MRNA vaktsiin kutsub esile STING-sõltuva kasvajavastase immuunvastuse

Abstraktne

Lipiididega formuleeritud RNA vaktsiine on laialdaselt kasutatud haiguste ennetamiseks ja raviks, kuid nende toimemehhanism ja üksikud komponendid, mis sellistele toimingutele kaasa aitavad, tuleb veel piiritleda. Siin näitame, et protamiini / mRNA südamikust ja lipiidkestast koosnev terapeutiline vähivaktsiin on väga tõhus tsütotoksiliste CD8þ T-rakkude reaktsioonide soodustamisel ja kasvajavastase immuunsuse vahendamisel. Mehhaaniliselt on I tüüpi interferoonide ja põletikuliste tsütokiinide ekspressiooni täielikuks stimuleerimiseks dendriitrakkudes vaja nii mRNA südamikku kui ka lipiidkest. Interferoon-b ekspressiooni stimuleerimine sõltub eranditult STING-st ja defektse Stingi geeniga hiirtel on mRNA vaktsiini kasvajavastane toime oluliselt häiritud. Seega kutsub mRNA vaktsiin esile STING-sõltuva kasvajavastase immuunsuse.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

1. Sissejuhatus

MRNA vaktsiinide kiire väljatöötamine ja ülemaailmne rakendamine SARS-CoV-2 nakkuse ennetamiseks on näidanud mRNA-põhiste ravimite võimsust tervishoius1,2. Suure molekulmassi ja negatiivse laengu tõttu tuleb mRNA molekulid imetajate rakkudesse tõhusaks sisenemiseks pakendada kohaletoimetamisvahenditesse. Nanomeetri suurustesse kohaletoimetamisvahenditesse pakkimisel on ka mRNA molekulide kaitsmine ensümaatilise lagunemise eest. Eesmärgi jaoks on välja töötatud mitu kohaletoimetamisplatvormi, nagu lipiidide nanoosakesed4, lipopolüpleks (LPP)5, liposoom-protamiin-RNA (LPR)6, RNA lipopleks (RNA-LPX)7 ja viirusetaoline vaktsiiniosake (VLVP) )8. Kuigi igal platvormil on oma ainulaadne struktuur ja koostis, sisaldab enamik vehiikleid ioonse lipiidimolekuli, mis hõlbustab mRNA pakkimist ja mRNA molekulide väljapääsu endosoomidest. Profülaktiliste vaktsiinide edu tõttu on üldine arusaam, et mRNA-ravi saab kasutada võib-olla enamiku, kui mitte kõigi haigustüüpide9e12 raviks. Tõepoolest, mRNA-põhiseid terapeutilisi vähivaktsiine on uuritud juba aastaid13,14. Hiljutised edusammud kliinilistes uuringutes on näidanud ka nende rakenduspotentsiaali valitud vähipatsientidel15e17. Erinevalt peptiidvähivaktsiinidest, mis on valmistatud adjuvantmolekulidega18e20, võivad mRNA vaktsiini osakesed toimida ka iseadjuvantidena21.

Näiteks võib kahekomponendiline mRNA-põhine vähivaktsiin, mis sisaldab vaba ja protamiinikompleksiga mRNA-d, aktiveerida ka teemaksulaadse retseptori 7 (TLR7) signaaliülekande22. Arvestades aga kasvavat muret palja mRNA ägeda kaasasündinud immuuntoksilisuse pärast, kasutab enamik uurijaid ja ettevõtteid modifitseeritud RNA-d, et vältida TLR-ide kaasasündinud äratundmist23. Järelikult mängivad lipiidkomponendid olulist rolli adjuvandi aktiivsuse suurendamisel mRNA vaktsiiniosakeses, eelistatavalt aktiveerides mitte-TLR signaaliülekande. Hiljutine uuring lipiidide koostisega negatiivse laenguga RNA-LPX kohta, mis koosneb 1,2- dioktadetsenüül-3-trimetüülammooniumi (DOTMA, katioonne lipiid) / dioleoüülfosfatidüületanoolamiini (DOPE, abilipiid) liposoomist, näitas. interleukiin 1 (IL1)-interleukiin 1 retseptori antagonisti (IL-1 ra) telje aktiveerimine põletikueelsete tsütokiinide sekretsiooni reguleerimisel ja oluline roll kaheetapilise põletikuraja aktiveerimisel monotsüütides24. Huvitav on see, et teine ​​hiljutine uurimus LNP-põhise BNT162b2 kohta, mis on valmistatud koos ALC-0315 (ioniseeritud lipiid), 1,2-distearoüül-sn-glütsero-3-fosfokoliiniga (DSPC, abilipiid) , polüetüleenglükool-2000-N, N-ditetradetsüülatseetamiid (PEG2000-DTA) ja kolesterool näitasid võtmerolli I tüüpi interferoonist sõltuva MDA5 signaaliülekande aktiveerimisel, kuid mitte TLR-ide ega põletikuliste protsesside stimuleerimisel. COVID-19 vaktsiini kaasasündinud ja adaptiivne immuunsus25. Need uuringud viitavad võimalusele, et muutuvatest lipiidimolekulidest koosnevad manustamisplatvormid võivad vaktsiini aktiivsuse jaoks tugineda erinevatele signaaliülekande radadele. Seega on mRNA teraapia edasiseks parandamiseks oluline täielikult uurida võtmemolekulide ja nende kombinatsioonide funktsiooni.

Käesolevas uuringus koostasime katsed üksikute komponentide funktsionaalse rolli lahkamiseks terapeutilises vähivaktsiinis. mRNA vaktsiiniosake (MVP) koosneb protamiini/mRNA tuumast, mis on kapseldatud lipiidkestasse, mis koosneb katioonsest lipiidist, abistavast lipiidist, pegüleeritud lipiidist ja kolesteroolist (joonis 1A). On näidatud, et laetud lipiidide lisamine võib hõlbustada suunatud RNA kohaletoimetamist26 ning dioleoüületüülfosfatidüülkoliin (EDOPC) ja dioleoüül-3- trimetüülammooniumpropaan (DOTAP) on kaks katioonset lipiidi, mida on sel eesmärgil testitud5,27. Uurisime interferoon-b (IFN-b), IL-1b ja tuumori nekroosifaktori-a (TNF-a) ekspressiooni stimuleerimist mRNA tuuma, mRNA-vaba kandja ja kogu MVP poolt ning korreleerisid sellised tegevused TLR7, mitokondriaalse viirusevastase signaalimise (MAVS, tuntud ka kui IPS-1), IFN-geenide stimulaatori (STING) ja TIR-domeeni sisaldava adapteriga, mis indutseerib IFN-b (TRIF) signaaliülekande. Seejärel uurisime protamiini rolli tuumas ja katioonsete lipiidide rolli kestas IFN-b ja TNF-a ekspressiooni stimuleerimisel. Lõpuks võrdlesime kasvajavastaseid immuunvastuseid MVP-st metsiktüüpi ja geenist väljalangenud hiirtel.

Cistanche tubulosa-Antitumor eelised

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Materjalid

1,2-Dioleoüül-sn-glütsero-3-etüülfosfokoliin (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoüül-sn-glütsero-3-fosfatidüületanoolamiin (DOPE) (850725) ), 1,2-distearoüül-sn-glütsero-3-fosfoetanoolamiin-N-[amino(polüetüleenglükool)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoüül-3-trimetüülammooniumpropaan (DOTAP) (890890), 1,2- dioleoüül-sn-glütsero-3-fosfokoliin (DOPC) (850375) osteti ettevõttelt Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, AL, USA). Kolesterool (C8667) saadi firmalt Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). Reagendid lahustati etanoolis kontsentratsiooniga 2 mg/ml DSPE-PEG2k jaoks, 10 mg/ml kolesterooli ja DOPC jaoks ning 20 mg/ml EDOPC, DOPE ja DOTAP puhul. Protamiinsulfaat (P4020) saadi firmalt Sigma Aldrich. ovalbumiini (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (eGFP mRNA) (L-7201) ja lutsiferaasi (Luc-mRNA) (L-7204) kodeerivad mRNA molekulid osteti ettevõttelt TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, USA). RNaasivaba vesi (W0805-010) saadi ettevõttest GeneDEPOT (Baker, TX, USA). TLR7 agonist imikvimood (tlrimq) ja Stingi agonist 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) olid Invivogeni (San Diego, CA, USA) tooted. Lipofectamine 2000 (11668019) ja Quant-iT™ RiboGreen™ RNA analüüsikomplekt (R11490) osteti firmast Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Rekombinantne hiire GM-CSF (554586) osteti ettevõttelt BD Biosciences (San Diego, CA, USA). 500 valgu transporteri inhibiitori kokteil (00-4980-93) oli Invitrogeni toode. Cytofix/Cytoperm komplekt (AB_2869010) osteti ettevõttelt BD Biosciences. EasySep™ hiire T-rakkude eraldamise komplekt (19851) saadi ettevõttest STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). Järgmised antikehad saadi ettevõttest BioLegend (San Diego, CA, USA): anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) ja anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643) ja anti-CD{105}}PE (121406). Anti-CD{108}}FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979) ja anti-IFN-g-PE (554412) pärinesid ettevõttest BD Biosciences. OVA257e{120}}MHCI dekstrameerPE (JD2163) osteti ettevõttelt ImmuDex (Fairfax, VA, USA). ELISA komplektid IL-1b (EM2IL1B) ja TNF-a (BMS607-3) jaoks osteti ettevõttest Invitrogen ning ELISA komplektid CCL5 (DY478) ja IFN-b (DY8234) jaoks saadi ettevõttest R&D Systems , Inc. (Minneapolis, MN, USA). Antikehad Western blot analüüsi jaoks, sealhulgas anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), anti-fosfo-TBK1 (5483), anti-b-actin (4970) ja anti-GAPDH (5174) osteti ettevõttelt Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).

Joonis 1. mRNA osakeste valmistamine ja iseloomustamine. (A) Vaktsiiniosakeste valmistamise skemaatiline vaade. (B) Agaroosgeeli elektroforees näitab, et mRNA molekulid säilisid proovi laadimissüvendis mRNA/protamiiniga vahekorras 1:1 kuni 1:2 valmistatud proovides. (CeF) mRNA vaktsiiniosakeste (MVP-de) iseloomustus kapseldamise protsendi, polüdisperssuse indeksi, zeta potentsiaali ja suuruse põhjal. (G) MVP2 osakeste tüüpilised TEM-kujutised, skaala riba Z 50 nm. (H) eGFP ekspressiooni protsent pärast seda, kui DC2.4 rakke töödeldi eGFP-MVP-dega 16 tundi. (I) eGFP-d ekspresseerivate DC2.4 rakkude fluorestsentskujutis, skaala riba Z 400 mm. (J) Kvantitatiivne analüüs bioluminestsentsi kohta BMDC-des, mida on töödeldud MVP-dega, mis on kapseldatud lutsiferaasi kodeeriva mRNA-ga 16 tundi. (K) PBS-i, mRNA-vaba kandja, mRNA/protamiini tuuma või mRNA-sse kapseldatud MVP2-ga töödeldud BMDC-de elujõulisuse muutused. Ravi kontsentratsioonid olid mRNA-ga samaväärsed. Andmed on esitatud keskmise SEM-na (n Z 3). *P < 0,05; **P < 0,01.

2.2. Rakuliinid ja rakukultuur

Hiire dendriitrakuliin DC2.4 saadi ATCC-st (Manassas, VA, USA) ja seda kultiveeriti RPMI-1640-s, mis sisaldas 10% veiseloote seerumit (FBS) ja 1% penitsilliini-streptomütsiini. Hiire melanoomi rakuliin B16-OVA saadi Dr. Kenneth Rockilt, Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, USA). B16-OVA rakke kasvatati DMEM-is, millele oli lisatud 10% FBS-i ja 1% penitsilliini-streptomütsiini. Hiire käärsoole adenokartsinoomi rakuliin MC38 osteti ATCC-st. Rakud konstrueeriti OVA ekspressiooniga ja neid kultiveeriti DMEM-is 10% FBS-i ja 1% penitsilliini-streptomütsiiniga. Rakukultuuri hoiti 37 °C juures 5% CO2-ga.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

2.3. mRNA vaktsiiniosakeste valmistamine

Kõik mRNA vaktsiini osakesed valmistati, kasutades NanoAssemblr Benchtop mikrofluidiseadet firmalt Precision Nanosystems, Inc. (Vancouver, BC, CAN), segades orgaanilist faasi ja vesifaasi. Orgaanilise faasi valmistamiseks lahustati etanoolis EDOPC (20 mg/ml), DOPE (20 mg/ml), kolesterool (10 mg/ml) ja bis-DSPE-PEG2k (2 mg/mL) ja segati 34 °C juures. :30:35:1 M suhe voolukiirusega 9 ml/min. Vesifaasi mRNA tuuma valmistamiseks segati mRNA mikrofluidinstrumendis protamiinsulfaadiga vahekorras 1:1 (mass/mass) voolukiirusel 9 ml/min. Pärast 20-minutilist inkubeerimist 20 °C juures segati mRNA vesifaasi tuum orgaanilise faasiga, et tekitada mRNA vaktsiiniosakesed. 20 minuti pärast kanti vaktsiiniosakeste suspensioon Amiconi ultratsentrifugaalfiltrisse (MWCO 30 kDa) ja lisati 9-mahus molekulaarse puhtusega vett, et lahjendada etanooli kontsentratsiooni 25%-lt 2,5%-le. Seejärel kontsentreeriti osakeste suspensioon tsentrifuugimisega 2000 g juures (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) temperatuuril 4 °C. Kontsentreeritud produktile lisati võrdne kogus 2 ui PBS-i, et reguleerida osmootset rõhku.

2.4. Geeli aeglustumise test

MRNA / protamiini südamikku analüüsiti kõigepealt geeli aeglustuse abil. Lühidalt, mRNA/protamiini südamik, mis sisaldas 0,5 mg mRNA-d, laaditi 1% agaroosgeeli süvendisse 1 TBE lahuses ja elektroforees viidi läbi 120 V juures 30 minutit (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). RNA ribad värviti Gelrediga (Biotium, Hayward, CA) ja tuvastati GelDoc süsteemiga (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. mRNA vaktsiiniosakeste iseloomustus

Suuruse jaotust ja zeta potentsiaali mõõdeti dünaamilise valguse hajumise Zetasizeriga (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, USA). Kapseldamise kiirus määrati Quant-iT™ RiboGreen™ RNA analüüsikomplekti abil. Lühidalt, vaktsiiniosakeste proovi, mis sisaldas 0,5 mg mRNA-d, lahjendati TriseEDTA puhvriga (10 mmol/L TriseHCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,5) koos 2% Triton-X100-ga või ilma selleta. {10}}kaevuplaat. Pärast 10-minutilist inkubeerimist 37 °C juures lisati igasse süvendisse RiboGreen ja mõõdeti fluorestsentsi intensiivsust. Kapseldamise efektiivsus arvutati, nagu on näidatud võrrandis. (1): Vaktsiiniosakeste transmissioonelektronmikroskoopia (TEM) viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatud protseduurile9.

2.6. Loomad

Kõik loomadega tehtud operatsioonid kiitis heaks Houstoni metodistihaigla loomade hooldamise ja kasutamise komitee (protokolli number AUP06200042). Hiiri hoiti keskkonnas, mis vastas täielikult riikliku terviseinstituudi ja Ameerika laboratoorsete loomade hooldamise ühingu standarditele. Metsiktüüpi C57BL/6J hiired ja geneetiliselt muundatud hiired, sealhulgas Tlr7 /, Sting /, Mavs / ja Trif / hiired, osteti ettevõttest Jackson Laboratory.

2.7. Hiire luuüdist pärinevate dendriitrakkude (BMDC) genereerimine

Luuüdi rakud loputati reieluust ja sääreluust välja täieliku RPMI 1640-ga. Punased verelibled lüüsiti ACK lüüsipuhvriga ja ebaküpseid luuüdi rakke kultiveeriti RPMI 1640-s, millele oli lisatud 20 ng/ml rekombinantset hiire GM-CSF-i 10 minutit. päeva 37 C juures 5% CO2-ga. Rakukultuuri söödet värskendati 3., 6. ja 8. päeval ning mittekleepuvad dendriitrakud koguti 10. päeval.

2.8. Tsütokiinide ja kemokiinide mõõtmine

BMDC-d külvati 24-süvendi plaadile tihedusega 5  105 rakku süvendi kohta. Pärast 1-tunnist settimist töödeldi rakke 1 mg/ml imikvimoodiga, 20 mg/ml 20 30 -cGAMP-ga (1 mg/mL mRNA ekvivalent) vaktsiiniosakeste või kontrollidega. Rakukultuurisöötmed koguti 24 tundi hiljem ning TNF-a, CCL5, IFN-b ja IL-1b tasemeid mõõdeti ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) komplektide abil, järgides tootja soovitatud protseduure.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

2.9. Alalisvoolu transfektsiooni, alalisvoolu küpsemise ja stimulatsiooni analüüsid

DC-transfektsiooni efektiivsuse analüüsimiseks in vitro külvati DC2.4 rakud 25 105 rakku süvendi kohta 24-süvendiga plaadile. Rakke töödeldi eGFP-d või lutsiferaasi kodeerivate mRNA-ga kapseldatud osakestega lõppkontsentratsioonis 1 mg mRNA/ml. Rakud koguti 24 tundi hiljem, pesti 2% FBS-ga PBS lahuses ja seejärel resuspendeeriti samas lahuses, enne kui neid kasutati voolutsütomeetria analüüsiks BD LSR II voolutsütomeetriga (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA). . DC küpsemise ja antigeeni esitluse in vitro mõõtmiseks külvati BMDC-d 25  105 rakku/süvend 24-süvendiga plaadile ja töödeldi 1 mg/ml OVA-MVP-ga 24 tundi. BMDC-sid värviti 30 minutit CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 ja CD86 suhtes spetsiifiliste antikehadega DC küpsemise jaoks ning anti-H-2Kb (SIINFEKL) antigeeni esitlemiseks. Stimuleeriva tugevuse määramiseks in vivo vaktsineeriti C57BL/6J hiiri üks kord 10 mg OVA-MVP-ga hiire kohta jalapadjas ning 24, 48 koguti tühjenevad popliteaalsed LN-d ja järgnevad rakupinna markerid: CD11c, MHC I, CD11b, B220. , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Voolutsütomeetria analüüsid T-rakkude aktivatsiooni ja proliferatsiooni kohta

T-rakkude aktivatsiooni in vivo mõõtmiseks vaktsineeriti hiiri üks kord 10 mg OVA-MVP-ga ja popliteaalsed LN-d eraldati 24 või 48 tunni pärast. T-rakud värviti järgmiste antikehadega: CD45, CD3, CD4, CD8 ja CD69. Antigeenispetsiifiliste T-rakkude tuvastamiseks koguti 5 päeva pärast teist vaktsineerimist kasvajad, põrn ja popliteaalsed lümfisõlmed. Kudesid töödeldi üherakuliste suspensioonide saamiseks ja rakud värviti T-raku-spetsiifiliste antikehade ja OVA257e264-MHCI dekstrameeriga, järgides tootja juhiseid. Intratsellulaarse IFN-g taseme mõõtmiseks stimuleeriti 2  106 splenotsüüte või popliteaalsetest LN-dest ja kasvajatest eraldatud rakke 10 mg/ml OVA257e264 peptiidiga täielikus RPMI 1640 söötmes, millele oli lisatud 55 mmol/l b-merkaptoetanooli ja 1 valgu transporterit. kokteil 18 tundi. Rakud koguti ja värviti T-raku-spetsiifiliste antikehadega. Pärast fikseerimist ja permeabiliseerimist Cytofix/Cytoperm komplektiga värviti rakud IFN-g-vastase antikehaga ja kanti analüüsimiseks BD LSR II voolutsütomeetril (BD Biosciences). T-rakkude proliferatsiooni mõõtmiseks eraldati T-rakud OT-I transgeensete hiirte põrnadest, kasutades hiire T-rakkude isolatsioonikomplekti. Neid värviti 1 mmol/l CFSE-ga RPMI 1640-s, mis sisaldas 200 mg/ml BSA-d, 10 minutit temperatuuril 37 °C. CFSE-ga märgistatud T-rakke pesti kaks korda 5 mahuosa külma täieliku RPMI 1640-ga. Vahepeal töödeldi küpseid BMDC-sid 2 mg/ml OVA mRNA-ga kapseldatud MVP 24 tundi enne T-rakkude eraldamist. Kui T-rakud olid valmis, kultiveeriti BMDC-d ja T-rakke koos vahekorras 1:5 (DC:T) 72 tundi. Rakud koguti ja värviti T-rakkude pinnaantikehadega, proliferatsiooni testiti BD LSR II voolutsütomeetriga (BD Biosciences) ja analüüsiti. Kõiki voolutsütomeetria tulemusi analüüsiti FlowJo v10 tarkvaraga (Ashland, OH, USA).

2.11. Valgu ekspressiooni jälgimine elusatel hiirtel

BALB/c hiiri töödeldi jalapadjasisese süstimisega 10 mg Luc mRNA-ga kapseldatud MVP-ga. Neile süstiti intraperitoneaalselt 30 mg RediJect D-lutsiferiini hiire kohta 6, 12, 24 või 48 tundi hiljem ja bioluminestsentsi mõõdeti Xenogen IVIS-200 pildisüsteemiga (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, USA).

2.12. ELISpoti analüüs

IP-filtriplaate loputati eelnevalt 50 ml 35% etanooliga ja pesti põhjalikult 3 korda PBS-ga, enne kui etanool aurustus. Seejärel kaeti plaadid öö läbi temperatuuril 4 °C anti-IFN-g püüdmisantikehadega. Plaadid blokeeriti RPMI 1640 täissöötmega, mis sisaldas 55 mmol/L b-merkaptoetanooli, 2 tundi temperatuuril 37 °C. Rakud (1  105 splenotsüüdid, 1  105 rakud popliteaalsest LN-st) külvati igasse süvendisse ja stimuleeriti 36 tundi 10 mg/ml OVA257e264 peptiidiga. Sööde visati ära ja rakke pesti 4 korda PBST-ga (PBS, mis sisaldas 0,05% Tween 20) ja kaks korda PBS-ga. Pärast viimast pesemist lisati IFN-g-vastane tuvastamisantikeha ja inkubeeriti 2 tundi toatemperatuuril pimedas. Plaate pesti 4 korda PBST-ga ja kaks korda PBS-ga ning lisati avidiin-HRP ja inkubeeriti veel 45 minutit toatemperatuuril pimedas. Lõpuks pesti plaate uuesti PBST ja PBS-ga, nagu ülalpool kirjeldatud, ning kanti peale 50 ml AEC substraati ja jälgiti punktreaktsiooni. Kui laigud ilmusid nähtavale, peatati reaktsioon, visates AEC substraadi ära ja loputades seda 5 korda topeltdestilleeritud veega. Pärast üleöö õhu käes kuivatamist skaneeriti plaate ja analüüsiti, kasutades CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa{32}}, CTL Inc., Cleveland, OH, USA).

2.13. Western blot analüüs

Koguti metsiktüüpi, Mavs KO või Sting KO hiirtelt saadud BMDC-d ja rakud lüüsiti RIPA rakulüüsipuhvris, millele oli lisatud proteaasi ja fosfataasi inhibiitoreid. Valgu kontsentratsioon rakulüsaadis mõõdeti BCA valguanalüüsi komplektiga. Valguproovid eraldati naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga (SDS-PAGE) ja kanti üle polüvinülideendifluoriidi (PVDF) membraanile. MAVS-i ja STING-i ekspressioon tuvastati pärast membraani inkubeerimist MAVS-i või STING-vastase antikehaga lahjenduses 1:2000, millele järgnes immuuntuvastus SuperSignal West Pico ja Femto-kemiluminestsentssubstraadiga. STING raja aktivatsiooni mõõtmiseks töödeldi metsiktüüpi hiirtelt saadud BMDC-sid vehiikuliga või OVA mRNA-ga kapseldatud MVP-ga näidatud kontsentratsioonil 2 tundi. Rakud lüüsiti ja viidi läbi Western blot analüüs anti-TBK1 ja anti-fosfo-TBK1 antikehadega lahjenduses 1:2000.

2.14. Kasvajavastane analüüs

Hiire kasvajamudelid genereeriti 2  105 rakkude B16-OVA melanoomirakkude või 5  105 MC38-OVA rakkude inokuleerimisel hiire kohta subkutaanselt vasakusse külge 6 kuni {{5} }nädalased emased C57BL/6J hiired. Hiired jaotati juhuslikult ravirühmadesse ja neid töödeldi kaks korda 7-päevase vahega 10 mg OVA MVP-ga või kontrollidega jalapadjas. Kasvaja kasvu jälgiti iga 2 päeva järel. Kasvaja maht arvutati vastavalt võrrandile. (2):

Hiired surmati 5 päeva pärast teist vaktsineerimist ja registreeriti kasvajakudede kaal.

2.15. Statistiline analüüs

Kõik tulemused on esitatud keskmise SEM-ina. Statistikat hinnati ühesuunalise ANOVA testiga, kasutades mitme grupi võrdlemiseks Tukey korrektsiooni ja kahe rühma võrdlemiseks paaritu kahepoolset t-testi. Andmeid analüüsiti GraphPad Prism v8.{6}}.2 tarkvaraga. P < 0.{{10}}5 peeti statistiliselt oluliseks (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Tulemused

3.1. MVP vahendab tugevat mRNA ekspressiooni dendriitrakkudes (DC)

Valmistasime tuumakesta vaktsiiniosakesed kaheetapilises mikrofluidilises lähenemisviisis (joonis 1A) ja hindasime süstemaatiliselt nanoosakeste üksikuid komponente, et koguda vaktsiiniosake, millel on kõrge stabiilsus, kõrge raku omastatavus ja kõrge ekspressioonipotentsiaal DC-des. Geelelektroforees näitas, et stabiilne mRNA südamik võib moodustuda, kui mRNA ja protamiini suhe oli 1 või alla selle (joonis 1B). Kasutades asendusmarkerina eGFP-d kodeerivat mRNA-d, leidsime, et lipiidide koostis molaarsuhtega 34% EDOPC/30% DOPE/35% kolesterooli/1% DSPEPEG2k tagas ideaalse kapseldamise kiiruse ja parima ekspressioonitõhususe (tabel 1, Toetav teave joonis S1AeS1D). Laengusuhte muutmine ei muutnud oluliselt osakeste kapseldamise kiirust, polüdisperssuse indeksit ega pinnalaengut (tabel 2, joonis 1CeE); Saadud osakeste läbimõõt oli aga vahemikus 70 kuni 80 nm, kui suhe oli vahemikus 12 kuni 16, võrreldes diameetriga 120 kuni 130 nm, kui suhe langes vahemikust välja (joonised 1F ja G). Parim ekspressioon tuvastati MVP2-ga töödeldud DC2.4 rakkudes, mille laengu suhe oli 12 (joonis 1H ja I). Sarnast mustrit täheldati ka siis, kui osakesed valmistati lutsiferaasi kodeeriva mRNA-ga ja tuvastati annusest sõltuv ekspressioon (joonis 1J). MRNA-ga kapseldatud osakesed näitasid soovitavat stabiilsust, kuna nad ei kaotanud aktiivsust pärast lüofiliseerimist või külmutamist-sulatamist (joonis S1E ja S1F). Lisaks ei ilmnenud tsütotoksilisust pärast luuüdist pärinevate dendriitrakkude (BMDC) töötlemist ainult mRNA tuumaga, ilma mRNA molekulideta valmistatud kandjaosakesega või mRNA-d sisaldava MVP2-ga (joonis 1K). Seega näitas MVP2 parimat ekspressioonipotentsiaali. Seda kasutati kõigis uuringu edasistes katsetes ja ülejäänud tekstis märgiti MVP-ks. MVP osakesed võivad tõhusalt toimetada mRNA molekule in vivo ja ei olnud tuvastatavat toksilisust mRNA-ga kapseldatud MVP-st, mis põhineb kehakaalu muutustel (joonis S1GeS1I).

3.2. MVP indutseerib tõhusalt antigeeni esitlust ja T-rakkude aktivatsiooni in vitro ja in vivo

Valmistasime ette mRNA südamiku, mRNA-vaba kandja ja OVA mRNA-ga kapseldatud MVP ning rakendasime neid alalisvoolu küpsemise ja antigeeni esitluse testimiseks (joonis 2A). MVP-ga töödeldud BMDC-d näitasid alalisvoolu küpsemise markerite, sealhulgas CD40, CD80 ja CD{5}} annusest sõltuvat üleekspressiooni (joonis 2BeD). Töötlemine kas mRNA-vaba kandja või mRNA-sse kapseldatud MVP-ga vallandas MHC I üleekspressiooni (joonis 2E), mis näitab, et mõju oli seotud pigem kandja kui mRNA kompleksiga. Lisaks andis MVP-ravi tulemuseks OVA257e264 antigeeni epitoobi-MHC I kompleksi (SIINFEKL-MHC I) kuvamise rakupinnal, mis tuvastati SIINFEKL-MHCI-vastase antikehaga (joonis 2F), mis näitab tõhusat antigeeni töötlemist ja esitlemist BMDC-de poolt. . Lisaks MVP-ga töödeldud BMDC-de koosinkubeerimine B3Z-ga, CD8þ T-rakuliiniga, mis tuvastas spetsiifiliselt OVA257e264 epitoopi, või OVA257e264-spetsiifilist T-rakku ekspresseeriva OT-I hiire põrnast eraldatud T-rakkudega. retseptor, vallandas IL-2 sekretsiooni – tulemust ei täheldatud T-rakkudes, mida inkubeeriti ainult vehiikuliga töödeldud DC-dega või ainult mRNA/protamiini tuumaga (joonis 2G). Voolutsütomeetria analüüs tuvastas pärast MVP-ga koosinkubeerimist 32,5% proliferatiivseid CD8þ T-rakke (joonis 2H ja I). OVA mRNA-ga kapseldatud MVP osakesi kasutati ka hiirte raviks intradermaalse süstimise teel. Rakkude uurimine dreneerivates lümfisõlmedes näitas CD86 ekspressiooni pidevat suurenemist nii klassikaliste DC-de (CD8þ DC, CD11bþ DC, CD103þ DC) kui ka plasmatsütoidsete DC-de (pDC) seas esimese 48 tunni jooksul, mis näitab alalisvoolu stimuleerimist. küpsemine (joonis 2J). Ravi soodustas ka CD8þ T-rakkude rikastumist lümfisõlmedes koos CD69þCD8þ T-rakkude populatsiooni olulise suurenemisega (joonised 2K ja L), mis näitab T-rakkude aktiveerumist ravi poolt. T-rakkude aktiveerimise määramiseks kogusime rakud äravoolu lümfisõlmedesse 3, 5 või 7 päeva pärast MVP-ravi ja teostasime ELISpot analüüsid pärast rakkude nakatamist OVA257e264 antigeenpeptiidiga (tugiteave joonis S2). MVP-ravi vallandas selle aja jooksul IFN-g-d sekreteerivates rakkudes suure hüppe, aktiivsuse maksimum saavutas 5. päeval (joonis 2M). Need tulemused näitasid tugevat alalisvoolu stimuleerimist, antigeeni esitlust ja T-rakkude aktiveerimist pärast MVP-ga töötlemist.

Tabel 1 eGFP-d kodeeriva mRNA-ga kapseldatud nanoosakeste koostis.

Tabel 2MVP lipiidide koostis ja laengu suheosakesed.

3.3. MVP kutsub esile tugeva kasvajavastase immuunsuse kolorektaalse kasvaja ja melanoomi hiiremudelites

MVP-d kasutati MC38 käärsoolevähi ja B16 melanoomiga hiirte raviks. Mõlemas mudelis blokeeris ravi OVA mRNA-ga kapseldatud MVP-ga kaks korda täielikult kasvaja kasvu subkutaanselt; Võrdluseks, ravi eGFP mRNA kapseldatud MVP või vehiikuliga üksi ei avaldanud tuvastatavat inhibeerivat toimet kasvaja kasvule (joonis 3AeD, tugiteave joonis S3). Kooskõlas lümfisõlmede CD4-st CD8-le nihke mustriga (joonis 2) täheldasime OVA mRNA-ga kapseldatud MVP-ga ravitud hiirte kasvajate CD8þ/CD4þ T-rakkude suhte suurenemist (joonis 3E). Lisaks tuvastasime IFN-gþCD8þ T-rakkude kõrgenenud tasemed põrnades, lümfisõlmedes ja kasvajates hiirtel, keda raviti OVA mRNA-ga kapseldatud MVP-ga, kuid mitte ainult kandja või GFP mRNA-ga kapseldatud MVP-ga (joonis 3FeH, tugiteave). joonis S4). Lisaks suurenes OVA mRNA-ga kapseldatud MVP-ravirühma kasvajates oluliselt OVA257e264-MHCI dekstrameer-positiivsete CD8þ T-rakkude arv, mis näitab antigeenispetsiifiliste CD8þ T-rakkude proliferatsiooni (joonis 3I). ELISpot test põrnadest ja lümfisõlmedest eraldatud rakkudega toetas T-rakkude aktiveerimist (joonis 3JeM).

3.4. MVP stimuleerib kaasasündinud immuunvastuseid, aktiveerides STING-sõltuva signaaliülekande

Me kasutasime BMDC-de raviks mRNA südamikku, mRNA-vaba kandjat ja mRNA-ga kapseldatud MVP-d, et tuvastada I tüüpi IFN-i ja põletikuliste tsütokiinide ekspressiooni stimuleerimise eest vastutavad võtmetegurid ja -teed. Huvitaval kombel oli MVP sama tugev kui Tlr7 agonist imikvimood IFN-b sekretsiooni vallandamiseks ja vehiikul üksi näitas samuti aktiivsust IFN-b sekretsiooni soodustamisel, kuigi selle tugevus ei olnud nii kõrge kui MVP; aga mRNA tuum üksi oli IFN-b sekretsiooni stimuleerimisel ebaefektiivne (joonis 4A). Tulemus viitas sellele, et IFN-b ekspressiooni maksimeerimiseks oli vaja nii mRNA-d kui ka vehiikulis olevaid komponente. Vahepeal näitasid imikvimood ja vehiikul sarnast aktiivsust TNF-a ja IL-1b ekspressiooni soodustamisel, samas kui MVP oli palju tugevam kui kumbki neist (joonised 4B ja C). CCL5, tsütokiini, mida tavaliselt seostatakse NF-kB ja IFN regulatoorsete teguritega, ekspressioon stimuleeriti võrdselt rakkudes, mida töödeldi imikvimoodiga, ainult vehiikuliga või MVP-ga (joonis 4D). TLR7, MAVS, STING ja TRIF on võtmetegurid peamistes signaaliülekande radades, mis vahendavad raku vastuseid viiruse RNA-le ja kahjustatud DNA28e30-le. IFN-b ja TNF-a ekspressiooni uurimiseks genereerisime hiirtelt BMDC-d, kellel oli Tlr7, Mavs, Sting või Trif geeni väljalülitamine (KO) ja töödeldi rakke mRNA tuumaga, mRNA-vaba kandjaga või mRNA-ga kapseldatud MVP-ga.

Joonis 2 Immuunvastuste stimuleerimine MVP abil. (A) Skemaatiline vaade mRNA / protamiini tuumast, mRNA-vabast kandjast ja täielikust MVP-st. (BeD) BMDC-de küpsemine pärast 24-tunnist OVA-MVP-ga töötlemist. (E ja F) MHC I ekspressioon ja OVA257e264 antigeeni epitoop-MHC I kompleks BMDC-des pärast 24-tunnist OVA-MVP-ga töötlemist. (G) IL-2 tase töödeldud BMDC-dest, mida inkubeeriti koos B3Z või OT-I T-rakkudega. (H ja I) Proliferatiivsete T-rakkude voolutsütomeetria analüüs. Näidatud on T-rakkude tüüpilised kromatogrammid. (J) DC küpsemine pärast MVP-ravi in ​​vivo. C57BL/6J hiiri töödeldi OVA-MVP-ga ja analüüsiti DC-sid popliteaalsetes lümfisõlmedes. (K ja L) T-rakkude populatsiooni analüüs. C57BL/6J hiiri töödeldi vehiikuliga või OVA-MVP-ga ja T-rakke popliteaalsetes lümfisõlmedes analüüsiti voolutsütomeetriaga. (M) ELISpot test. C57BL / 6J hiiri töödeldi OVA-MVP-ga ja lümfisõlmed koguti näidatud ajahetkedel. IFN-g ekspresseerivate rakkude mõõtmiseks kasutati eraldatud rakke. Andmed on esitatud keskmise SEM-na (n Z 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, ei ole oluline.

Joonis 3 MVP kasvajavastane toime. (A) MC38-OVA kasvaja kasvu pärssimine. Emased C57BL/6J hiired inokuleeriti päeval 0 subkutaanselt 5  105 MC38-OVA kasvajarakkudega hiire kohta ja neid raviti PBS-i kontroll-, vehiiklikontrolli-, GFP-MVP- või OVA-MVP-ga. 3. ja 1. päev0. (B) B16-OVA kasvaja kasvu pärssimine. Emased C57BL/6J hiired inokuleeriti päeval 0 subkutaanselt 2  105 B16-OVA kasvajarakkudega hiire kohta ja neid raviti PBS-kontrolli, vehiikulikontrolli, GFP-MVP või OVA-MVP-ga. 3. ja 1. päeval0. (C ja D) B16-OVA kasvajate kujutis ja kaal 17. päeval. (E) T-rakkude populatsioon ravijärgsete hiirte kasvajates. (FeH) IFN-gþCD8þ T-rakud ravijärgsete hiirte põrnades, lümfisõlmedes (LN) ja kasvajates. (I) OVA-spetsiifilised CD8 T-rakud ravijärgsete hiirte kasvajates. (JeM) Ravijärgsete hiirte põrna ja LN-rakkude ELISpot-analüüsi pildid ja kvantitatiivne analüüs. Andmed on esitatud keskmise SEM-na (n Z 5). *P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001.

Mavsi ja Stingi KO staatust BMDC-des kinnitati Western blot analüüsiga (tugiteave joonis S5A). Üllataval kombel kustutas Sting KO IFN-b sekretsiooni stimuleeriva aktiivsuse nii vehiikulist kui ka MVP-st (joonis 4E), mis näitab, et MVP aktiveeris STINGi kaudu I tüüpi IFN ekspressiooni. Arusaama toetuseks tuvastasime paak-siduva kinaasi 1 (TBK1) fosforüülimise (joonis S5B), kinaas, mida tavaliselt seostatakse STING-i aktiivsusega31. Lisaks oli see rada sõltumatu TLR7 signaaliülekandest, kuna imikvimoodiga töödeldud rakkudes IFN-b ekspressioon ei olnud kahjustatud (joonis 4E). Võrdluseks, Trif või Mavs KO mõjutas MVP poolt soodustatud IFN-b ekspressiooni minimaalselt. Nagu oodatud, oli imikvimood ebaefektiivne IFN-b sekretsiooni stimuleerimisel Tlr7 KO-st saadud BMDC-des; Tlr7 KO-l oli aga negatiivne mõju MVP stimuleerivale toimele (joonis 4E). Huvitaval kombel täheldati samade ravimeetodite TNF-a sekretsioonil erinevat profiili. Stingi, Trifi või Tlr7 väljatõrjumisel ei olnud MVP stimuleeritud tsütokiini ekspressioonile minimaalset mõju. Mavsi väljatõrjumine seevastu vähendas dramaatiliselt TNF-a taset rakkudes, mida töödeldi kas ainult kandja või MVP-ga (joonis 4F). Tulemus näitab, et MAVS on MVP-ravi korral DC-des TNF-a ekspressiooni võtmeregulaator.

3.5. MVP stimuleerib STING-i ja MAVS-i radu, et soodustada IFN-I ja põletikuliste tsütokiinide sekretsiooni

STING-i ja MAVS-i signaalimise stimuleerimise eest vastutavate sõiduki komponentide tuvastamiseks valmistasime ette sõidukid ja MVP-d, asendades või jättes välja võtmekomponendid, ning rakendades neid BMDC-de raviks. Stingi agonisti tsükliline GMP-AMP (cGAMP) toimis positiivse kontrollina IFN-b sekretsiooni stimuleerimisel. Katioonse lipiidi EDOPC asendamine kanduris teise positiivselt laetud lipiidiga DOTAP pühkis IFN-b sekretsiooni täielikult välja. Võrdluseks, vehiikli ja MVP stimuleeriv toime säilis protamiiniga või ilma ning selline stimuleeriv toime sõltus puutumata Stingi geenist (joonis 4G). Huvitaval kombel ei soodustanud lipiidide kesta üksikute komponentidega, sealhulgas EDOPC-ga töödeldud BMDC-d tugevat IFN-b sekretsiooni (toetav teave joonis S6). Seega oli EDOPC STING-i aktiveerimiseks hädavajalik ja selle aktiivsus sõltub lipiidide nanoosakeste (st kandja või MVP) moodustumisest. EDOPC või DOTAP-iga valmistatud kandjat ja MVP-d kasutati ka metsiktüüpi ja Mavs KO hiirtelt saadud BMDCS-i raviks ning määrati TNF-i tasemed rakukasvusöötmes. Ootuspäraselt kõrvaldas EDOPC asendamine DOTAP või DOPC-ga sõiduki ja MVP stimuleeriva jõu. Lisaks oli TNF-a tase Mavs KO rakkudes metsiktüüpi rakkudega võrreldes märkimisväärselt langenud, kuid mitte vähenenud (joonis 4H), mis näitab, et MVP-stimuleeritud TNF-a ekspressiooni vahendamine võib olla seotud täiendavate teguritega.

3.6. STING rada on MVP-vahendatud kasvajavastaste immuunvastuste jaoks hädavajalik

Nii metsikut tüüpi kui ka knockout hiiri töödeldi OVA mRNA-ga kapseldatud MVP-ga ning uuriti DC küpsemist ja T-rakkude proliferatsiooni. Sting KO vähendas oluliselt CD80þ ja CD86þ DC-rakkude ja CD69þ T-rakkude protsenti (joonis 5AeD). ELISpoti test näitas pärast sama annuse MVP-ga töötlemist Sting KO hiirte põrnas ja lümfisõlmedes oluliselt vähenenud IFN-g-d tootvate rakkude arvu võrreldes metsiktüüpi hiirtega (joonis 5EeH). Mavs KO mõju oli minimaalne, kuna CD44þCD8þ mälu T-rakkude, OVA257e264-MHCI dekstrameer-positiivsete CD8þ T-rakkude ega IFN-g-d tootvate rakkude arvu lümfisõlmedes võrreldes metsik- tüüpi hiired (joonis 5IeL). Tulemus kinnitab arusaama, et MVP-ga stimuleeritud põletikuliste tsütokiinide ekspressioonis võivad lisaks MAVS-ile olla kaasatud ka täiendavad tegurid. B16-OVA kasvajate inokuleerimiseks kasutati nii metsikut tüüpi kui ka Sting KO hiirt ja hiiri raviti PBS-kontrolli või OVA mRNA-ga kapseldatud MVP-ga. Vaktsineeritud hiirtelt kogutud lümfisõlmede ja kasvajaproovide voolutsütomeetria analüüs näitas, et Sting KO hiirtel on oluliselt vähenenud IFN-g-d tootvate CD8þ T-rakkude arv (joonised 6A ja B). Selle tulemusena inhibeeriti kasvaja kasv täielikult MVP-ga ravitud metsiktüüpi hiirtel, võrreldes ainult osalise pärssimisega Sting KO hiirtel (joonis 6C).

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Arutelu

Käesolevas uuringus oleme süstemaatiliselt uurinud üksikute komponentide funktsionaalseid rolle MVP-s kasvajavastaste immuunvastuste stimuleerimisel. Meie rakupõhine uuring on selgelt näidanud, et nii mRNA molekule kui ka RNA-vaba kandjat MVP-s on vaja selle täielikuks aktiivsuseks IFN-b ja mitmete põletikuliste tsütokiinide, sealhulgas IL-1b ja TNF ekspressiooni soodustamisel. -a dendriitrakkudes. On näidatud, et sellised tsütokiinid mängivad olulist rolli dendriitrakkude aktiveerimisel ja vaktsiini vahendatud kasvajavastases immuunsuses20. Meie uuring näitas ka, et tsütokiinide tootmise stimuleerimine sõltub paljudest peamistest signaaliülekande radadest, mis on seotud kaasasündinud immuunsensoriga, sealhulgas need, mida vahendavad STING ja MAVS. Kuigi STING on IFN-b ekspressiooni jaoks hädavajalik, osaleb MAVS peamiselt TNF-a ekspressiooni reguleerimises (joonis 6D). STING-i signaaliülekande olulisust MVP-vahendatud kasvajavastasele immuunsusele näitab veelgi T-rakkude aktiivsuse vähenemine ja sellest tulenevalt kahjustatud kasvaja kasvu pärssimine Sting KO hiirtel. See tulemus on kooskõlas teiste aruannetega, et STING-i aktiveerimine määrab tsütotoksilise T-rakkude vahendatud kasvajavastase immuunsuse32. MAVS on võtmetähtsusega vahendaja RIG-I-retseptori (RLR) signaaliülekandes vastuseks viirusinfektsioonile. Selle raja aktiveerimine viib põletikuliste reaktsioonide kaskaadini33. On intrigeeriv, et Mavs KO hiirtel ei kahjustata T-rakkude aktiivsust, arvestades, et MAVS-i signaalimine mängib selgelt suurt rolli põletikuliste tsütokiinide, sealhulgas TNF-a ekspressiooni reguleerimisel. Võimalik põhjus on see, et selliste tsütokiinide stimuleerimist MVP-ga vahendab mitu rada ja MAVS-raja katkestamine ei vähenda tsütokiinide ekspressiooni piisavalt madalale tasemele, et põhjustada märkimisväärset mõju. Teise võimalusena kompenseeritakse MAVS-i signaalimise kadu teiste radadega. Nende radade tuvastamiseks on vaja täiendavaid uuringuid, et paremini mõista MVP vaktsiini toimemehhanismi. Kuigi TLR7 on traditsiooniliselt seostatud mRNA raviga21, ei näi TLR7 signaalimine MVP aktiivsuse vahendamisel olulist rolli mängivat. Täielikult metüleeritud mRNA molekulide kasutamine praeguses uuringus võis muuta TLR7 signaalimise vähem oluliseks. On hästi näidatud, et RNA metüülimine pärsib TLR-ide äratundmist23. TRIF on TLR3/7/8 signaaliülekande võtme adaptervalk28. Trifi väljatõrjumine ei mõjuta ka MVP aktiivsust, tugevdades arvamust, et ülaltoodud TLR-id, sealhulgas TLR7, ei mängi MVP-le rakuliste vastuste vahendamisel olulist rolli. Vähivaktsiinide väljatöötamisel on kasutatud mitut nõelamise agonisti, sealhulgas tsüklilisi dinukleotiide ning väikeseid ja suuri molekulaarseid ühendeid34e37. Selliseid nõelamise agoniste tuleb vaktsiini valmistamise ajal lisada väliste adjuvantidena, mis muudab vaktsiini koostise keerukamaks. Lisaks võib väliselt lisatud Stingi agonist pärast mRNA kompleksist eraldumist põhjustada soovimatuid kõrvalmõjusid. Võrdluseks, meie MVP toimib iseadjuvandina ja töötab vähivaktsiini kontekstis, kuna ükski vaktsiini üksikkomponent, sealhulgas EDOPC, ei saa soodustada tsütokiini ekspressiooni. Huvitaval kombel ei saa katioonset fosfolipiidi EDOPC asendada mittefosfolipiidse DOTAP-iga, mis on samuti positiivselt laetud. On intrigeeriv spekuleerida nende kahe katioonse lipiidi erinevuse võimaliku mehhanismi üle. Siiski on dokumenteeritud, et lipiidmolekuli komponendi muud omadused, nagu hüdrofoobsus, võivad avaldada sügavat mõju nanoosakeste üldisele funktsioonile ja selle kohaletoimetamise efektiivsusele nukleiinhapete puhul38. Seega tuleb täielikult toimiva mRNA vaktsiini valmistamiseks sobivate molekulide valimisel olla ettevaatlik. Kokkuvõttes oleme välja töötanud tugeva mRNA-põhise terapeutilise vähivaktsiini ja määranud vaktsiini üksikud komponendid koos nende funktsionaalsusega. Selle toimemehhanism on üsna erinev teistest profülaktilisteks ja terapeutilisteks sekkumisteks kasutatavatest mRNA platvormidest. Käesolevast uuringust saadud teadmised juhivad kindlasti täiendavate mRNA-ravimite edasist arendamist.

Joonis 4 Kaasasündinud immuunvastuste soodustamine MVP abil. (AeD) BMDC-sid, mida töödeldi 24 tunni jooksul 1 mg/ml imikvimoodiga, 1 mg/ml mRNA-ga ekvivalendi tuumaga, kandjaga või MVP-ga. IFN-b, TNF-a, IL-1b ja CCL5 tasemeid mõõdeti ELISA abil. (E ja F) IFN-b ja TNF-a ekspressioon BMDC-dest, mis pärinevad metsiktüüpi ja geenist väljalülitatud (KO) hiirtelt. BMDC-sid töödeldi näidatud reagentidega 24 tundi. IFN-b ja TNF-a mõõdeti ELISA abil. (G) IFN-b metsiktüüpi ja Stingi knockout hiirtelt saadud BMDC-des. BMDC-sid töödeldi 24 tundi 20 mg/ml cGAMP-ga, 1 mg/ml mRNA-ga ekvivalendi tuumaga, kandjaga või MVP-ga. Sõiduk (DOTAP): koostatud, asendades EDOPC DOTAP-iga; vehiikul (ilma protamiinita): valmistatakse protamiini väljajätmisega. ND: pole tuvastatav. (H) TNF-a metsiktüüpi ja Mavs knockout hiirtelt saadud BMDC-des. BMDC-sid töödeldi 24 tundi 1 mg/ml mRNA-ekvivalendi tuuma, kandja või MVP-ga. Sõiduk (DOTAP): koostatud, asendades EDOPC DOTAP-iga; vehiik (DOPC): koostatud, asendades EDOPC DOPC-ga. Andmed on esitatud keskmise SEM-na (n Z 3). ***P < 0.005; ****P < 0,001; ns, ei ole oluline.

Joonis 5 Kasvajavastased immuunvastused Stingi ja Mavsi knockout hiirtel. (AeD) Vähenenud DC ja T-rakkude aktiveerimine Sting knockout hiirtel. Nii metsikut tüüpi kui ka Stingi knockout hiiri töödeldi OVA mRNA-ga kapseldatud MVP-ga ja lümfisõlmed koguti 48 tundi hiljem DC ja T-rakkude mõõtmiseks. (EeH) Vähendatud IFN-g ekspresseerivad T-rakud põrnas ja lümfisõlmedes Sting knockout hiirtelt. Kuvatakse nii täppide kujutised kui ka kvantitatiivsed analüüsid. (IeL) Ei mõjuta T-rakkude aktiivsust Mavsi knockout hiirtel. Nii metsikut tüüpi kui ka Mavs knockout hiiri töödeldi PBS-kontrolli või OVA mRNA-ga kapseldatud MVP-ga ja lümfisõlmed koguti 48 tundi hiljem CD44þCD8þ mälu T-rakkude (I), OVA257e264-MHCI dekstrameer-positiivsete CD8þ mõõtmiseks. T-rakud (J) ja IFN-g-d tootvate rakkude arv (K ja L). Andmed on esitatud keskmise SEM-na (n Z 3 või 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, ei ole oluline.

Joonis 6 Sting-sõltuv kasvajavastane immuunsus. (A ja B) IFN-g ekspresseerivate T-rakkude analüüs lümfisõlmedes ja kasvajakudedes pärast seda, kui B16-OVA kasvajaid kandvaid metsiktüüpi ja Sting knockout hiiri töödeldi OVA mRNA-ga kapseldatud MVP-ga. Hiiri raviti 3. ja 1. päeval 0 ning lümfisõlmed ja kasvajad koguti 15. päeval. Üksikuid rakke analüüsiti voolutsütomeetriaga. (C) Kasvaja kasvu pärssimine metsiktüüpi ja Sting knockout hiirtel. Hiiri raviti PBS-kontrolli või MVP-ga 3. ja 1. päeval 0. Andmed on esitatud keskmise SEM-na (n Z 5). *P < 0,05; ****P < 0,001; ns, ei ole oluline. (D) Skemaatiline vaade signaali ülekanderadade MVP-stimulatsioonile, mis viib tsütokiinide tootmiseni DC-des. Kuigi IFN-b ekspressiooni stimuleerimist vahendab eranditult STING, on mitmeid tegureid, sealhulgas MAVS, mis vahendavad TNF-a ja IL{19}}b ekspressiooni.

Viited

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ jt. mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaktsiini efektiivsus pimeda faasi lõppemisel. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A jt. BNT162b2 Covid-19 vaktsiini kolmanda annuse ohutus ja efektiivsus. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Dowdy SF. RNA-ravimite rakubarjääride ületamine. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Lipiidide nanoosakeste süsteemid geeniteraapiate võimaldamiseks. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP jt. Lipopolyplex tugevdab mRNA-põhise vaktsineerimise kasvajavastast immuunsust. Biomaterjalid 2017;125:81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P jt. Herpes simplex viiruse 1 tümidiini kinaasi kodeeriva modifitseeritud mRNA süsteemne manustamine vähi sihipäraseks geeniteraapiaks. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC jt. Süsteemne RNA kohaletoimetamine dendriitrakkudesse kasutab vähi immunoteraapia jaoks viirusevastast kaitset. Loodus 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L jt. Viirust jäljendav mRNA vaktsiin vähi raviks. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA vaktsiinid uus ajastu vaktsinoloogias. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L jt. CAR T-rakke toodetakse in vivo südamekahjustuse raviks. Teadus 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. Kas mRNA vaktsiinide ajastul on lootust HIV funktsionaalseks raviks? Viirused 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Streuber M, Kirchhoff S, Bukur T jt. Mittepõletikuline mRNA vaktsiin eksperimentaalse autoimmuunse entsefalomüeliidi raviks. Teadus 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. mRNA vaktsiin vähi immunoteraapia jaoks. Mol Cancer 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K jt. mRNA vähi immunoteraapias: väljaspool antigeeni allikat. Mol Cancer 2021;20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M jt. Isikupärastatud RNA mutanoomivaktsiinid mobiliseerivad polüspetsiifilise terapeutilise immuunsuse vähi vastu. Loodus 2017;547:222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M jt. RNA vaktsiin suurendab immuunsust kontrollpunkti inhibiitoriga ravitud melanoomi korral. Loodus 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C jt. Aktiivselt isikupärastatud vaktsineerimisuuring äsja diagnoositud glioblastoomi jaoks. Loodus 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA jt. Vähi immunoteraapia. Dendriitrakkude vaktsiin suurendab melanoomi neoantigeenispetsiifiliste T-rakkude laiust ja mitmekesisust. Teadus 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S jt. Neoantigeeni vaktsiin tekitab Ib faasi glioblastoomi uuringus kasvajasiseseid T-raku vastuseid. Loodus 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H jt. Kasvajavastase immuunsuse sünergistlik aktiveerimine osakeste terapeutilise vaktsiini abil. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. MRNA vaktsiini adjuvantsuse loomupärane mõtestamine. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J jt. Kahe toimega Messenger RNA-põhised vaktsiinid kutsuvad esile tasakaalustatud TLR-7-sõltuvad adaptiivsed immuunvastused ja tagavad kasvajavastase toime. J Immunother 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. RNA äratundmise pärssimine Toll-like retseptorite poolt: nukleosiidi modifitseerimise mõju ja RNA evolutsiooniline päritolu. Immunity 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L jt. IL-1 ja IL-1ra on RNA vaktsiinide põletikulise vastuse peamised regulaatorid. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M jt. Kaasasündinud ja adaptiivse immuunsuse mehhanismid PfizerBioNTech BNT162b2 vaktsiini suhtes. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Abistavate lipiidide asendamine laetud alternatiividega lipiidide nanoosakestes hõlbustab sihipärast mRNA kohaletoimetamist põrna ja kopsudesse. J Control Release 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA jt. Väike segav RNA vähiraviks: sünnitustakistuste ületamine. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. I tüüpi interferooni vastus ja vähi kaasasündinud immuunvastus. Trends Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Mitootiline progresseerumine pärast DNA kahjustust võimaldab mikrotuumades mustri ära tunda. Loodus 2017;548:466e70.

30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S jt. DNA kahjustus käivitab I tüüpi interferoonisüsteemi tsütosoolse DNA anduri STING kaudu, et edendada antimikroobset kaasasündinud immuunsust. Immunity 2015;42:332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. Helikaas DDX41 tunneb dendriitrakkudes adapteri STING poolt vahendatud rakusisest DNA-d. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH jt. Terapeutilise STING-i aktiveerimise ulatus määrab CD8þ T-rakkude poolt vahendatud kasvajavastase immuunsuse. Cell Rep 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. RIG-I ja MDA5 mustrite tuvastamise ja signaalimise mehhanismid. Front Immunol 2014;5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E jt. STINGi agonistiga formuleeritud vähivaktsiinid võivad ravida väljakujunenud kasvajaid, mis on resistentsed PD-1 blokaadi suhtes. Sci Transl Med 2015; 7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE jt. STING-i otsene aktiveerimine kasvaja mikrokeskkonnas põhjustab tugeva ja süsteemse kasvaja regressiooni ja immuunsuse. Cell Rep 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J jt. Heterotsükliliste lipiididega mRNA vaktsiinide kohaletoimetamine suurendab kasvajavastast efektiivsust STING-vahendatud immuunrakkude aktiveerimise kaudu. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y jt. STINGi aktiveeriv nanovaktsiin vähi immunoteraapiaks. Nat Nanotechnol 2017;12:648e54.

38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Katioonsete o-asendatud fosfatidüülkoliini derivaatide binaarsete segude transfektsiooni aktiivsus: hüdrofoobne tuum moduleerib tugevalt füüsikalisi omadusi ja DNA kohaletoimetamise efektiivsust. Biophys J 2006;91:3692e706.