Ribes Meyeri antotsüaniinide vananemisvastane toime neuraalsetele tüvirakkudele ja vananevatele hiirtele 2. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Nar päästab 23M-NSC-de vananevad fenotüübid

R. Meyeri antotsüaniinid on rikkad mitmesuguste flavonoidide ja bioaktiivsete komponentide poolest [1,3-5]. Et teha kindlaks, milline R. Meyeri antotsüaniinide komponent mängib vananemisvastases võitluses olulist rolli, teostasime R. Meyeri metaboolse analüüsi. Meyeri antotsüaniinid. Selgitasime, et Nar võib olla oluline flavonoidne metaboliit, kuna flavonoidide biosünteesirada oli R. Meyeri antotsüaniinidega väga rikastatud (täiendav tabel 1). Nari vananemisvastase toime määramiseks kasutati 23M-NSC-dele erinevaid kontsentratsioone (0, 1,7, 3,4, 6,8, 13,6 ja 27,2 ug/mL) ja CCK{18}} teste. rakkude elujõulisuse uurimine. Nagu on näidatud lisajoonisel 3, suurendas ravi 6,8 ug/mL Nariga rakkude elujõulisust 150 protsenti. Nari vananemisvastase toime edasiseks uurimiseks töödeldi 23M-NSC-sid Nariga ja seejärel tuvastati vananemisega seotud näitajad .hesperidiini kasutamine23M-NSC-des, mida töödeldi 6,8 ug/ml Nariga, vähenes p16nk4a mRNA ekspressioon (joonis 3A). Nar pikendas ka kultiveeritud mNSC-de telomeere ja suurendas DNA sünteesi (joonis 3B, 3C). Nari mõju rakkude proliferatsioonile edasiseks uurimiseks viisime läbi immunofluorestsentsvärvimise Ki67-ga, mis on mitootiliste rakkude tuumaantigeen, mida ekspresseeritakse kogu rakutsükli jooksul, välja arvatud G0 [19,27]. Ravi Nariga suurendas rakkude proliferatsiooni, mõõdetuna Ki67-positiivsete rakkude arvu suurenemise järgi (joonis 3D, 3E). Järgmisena tuvastasime ka NSC-de diferentseerumispotentsiaali neuroniteks. Tõepoolest, 6,8 ug/ml Nar-ravi suurendas ka MAP{18}}positiivsete rakkude arvu (joonis 3F, 3G). Need tulemused näitavad järjekindlalt, et Nar suudab 23M-NSC vananemise ümber pöörata.

Joonis 2. Ribes Meyeri antotsüaniinid parandavad hiire mälu ja õppimisvõimet, suurendades neuraalseid tüvirakke (NSC). (A) Platvormi leidmiseks kulub aega. (B) Esmalt platvormile jõudmiseks kulub aega. (C) Keskmine kiirus platvormi leidmiseks. (D) Ujumiskaugus enne platvormi leidmist. (E. F) Ravi R-ga.kadunud impeerium cistancheiga antotsüaniin suurendas kontrolliga võrreldes neurosfääri arvu ja suurust. (G) R. Meyeri antotsüaniiniga töötlemine hiirtel suurendas neurosfääride arvu kuni 50-100 um. Andmed on esitatud kolme sõltumatu katse keskmisena ± SD. *P<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

Joonis 3. Naringeniini (Nar) mõju hiire neuraalsete tüvirakkude (MNC) vananemisele. (A) p16k4a mRNA ekspressiooni mõõdeti qRT-PCR-ga 23M-NSC-des koos ja ilma ravita 6,8 ug/ml Nariga 48 tundi. (B) 48 tundi Nariga töödeldud 23M-NSC-de rakutsükli faaside jaotus ja kontrollrakud. (C) 23M-NSC-de suhteline telomeeri pikkus suurenes märkimisväärselt Nar-raviga, (D) 48 tundi Nariga töödeldud lihaste immunofluorestsentsvärvimine Ki67 DAPI tuumamärgistusega, (E) (D), (F) esinduslik kvantifitseerimine kultiveeritud mNSC-de MAP2 ja GFAP immunofluorestsentsvärvimise väljad pärast kontrolli ja Nar-ravi. (G) (F) kvantifitseerimine. Andmed on esitatud kolme sõltumatu katse keskmisena ± SD. *P<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Nar parandab vananevate hiirte mälu ja tunnetust

Kognitiivne tase langeb koos vananemisega ja vananemisvastased ravid võivad parandada kognitiivset taset [11, 28]. Nari vananemisvastase toime kontrollimiseks in vivo süstisime vananevatele C57BL/6 hiirtele (12 kuud vanadele) sabaveeni kaudu 20 mg/kg Nari. MWM testi kasutati hiirte ruumilise mälu ja kognitiivsete võimete uurimiseks.mikroniseeritud puhastatud flavonoidfraktsioon 1000 mg kasutusalasid5-päevase korduva koolituse jooksul vähenes Nar-ravi saanud vananevatel hiirtel platvormi leidmiseks kulunud aeg järk-järgult kontrollrühmaga võrreldes (joonis 4A). Testi tulemused näitasid, et platvormile jõudmiseks kuluv aeg vähenes (joonis 4B), samas kui platvormi tsoonis viibimise aeg suurenes (joonis 4C). Lisaks täheldati Nar-ravi saanud vananevaid hiiri platvormi tsoonis sagedamini kui kontrollrühmas (joonis 4D). Need tulemused näitavad koos, et Nar võib parandada vananevate hiirte ruumilist mälu ja kognitiivseid võimeid.

Vananevate hiirte Nar-ravitud vere RNA sekveneerimise analüüs

Nar-spetsiifiliste vananemisvastaste mehhanismide uurimiseks analüüsisime vananevate hiirte Nariga töödeldud vere geeniekspressiooniprofiili, kasutades RNA sekveneerimist (RNA-seq). Tulemused näitasid 1961 erinevalt ekspresseeritud geeni (DEG). Üldiselt vähendas Nar geeniekspressiooni ja ainult väike arv geene oli ülesreguleeritud võrreldes töötlemata kontrollrühmaga (joonis 5A, 5B). Lisaks olid vananemisega seotud olulised signaaliraja geenid alareguleeritud, eriti need, mis asuvad TNF signaalirajal (joonis 5C).oteflavonoidNeed tulemused viitavad sellele, et Nar mõjutab TNF signaaliülekande rada, mõjutades seega põhjalikult TNF-a funktsiooni, mis on seotud vananemisega seotud kognitiivsete häiretega [29, 30]. Seetõttu uurisime TNF-i taset hiirte plasmas. Ensüümiga seotud d immunosorbentanalüüside (ELISA) tulemused

Joonis 4. Naringeniin (Nar) parandab vananevate hiirte mälu ja õppimisvõimet. (A) Nar-ravi saanud vananevate hiirte põgenemislatentsus oli kontrollrühmaga võrreldes lühem. (B) Aeg, mis kulus esmalt platvormile jõudmiseks, oli Nar-ravi saanud vananevatel hiirtel lühem kui kontrollrühmal. (C) Perrooni tsoonis viibitud aja kestus. (D) Nar-ravi saanud vananevate hiirte platvormi tsoonis täheldamise sagedus võrreldes kontrollrühmaga. Andmed on esitatud kolme sõltumatu katse keskmisena ±SD.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

Cistanche on vananemisvastane toime

ARUTELU

Vananemine on seotud kognitiivse languse suurenenud riskiga, samuti õppimis- ja mäluvõime langusega [22,23]. Neuronaalne kadu ja neurogenees on tihedalt seotud vanusega seotud aju düsfunktsiooniga [11-13]. Seega on neuronite arvu suurendamine ja neurogeneesi parandamine vananemisvastase ravi jaoks üliolulised. Flavonoidide ja teiste bioaktiivsete ainete rikkal taimel R. Meyer [1, 3-6] on palju funktsioone, mida pole veel kirjeldatud. Käesolevas uuringus soodustasid R. Meyeri antotsüaniinid NSC proliferatsiooni ja suurendasid ühtlase morfoloogiaga neurosfääride teket. R. Meyeri antotsüaniinravi parandas ka rakkude vananemise fenotüüpi, vähendades ROS-i ja vananemisega seotud P16nk4 geeniekspressiooni taset, suurendades DNA sünteesi faasi ja pikendades telomeere.puritaanid c-vitamiinLisaks näitasid immunofluorestsentsvärvimise tulemused, et R Meyeri antotsüaniinid stimuleerisid neuronite moodustumist. Need tulemused viitavad sellele, et R. Meyeri antotsüaniinidel on mNSC-dele vananemisvastane toime ja need võivad samuti otseselt soodustada neuronite teket in vitro. Lisaks on kognitiivne langus tihedalt seotud vananemisega [22, 23]. Meie MWM tulemused näitasid, et R. Meyeri antotsüaniinide maosisene manustamine parandas vananevatel hiirtel ruumimälu ja õppimisvõimet ning suurendas ka

Figure 5. Tumor necrosis factor(TNF)-a plays an essential role in naringenin (Nar)-mediated anti-aging effects. (A) Summary of gene expressions in mouse blood, as determined by RNA-seq. (B)Heatmap showing differentially expressed genes (DEGs) in the blood between control and Nar-treated mice. DEGs were identified by a fold change of >2.0 või<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

Metaboolse analüüsi kasutamine R. Meyeri antotsüaniinide spetsiifilise koostise uurimiseks näitas, et Nar võib olla oluline flavonoidi metaboliit. Varem on teatatud, et Nar leevendab müokardirakkude vananemist [31], parandab sooletrakti metaboolset võimekust [32] ning avaldab põletikuvastast [33] ja vähivastast [34] toimet. Nari mõju NSC-dele vananemise ajal jääb siiski teadmata. R. Meyeri antotsüaniinide vananemisvastase toime uurimiseks viisime läbi täiendavad uuringud, kasutades Narit. Ravi 6,8 ug/ml Nariga suurendas rakkude elujõulisust, vähendas P16ink4a geeniekspressiooni, pikendas telomeere ja soodustas NSC diferentseerumist neuroniteks in vitro. Nari mõju edasiseks hindamiseks rakkude proliferatsioonile viisime läbi immunofluorestsentsuuringud. Tulemused näitasid, et Nar-ravi suurendas nii Ki67-positiivsete rakkude arvu kui ka MAP{12}}positiivsete rakkude osakaalu, mis viitab sellele, et Nar võib soodustada neurogeneesi. Lisaks hinnati vananevatel hiirtel ka Nari mõju õppimisele ja mälule. MWM-testi tulemused näitasid järjekindlalt, et Nar-ravi suurendab vananevate hiirte ruumilist eraldumist. Huvitaval kombel näitas RNA-seq analüüs, et Nar võib mõjutada vananemist TNF-i signaaliraja kaudu, eriti vähendades TNF-a ekspressiooni vananevate hiirte veres. ELISA testid näitasid ka, et Nar-ravi vähendas plasma TNF-a taset võrreldes vananevate kontrollhiirtega. TNF-a on TNF-i signaaliülekande raja võtmetegur ja on tihedalt seotud kognitiivse vananemisega. Selle funktsioonid hõlmavad patoloogiliste muutuste soodustamist hipokampuse sünapsides [29] ja prekursorrakkude proliferatsiooni pärssimist [35]. Muutunud TNF tasemed on seotud kognitiivsete häiretega depressiooni, skisofreenia, bipolaarse häire ja Alzheimeri tõve korral [30, 36, 37]. Täpsemalt, TNF-a on Alzheimeri tõvega patsientidel ülesreguleeritud [38].

Kokkuvõttes näitab meie uuring, et R. Meyeri antotsüaniinid parandavad NSC-de vananemise mõju Nari kaudu, mis vähendab TNF-a taset in vivo ja parandab kognitsiooni vananevatel hiirtel. Kokkuvõttes annavad meie leiud uudse strateegia kliiniliste ravimeetodite väljatöötamiseks, mille eesmärk on R. Meyeri antotsüaniinide meditsiinilise väärtuse suurem realiseerimine.

MATERJALID JA MEETODID

Katseloomad

Selle uuringu kiitis heaks Tongji ülikooli loomahoolduskomitee ja see viidi läbi vastavalt institutsionaalsetele juhistele. R. Meyeri antotsüaniine manustati intragastraalselt 2 kuud 12-kuu vanustele hiirtele, keda hoiti C57BL/6 taustal. Nar süstiti sabaveeni 1-kuuks kuni 12- kuu vanustele hiirtele, keda hoiti C57BL/6 taustal. Kontrollhiirtele anti sama kogus fosfaatpuhverdatud soolalahust (PBS).

R. Meyeri antotsüaniinide ja Nari valmistamine

R. Meyeri puuvili (500 g) homogeniseeriti koehomogenisaatoriga ja suspendeeriti 1 l metanoolis, mis sisaldas 0,1 protsenti vesinikkloriidhapet. Ultraheli ekstraheerimine viidi läbi kolm korda 30 minuti jooksul toatemperatuuril. Ekstraktid ühendati ja metanool kontsentreeriti alandatud rõhul, et saada R Meyeri ekstraktid. Antotsüaniinisisalduse suurendamiseks puhastati ekstrakti täiendavalt makropoorse AB-8 vaiguga.

Naringeniin (C15H1205; MW: 272,25; puhtus: suurem või võrdne 98 protsenti; HPLC klass) osteti ettevõttest Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd. (Sichuan, Hiina) ja seda säilitati 2 kraadi juures {{6 }} kraadi kuivas valguseta keskkonnas. Põhilahuse kontsentratsioon oli 100 mM dimetüülsulfoksiidis (DMSO). DMSO lõppkontsentratsioon ei ületanud söötmes 0,1 protsenti.

Neurosfääri ja diferentseerumise testid

NSC-d saadi hiire SVZ-st. Hiired surmati pärast anesteesiat ja SVZ lõigati hoolikalt lahti ja dissotsieeriti üksikuteks rakkudeks 0,4 U/mL papaiiniga (Imogen, Alexandria, VA, USA; kat. nr: LS003126). NSC-d kanti 10 cm tassidele, mis sisaldasid 10 ml NSC põhisöödet koos 10 ng/ml EGF-iga (PeproTech, Cranbury, NJ, USA; kat. nr: AF-100-15) ja 10 ng/ml FGF-iga (PeproTech, Cranbury, NJ , USA; kat nr:AF-100-18B). Neurosfäärid läbiti iga 5 päeva järel. Värskelt dissotsieerunud neurosfääride NSC-d külvati laminiinile (Gibco, Gaithersburg, MD, USA; kat. nr 23017015) ja polü-L-ornitiinvesinikbromiidile (Poly-L; Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA ; Cat nr: P3655) kaetud klaasklaasid NSCBasalMediumis ilma diferentseerivate toidulisanditeta. Diferentseeritud rakud immunovärviti Tu1 (beeta-tubuliin II; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA; kat. nr: 480011), MAP2 (Thermo Fisher Scientific, kat. nr: MA5-12826) ja gliiafibrillaarse happelise valgu suhtes. (GFAP; Thermo Fisher Scientific, kat. nr PA5-16291) ja seejärel värviti 4'6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI; Thermo Fisher Scientific, kat. nr: D1306). Slaide uuriti Olympus BX53 mikroskoobiga (Olympus, Madison, WI, USA). TuJ1- ja MAP2-positiivsete rakkude kvantifitseerimine viidi läbi kolme sõltumatu katse märgistatud rakkude loendamisega. Statistiline analüüs viidi läbi paaritu t-testi abil.

See artikkel on välja võetud saidilt www.aging-us.com AGING 2020, Vol. 12, nr 17