Cistanche Deserticola vananemisvastased funktsionaalsed tegurid ja mehhanism

[Abstraktne] Eesmärk: Et uuridavananemisvastased funktsionaalsed teguridning söödava ja raviaine toimemehhanismCistanche deserticolapõhinevad võrgufarmakoloogial jain vivomudelorganismi katsedCaenorhabditis elegans. meetodid: peamiste komponentide potentsiaalsed sihtmärgidC. deserticola ennustasid traditsioonilise hiina meditsiini süsteemide farmakoloogia andmebaas ja analüüsiplatvorm (TCMSP), SwissTargetPrediction, GeneCards, online Mendelian Heritance in Man (OMIM) ja muud andmebaasid. Prognoositud sihtmärgid sisestati STRING võrguanalüüsi platvormi, et saada aktiivsete komponentide ja haiguse sihtmärkide valgu-valgu interaktsiooni (PPI) võrk, et välja sõeluda põhilised sihtmärgid. Toimimisradade ennustamiseks ja analüüsimiseks kasutati Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedia (KEGG) radade rikastamise analüüsi ning Cytoscape konstrueeris ravimiaktiivse komponendi-sihtradade võrgustiku.C. elegansjagati tühjaks rühmaks jaC. deserticolaerineva kontsentratsiooniga rühmad. Eluiga, paljunemisvõime ja treenimisvõimeC. elegansvaadeldi otse. Superoksiiddismutaasi (SOD), katalaasi (CAT), glutatioonperoksidaasi (GSH-Px) aktiivsus ning malondialdehüüdi (MDA) ja reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) sisaldus veresC. elegansmäärati komplekti testiga. Eluea ja stressivõime muutustega seotud geenide ekspressiooni määramiseks kasutati reaalajas kvantitatiivset polümeraasi ahelreaktsiooni (qRT PCR).C. elegans. Tulemused: potentsiaalsed funktsionaalsed tegurid võivad mõjutada75vananemisega seotud eesmärgid ja8põhilised sihtvalgud, sealhulgas kuumašoki valk HSP90- (HSP90AA1), östrogeeni retseptor (ESR1), GTPaasi HRas (HRAS), protrombiin (F2), maatriksi metalloproteinaasid-2 (MMP2), heksokinaas-2 (HK2), sahharaas-isomaltaas (SI) ja maltaas-glükoamülaas (MGAM) sõeluti topoloogiaanalüüsiga. KEGG analüüs näitas, et Cistanche deserticola võib segada27vananemise edasilükkamiseks rajad, sealhulgas östrogeeni signaalirada, vähi signaalirada, GnRH signaalirada ja insuliini signaaliülekande rada.Cistanche deserticolavõib oluliselt pikendada keskmist ellujäämisaega ja parandada oksüdatiivse stressi võimetC. elegans, suurendavad SOD, CAT ja GSH-Px aktiivsust ning vähendavad ROS ja MDA akumuleerumist ningdaf-2javanus-1vähenesid, samas kui ekspressioondaf-16ja selle allavoolu sihtgeenid (mätas-3, mtl-1, gst-4,ctl-1jactl-2) suurendati, samutiskn-1ja kuumašokiga seotud geenid (hsf-1, hsp-16.1jahsp-16.2). Järeldus: Võrgufarmakoloogiat kasutatakse võimaliku mehhanismi selgitamiseksC. deserticolavananemisvastases valdkonnas ja see on seda tõestanudC. deserticolavõib pikendada eluigaC. elegansja tugevdada stressivastast võimet. Mehhanism võib olla seotud insuliini signaaliraja pärssimisega ja allavoolu transkriptsioonifaktorite aktiveerimisega.daf-16ja kuumašokiga seotud geenid, suurendades seeläbi oksüdatiivse stressi võimetC. elegans.

Märksõnad:Cistanche deserticola YC Ma; vananemisvastane; funktsionaalsed tegurid; mehhanism; oksüdatiivne stress

75% GLÜKOSIIDSUSEGA TASTANŠEKSTRAKT

Cistanche deserticola YC Maon minu kodumaal väärtuslik traditsiooniline Hiina ravim. Seda tuntakse kui "kõrbe ženšenni". See salvestati esmakordselt "Shen Nongi Materia Medicas" ja on loetletud kõrgeima klassina. See maitseb magusalt, soolaselt, oma olemuselt soojalt ning naaseb neerude ja jämesoole meridiaanidesse. Traditsiooniline hiina meditsiin usub, et sellel on neeru-yangi toitev, essentsi ja verd täiendav toime, soolestikku niisutav ja lahtistav toime[1]

. 2018. aastal kanti Cistanche deserticola (kõrb) "Traditsiooniliselt nii toidu- kui ka hiina meditsiinimaterjalide ainete kataloogi" [2] ja selle väärtust tervisetoodeteks arendamisel on tunnustatud. Statistika kohaselt on Cistanche deserticola esinemissagedus vananemisvastaste ja eluiga pikendavate retseptide hulgas ženšenni järel teisel kohal [3]. Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud näitavad, et Cistanche deserticolal on märkimisväärsed antioksüdandid, vananemisvastased, väsimusevastased, mälu parandavad ja muud toimed [4], kuid selle funktsionaalsed tegurid ja vananemisvastane mehhanism on endiselt ebaselged. Caenorhabditis elegans (edaspidi nematood) on selge geneetilise tausta, suhteliselt lühikese eluea, kiire paljunemise ja hõlpsa kultiveerimisega mitmerakuline organism. Eluea pikenedes ilmneb sellel inimesele sarnane vananemisfenotüüp. C. elegansi geenid, valgud ja signaalirajad on inimestel väga konserveerunud.

Sellel on 60–80% homoloogia inimese geenidega. Viimastel aastatel on nematoodi laialdaselt kasutatud traditsioonilise hiina meditsiini ja loodusmeditsiini vananemisvastastes uuringutes [5]. Selles uuringus kasutatakse võrkfarmakoloogia meetodeid, et ennustada Cistanche deserticola toimeaineid, sihtmärke ja signalisatsiooniteid vananemise edasilükkamisel; kasutades nematoodi mudelorganismidena, jälgides nende eluiga, paljunemist ja muid üldnäitajaid, mõõdetakse oksüdatiivse stressi muutusi, liikumisvõimet ja nende seost elueaga. teave seotud tervise kohta

Esitage viide tervisetoodete väljatöötamiseks ja rakendamiseks.

1 Materjal

1. 1 Instrumendid

SMZ-168 stereomikroskoop (firma Motic); CKX41 ümberpööratud faasikontrastsusega fluorestsentsmikroskoop (firma Olympus); Multiskan FC mikroplaadilugeja (teadusfirma Thermo Fisher); Mycycler polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) geenivõimendi, MJ Mini™ fluorestsentsi kvantitatiivne PCR instrument (Bio-Rad Company).

1. 2 Testi ravimit

Cistanche deserticola koguti Xinjiangis Yutiani maakonnas asuvast Cistanche deserticola hea põllumajandustava (GAP) istutusbaasist. Tianjini Farmaatsiauuringute Instituudi teadur Zhang Tiejun tuvastas selle nimetusega Cistanche deserticola YC Ma; 2',7'-diklorodihüdrofluorestseiini dietüülhappe ester (DCFH DA), 2% NaN3 (Sigma Company); Trizol reaktiiv, cDNA sünteesikomplekt, SYBR Green Kit (Takara Bioengineering Co., Ltd.); superoksiidi dismutaasi (SOD) komplekt, katalaasi (CAT) komplekt, glutatioonperoksidaasi (GSH Px) komplekt, malondialdehüüdi (MDA) komplekt (Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.); fluorestsents-kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon (qRT PCR) Vajalikud praimerid sünteesis Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd. ja praimerite järjestused on näidatud tabelis 1.

1.3 Nematoodid

Katses kasutatud 10 erinevat geneetilist tüüpi nematoodi olid kõik Caenorhabditise geneetikakeskusest. Üksikasjalik teave on näidatud tabelis 2.

2 Meetod

2.1 Cistanche deserticola funktsionaalsete tegurite ja sihtmärkide sõelumine

Kirjanduse läbivaatamisel ja selle uurimisrühma varasema Cistanche deserticola materjalirühma iseloomustuse kombineerimisel sõeluti välja peamised keemilised komponendid ja verekomponendid [{{0}}]. Joonistage ühendi struktuur ChemDraw 19.0 tarkvaras, sisestage see SwissTargetPredictioni andmebaasi (http://new.swisstargetprediction.ch/) ja kasutage virtuaalse skriiningu tulemuste saamiseks pöördfarmakofoori sobitamise meetodit. Samal ajal kasutati traditsioonilise hiina meditsiini süsteemi farmakoloogia andmebaasi ja analüüsi platvormi (TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php). Kasutage UniProtKB otsingufunktsiooni UniProti andmebaasis (http://www.uniprot.org/) ja läbi vaadatud

Swiss-Prot filtreerib valgud, piirab liigi "inimeseks" ja korrigeerib ühendi sihtvalgu geeninime järgi. Ühendite potentsiaalse sihtraamatukogu saamiseks integreerige kahe andmebaasi sihttulemused.

2.2 Vananemisega seotud eesmärkide prognoosiv analüüs

Kasutage GeneCardsi (https://www.genecards.org/) ja OMIM-i (https://omim.org/) andmebaase, et otsida märksõnadega "vana, seniilne, decrepit, senescence, feble, caducity", kus GeneCards Genes with sõeluti skoor 10% või suurem, kahe andmebaasi tulemused liideti, dubleerivad geenid elimineeriti ja lõpuks saadi vananemisega seotud sihtmärgid. Seejärel ühendage punkti 2.1 funktsionaalsete tegurite sihtmärgid ülalnimetatud vananemisega seotud sihtmärkidega, võtke ristmik ja joonistage Venni diagramm.

2.3 Valgu ja valgu interaktsiooni (PPI) võrgustiku loomine

Sisestage saadud ristmiku sihtmärk andmeplatvormi STRING 11.5 (http://string-db.org/), piirake liikide hulka "Homo sapiens", interaktsiooni skoori kõrgeim usaldustase on 0,900, ja hankige PPI-võrk. Salvestage andmed TSV-vormingus ja importige need Cytoscope'i

3. 8.0 tarkvara, kohandage sõlme suurust ja värvisügavust kraadi väärtusega, et saada Cistanche deserticola toimeainete ja haiguse sihtmärkide PPI võrgustik. Põhisihtmärkideks valiti punktid, mille kolm parameetrit astme, vahelise ja läheduse parameetrid olid kõik mediaanist suuremad, ja pärast sõelumist saadi kokku 8 põhisihtmärki.

2. 4 Geeniontoloogia (GO) bioanalüüs ja Kyoto geenid ja geenid

Rühmade entsüklopeedia (KEGG) raja rikastamise analüüs kasutab OmicsBeani andmebaasi (http://www.omicsbean.cn/login/), et teostada GO funktsionaalset analüüsi ja KEGG raja rikastamise analüüsi ristumisobjektidel, sorteerida P väärtuse järgi, ja analüüsige saadud teid.

2.5 Ravimaterjalid-komponendid-sihtmärgid-teede võrgustiku ehitamine

Importige meditsiinilised materjalid, komponendid, sihtmärgid ja rajad tarkvarasse Cytoscope 3.8.{2}}, et luua Cistanche deserticola ravimmaterjalide komponentide sihtmärkide radade võrgustik.

2.6 Nematoodikultuur

Nematoodid kultiveeriti 20 kraadi juures, kasutades NGM söödet (mis sisaldas 0,750 g NaCl, 0,625 g trüptooni ja 4,250 g agarit 250 ml topeltdestilleeritud vees). Steriliseeritud Escherichia coli OP50 (65 kraadi, 45 min) kasutati toiduallikana ja jaotati ühtlaselt NGM söötme pinnale. Kasutage nematoodide sünkroonimiseks lüüsilahust (5% NaClO, 5 mol·L–1 NaOH) ja kultiveerige sünkroniseeritud nematoodid L4 staadiumis 20-kraadises inkubaatoris. L4 staadiumis nematoodid valiti juhuslikult ja jagati katsete jaoks erineva massikontsentratsiooniga kontrollrühma (NGM sööde) ja Cistanche deserticola manustamisrühmadesse.

2.7 Ravimite valmistamine

Võtke 10 g Cistanche deserticola ravimainet, lisage destilleeritud vesi vastavalt materjali ja vedeliku suhtele 1:10, keetke püstjahutiga ja ekstraktige kaks korda, iga kord 2 tundi, ühendage veeekstraktid, filtreerige ja kontsentreerige kuivaks. vähendatud rõhk. Kasutage steriilset destilleeritud vett, et valmistada emalahus massikontsentratsiooniga 50 mg·mL–1 (toorravimi koguse alusel). Kasutage NGM söödet, et valmistada hilisemaks kasutamiseks lahused lõpliku massikontsentratsiooniga 0, 25, 50, 75, 100, 200 ja 500 ug·mL–1.

2.8 Toksilisuse test

N2 nematoodid viidi üle Petri tassidele, mis sisaldasid erinevat massikontsentratsiooni Cistanche deserticola (0, 25, 50, 100, 200, 500 ug·mL–1), igas rühmas 100 ug. Manustamispäevaks loeti päev 0. Vahetage värsket ravimit sisaldavat söödet iga päev ja registreerige nematoodide hukkumine, et saada Cistanche deserticola ohutu annustamisvahemik.

2.9 Stressikatse

N2 nematoodid kanti rakkudesse, mis sisaldasid erinevat massikontsentratsiooni Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 ug·mL–1)

) Petri tassis, 100 igas rühmas. Ravimi manustamise päevaks loeti päev 0. Värsket ravimit sisaldavat söödet vahetati iga päev. Ravimi manustamise 7. päeval viidi läbi stressikatse. Oksüdatiivse stressi katses viidi iga rühma nematoodid üle NGM söötmesse (iga 10 ml NGM söötmele lisati 10 μL 30% H2O2) ja nematoodide ellujäämine registreeriti iga 30 minuti järel. Kuumusestressi katses eksponeeriti nematoodid pidevalt temperatuurile 35 kraadi ja kultiveeriti ning nematoodide ellujäämise staatus registreeriti iga 2 tunni järel.

2. 10 Keha painutamise katse

Võtke N2 nematoodid, rühmitage need ja manustage sama ravi nagu punktis 2.9. 3. ja 7. päeval pärast ravimi manustamist viidi läbi keha painutamise katse. Igast rühmast võeti 20 nematoodi ning tuvastati ja registreeriti nematoodide keha paindumise arv 30 sekundi jooksul.

2. 11 Neelupumba katse

Võtke N2 nematoodid, rühmitage ja manustage neid samadel tingimustel nagu 2.9, pange igasse Petri tassi 1 nematoodi ja seadke iga massikontsentratsiooni jaoks 5 paralleeli. Jälgige stereomikroskoobi all manustamispäeval 0, 3 ja 7. Nematoodide neelamissagedust jälgiti iga kord 60 sekundi jooksul ja registreeriti neelupumpade arv.

2.12 Paljunemiskatse

Võtke L1 staadiumis N2 nematoodid ja asetage need ravimisöötmesse ja kasvatage neid L4 staadiumis. Seejärel viige need iga päev uude erineva massikontsentratsiooniga ravimit sisaldavasse söötmesse ja mõõtke nematoodide munetud munade arv. Vanad mune sisaldavad plaadid asetati peale. Pärast 48-tunnist kultiveerimist 20 kraadi juures määrati järglaste arv. Igas Petri tassis on 1 nematoodi ja iga massikontsentratsiooni jaoks on seatud 5 paralleeli.

2.13 Lipofustsiini akumulatsiooni määramine

Võtke N2 nematoodid, rühmitage ja manustage sama ravi nagu punktis 2.9, igas rühmas 100 nematoodi. Lipofustsiini mõõtmise katsed viidi läbi ravimi manustamise 7. ja 11. päeval. 35 nematoodi valiti juhuslikult ja asetati 2% agaroosilehtedele, anesteseeriti 2% NaN3-ga ja kasutati fluorestsentsmikroskoopi (ergastusvalguse lainepikkus oli 360-370 nm ja kiiratav valgus (lainepikkus: 420-460 nm) Jälgige sinist autofluorestsentsi nematoodis ja kasutage fluorestsentsi intensiivsuse kvantifitseerimiseks tarkvara imageJ 1.51.

2. 14 MDA, ROS sisalduse ja antioksüdantsete ensüümide aktiivsuse määramine

Võtke N2 nematoodid, rühmitage ja manustage sama ravi nagu punktis 2.9, kusjuures igas rühmas on 100 nematoodi. Seitsmendal päeval pärast manustamist pesti iga rühma söötme nematoodid 0,9% naatriumkloriidi lahusega ja koguti 1,5 ml tsentrifuugituubi, homogeniseeriti jääl ja tsentrifuugiti kiirusel 3000 p/min{{ 10}} 10 minutit (tsentrifugaalraadius 42,5 mm), võtke pärast tsentrifuugimist supernatant ja kasutage komplekti, et mõõta SOD, CAT, GSH-Px ja MDA sisalduse aktiivsust. ROS-i määramise katses pesti nematoodi kolm korda M9 puhvriga, asetati DCFH-DA lahusesse lõppkontsentratsiooniga 10 μmol·L–1 ja inkubeeriti 37 kraadi juures pimedas 20 minutit, loksutades iga 5. min. Seejärel peske kaks korda M9 puhvriga ja asetage nematoodid slaidile. Tehke pilte fluorestsentsmikroskoobiga (ergastusvalguse lainepikkus 485 nm, emissioonivalguse lainepikkus 520 nm) ja kasutage fluorestsentsi suhtelise intensiivsuse hindamiseks tarkvara ImageJ 1.51.

2. 15 lagunemist kiirendav tegur -16 (DAF-16), SKN-1 ja SOD-3 tuuma translokatsioon, glutatiooni S-transferaas-4 (GST{{ 8}}), kuumašoki valk-16. 2 (HSP -16. 2) Visualiseerimine vastavalt TJ356 ja LG333 transgeensete nematoodidega DAF-16 ja SKN-1 valgu tuuma translokatsiooni katsete jaoks.

SOD-3, GST-4 ja HSP-16.2 valkude ekspressiooni määramiseks kasutati transgeenseid nematoode CF1553, CL2166 ja TJ375. Rühmitamine ja haldamine on samad, mis punktis 2.9. Seitsmendal päeval pärast ravimi manustamist kasutati igas rühmas nematoodide pildistamiseks fluorestsentsmikroskoopi ja GFP fluorestsentsi intensiivsuse kvantifitseerimiseks kasutati tarkvara ImageJ 1.51.

2. 16 Mutantsete nematoodide eluea määramine

Katsed viidi läbi vastavalt CF1038, EU1, PS3551 ja DA1116 nematoodidega ning need jagati kontrollrühma ja Cistanche deserticola 75 ug·mL-1 manustamisrühma. Nematoodide ellujäämise määra igas rühmas loendati iga päev. 2. 17 qRT-PCR eksperiment: L4 staadiumi N2 nematoodid kanti üle NGM söötmesse (sisaldab 150 μmol·L–1 pentfluorouratsiili), mis sisaldas erinevas massikontsentratsioonis Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 ug·mL–1), 20 Inkubeerida temperatuuril 6 päeva. Kogu RNA nematoodidest ekstraheeriti Trizoli meetodil ja pöördtranskribeeriti cDNA-sse mRNA kvantifitseerimiseks. Andmeid töödeldi 2-ΔΔCt meetodil ja sisemise võrdlusgeenina kasutati act-1.

2. 18 Andmete analüüs

Statistiliseks analüüsiks kasutati SPSS 19.0 tarkvara ja andmed on väljendatud kujul (-x ± s). Rühmade vahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil ja P<0.05 was considered a statistically significant difference.

3. Tulemus

3.1 Cistanche deserticola potentsiaalsed toimeained ja sihtmärgid

Kirjanduse läbivaatamisel ja selle uurimisrühma varasemate uurimistöödega kombineerimisel valiti võrkfarmakoloogia uuringute sihtühenditeks 12 keemilist komponenti, sealhulgas fenüületanoidglükosiidid, iridoidid ja lignaanid. Konkreetne teave on näidatud tabelis 3. Pärast duplikaatide andmebaasist eemaldamist saadi 12 potentsiaalse toimeaine jaoks kokku 86 sihtmärki.