 第3日: 3. päev
• 第7日: 7. päev

Graafik B:

• 广泛测试得分: avatud välikatse tulemus
• 第1日: 1. päev
• 第2日: 2. päev
• 第3日: 3. päev
• 第4日: 4. päev
• 第5日: 5. päev

Graafik C:

• 千元迷宫次数: Y-labürindi vead
• 第1日: 1. päev
• 第2日: 2. päev
• 第3日: 3. päev
• 第4日: 4. päev

• 第5日: 5. päev

  
  

3. 14 Cistanche deserticola mõju SOD-3, GST-4 ja HSP-16.2 valgu ekspressioonile nematoodides

SOD-3, GST-4 ja HSP-16.2 valgu ekspressioonitasemed visualiseeriti ja kvantifitseeriti, kasutades vastavalt transgeenseid nematoode CF1553, CL2166 ja TJ375 (joonis 9). Võrreldes kontrollrühmaga suurenesid SOD-3 ja GST-4 valgu ekspressioonitasemed nematoodides igas Cistanche deserticola massikontsentratsiooni rühmas (P<0.05, P<0.01, P<0.001). The HSP-16.2 protein expression level of nematodes in Cistanche deserticola 50 and 75 μg·mL–1 groups was significantly increased (P<0.01, P<0.001).