Kaasasündinud patogeeni tuvastamise strateegia, mis hõlmab bakteriaalsete pinnavalkude ubikvitineerimist, 2. osa

ARUTELU

Metazoaanid kasutavad ubikvitineerimist mitmekülgse mehhanismina tsütosoolse homöostaasi säilitamiseks, takistades kahjustatud valkude/organellide kuhjumist ja kaitstes sissetungivate patogeenide eest (40, 41). Arvestades patogeenide mitmekesisust ja kahjustatud valkude erinevaid komplekte, on substraadi äratundmise ja sellele järgneva ubikvitineerimise ühiste motiivide tuvastamine nutikas strateegia ressursside optimeerimiseks. Eukarüootsetes rakkudes olevad proteolüüsiks mõeldud valgud identifitseeritakse tavaliselt kolmepoolse degronimotiivi järgi (24).

Immuunsus on organismi võime tõrjuda haigusi, sealhulgas vastuseid bakteritele, viirustele ja muudele kahjulikele ainetele. Kui keha immuunsüsteem on kahjustatud, ei ole see piisavalt tugev, et toime tulla haiguste rünnakuga. Uuringud on näidanud, et alatoitumus mõjutab immuunsüsteemi tööd, muutes keha vastuvõtlikumaks infektsioonidele ja haigustele. Valk on üks olulisemaid aineid immuunsuse säilitamiseks.

Valgud koosnevad aminohapetest, millest mõnda nimetatakse asendamatuteks aminohapeteks, kuna neid peab saama toit ja organism ei saa neid sünteesida. Nende asendamatute aminohapete hulka kuuluvad trüptofaan, leutsiin, fenüülalaniin, lüsiin, isoleutsiin, metioniin, valiin ja histidiin. Kui organism ei saa piisavalt asendamatuid aminohappeid, võib see põhjustada valkude ainevahetuse häireid, mis võivad mõjutada immuunsüsteemi talitlust.

Lisaks aitab kvaliteetne valgu tarbimine säilitada normaalset immuunsüsteemi ja kehafunktsioone. Kui kehal puudub valk, võib see kaasa tuua immuunsüsteemi nõrgenemise ja keha on haigustele vastuvõtlikum. Kui inimorganismis on pikemat aega valgupuudus, võib see põhjustada pikaajalisi immuunsüsteemi kahjustusi, muutes inimesed vastuvõtlikuks erinevatele haigustele.

Seetõttu on tasakaalustatud toitumine ja õige trenn valkude tarbimise säilitamise võtmeks. Inimesed saavad oma keha valguvajaduse rahuldada, süües rohkem valgurikkaid toite, nagu liha, linnuliha, kala, oad, munad, piimatooted, teraviljad, pähklid ja seemned. Lisaks võib mõõdukas treening suurendada ka organismi valguvajadust ja omastamise efektiivsust. Tasakaalustatud ja mitmekesine toitumine ning tervislik eluviis on võtmeks immuunsuse säilitamisel, organismi tervena ja stabiilsena hoidmisel ning haigustele vastupanuvõimele. Sellest vaatenurgast peame oma immuunsust parandama. Tistanche võib oluliselt parandada immuunsust, kuna lihas sisalduvad polüsahhariidid võivad reguleerida inimese immuunsüsteemi immuunvastust, parandada immuunrakkude stressivõimet ja tugevdada immuunrakkude immuunsust. Bakteritsiidne toime.

Klõpsake cistanche deserticola toidulisand

See ajendas meid uurima, kas sarnaseid motiive võib leida patogeeni pindadelt, kus need võivad toimida substraadi tuvastamise puhverserverina. Siin demonstreerime, et peremeesorganismi ubikvitiini ligaasid kasutavad fülogeneetiliselt erinevate patogeenide tuvastamiseks sarnaseid molekulaarseid signatuure. Patogeeni äratundmine ühiste molekulaarsete mustrite/motiivide (PAMP) kaudu on kaasasündinud immuunsuse hästi iseloomustatud tunnus (42). Meie tulemused viitavad sellele, et bakterite pinnavalkudes olevad degronitaolised järjestused toimivad PAMP-idega samaväärselt, et tagada rakusisese patogeeni jälgimine. Peremees saaks seda modusoperandi veelgi kasutada mikroobsete valguantigeenide esitlemiseks peamises histo-ühilduvuskompleksis I, et kutsuda esile tugev CD8 vastus, mis on suunatud rakusiseste patogeenide vastu.

Ubikvitiini poolt vahendatud patogeenide tuvastamise potentsiaalset tähtsust peremeesorganismi kaitsevõimele tõstab veelgi esile mutantses SPN-is tuvastatud märkimisväärne ubikvitinatsioon, millel puuduvad nii BgaA kui ka PspA. See näitab, et ubikvitiini masinas on veel tundmatuid substraate, millest tulenev koondamine tagab patogeeni tugeva kinnijäämise. Nimelt pakuvad mõned vahetud küsimused degroni motiivi ja selle tähtsuse kohta bakteritele (va äratuntav üksus) huvitava evolutsioonilise nurga.

Degroni motiiv on in vivo asendatav ja motiivi muteerimine või kustutamine parandas rakusisest püsivust, mille tulemuseks on suurenenud virulentsus. Seda kinnitavad meie tulemused, et patogeenid võivad kasutada degronimotiivi mutatsiooni, et pääseda ubikvitiini poolt vahendatud äratundmisest, nagu on näha SPN serotüübi 19F puhul. Kuid BgaA degronimotiivi konserveerunud olemus enamikus SPN serotüüpides võib viidata bakterite vastuvõetud vastustrateegiale, mis on peremeesorganismile vähem surmav.

See võib anda patogeenile võimaluse suurendada oma elupaiku. Samal ajal võib bakteripinna või sekreteeritud valkude ubikvitineerimine degroni motiivil neid funktsionaalselt moduleerida, et summutada või ümber suunata peremeesreaktsioon, et saada sellest kasu (43). Seetõttu võib eukarüootsete funktsionaalsete domeenide või motiivide (nagu degronid) olemasolu või puudumine sõltuda patogeensest nišist ja olla kohandatud peremeesorganismi immuunvastuste vältimiseks või moduleerimiseks.

Sarnane patogeeni tuvastamise mehhanism, mis hõlmab guanülaadi siduvaid valke, on samuti seotud bakteriaalse kliirensiga; Kuid erinevalt ubikvitinatsioonist piirdub nende roll gramnegatiivsete patogeenidega (44–47). Ubikvitineerimine on suunatud patogeenile, olenemata Grami päritolust, näiteks on dokumenteeritud, et RNF213 on suunatud Listeria spp. olenemata LPS-i puudumisest (48). Seetõttu ei välista me selle antimikroobse toime võimalust ka SPN-i vastu.

Patogeenset pinda saab ubikvitineerida mitme ahelatüübiga erinevate ahelatevahelise interaktsiooniga E3 ligaasidega (41). Eelkõige Mtb puhul on tõestatud, et Smurf1 ja Parkin moodustavad K48 ja K63 ahelatüüpe, mis toimivad sünergistlikult patogeeni lagundamiseks (12). K48 ubikvitineerimise ja nakkusstsenaariumides osalevate E3 ligaaside mehhaanilise rolli mõistmine on endiselt alauuritud. STm-i puhul on kujutatud ühte E3 ligaasi ARIH1, mis sihib tsütosoolset STm-i K48 ubikvitiini ahelatega, mis viib nende eemaldamiseni süsteemist (15). Meie ja teiste leidude põhjal lagunevad K48--märgistatud patogeenid lõpuks, samas kui neid seostatakse proteasomaalsete masinatega.

See uuring näitab aga spetsiifiliste bakteriaalsete pinnavalkude K48-Ub kaunistust. On teada, et mõned patogeenid modifitseerivad aktiivselt oma pinnavalke, kaitstes neid ubikvitinatsiooni ja sellele järgneva tapmise eest, rõhutades seega ubikvitiini substraadi pinna lokaliseerimise olulisust (10). Lisaks on mitmed kohustuslikud intratsellulaarsed patogeenid välja töötanud strateegiad enda või peremeesorganismi reguleerivate komponentide deubikvitineerimiseks, et vältida ubikvitiini vahendatud kliirensit (5). Üheskoos rõhutavad need leiud ubikvitiini poolt vahendatud häire äratamise tähtsust kui põhilise rakusisese patogeeni tuvastamise mehhanismi, mis on peremeesorganismi kaitsemehhanismide keskmes.

Meie uuring näitas veelgi SCF E3 ligaasi keskset rolli, eriti koos FBXW7-ga, bakteriaalses ubikvitinatsioonis, mis suurendab patogeeni lagunemist. Heterosügootsed mutatsioonid FBXW7-s, eriti R505C (kriitiline jääk substraadi äratundmise taskus) variandis, põhjustavad inimestel hulgikartsinoomi ja lümfotsüütilist leukeemiat (49, 50). Hiljutine kohortipõhine uuring näitas, et peaaegu 43 protsenti kroonilise lümfotsütaarse leukeemiaga (CLL) patsientidest sureb bakteriaalsele kopsupõletikule ja sepsisele, millele järgneb seeninfektsioon (51).

See kinnitab meie tähelepanekut FBXW7 mutatsiooni kandvate peremeesrakkude tühistatud võime kohta patogeene tuvastada ja kõrvaldada. Seetõttu annavad meie leiud ootamatu molekulaarse seletuse KLL-iga patsientide suurenenud infektsiooniriski kohta. Seost E3 ligaasi geenide geneetilise polümorfismi ja vastuvõtlikkuse vahel bakteriaalsetele infektsioonidele kinnitavad ka Parkinsoni tõvega patsiendid, kes on haavatavad kõhutüüfuse või pidalitõve suhtes (14), mis viitab E3 ligaaside märkimisväärsele panusele peremeesorganismi immuunsuses bakteriaalsete infektsioonide vastu ja hoolduses. raku püsiolekust.

Kokkuvõtteks dešifreerisime tsütosoolis elavate patogeenide tuvastamise universaalse keele, mida peremees saaks tõhusalt rakendada mikroorganismide tuvastamiseks järgnevaks kõrvaldamiseks. Need leiud annavad ühiselt valgust algeliste rakuliste immuunprotsesside mõistmisele, mida saab kasutada antibakteriaalse immuunsuse tugevdamiseks.

MATERJALID JA MEETODID

Rakukultuur

Mõlemad inimese kopsu alveolaarse kartsinoomi (II tüüpi pneumotsüütide) rakuliin A549 [American Type Culture Collection (ATCC) nr. CCL185)] ja emakakaela adenokartsinoomi rakuliini HeLa (ATCC nr CRM-CCL-2) kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM; HiMedia), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (Gibco) 37 kraadi ja 5 kraadi juures. protsenti CO2.

Bakteritüved ja kasvutingimused

SPN (R6, serotüüp 2, kingitus Tim J. Mitchellilt, Birminghami Ülikool, Ühendkuningriik) kasvatati Todd-Hewitti puljongis, millele oli lisatud 1,5 protsenti pärmiekstrakti temperatuuril 37 kraadi 5 protsenti CO2-ga. Vajadusel kasutati SPN-kultuuride kasvatamiseks järgmisi antibiootikume: kanamütsiin (200 ug/ml), spektinomütsiin (100 ug/ml) ja klooramfenikool (4,5 ug/ml). Üheksasada mikroliitrit 0,4 OD600 (optiline tihedus 600 nm juures) kasvatatud SPN kultuuri segati 600 ul 80% steriilse glütserooliga (glütserooli lõppkontsentratsioon 32%) ja säilitati –80 kraadises sügavkülmikus. Neid glütserooli varusid kasutati kõigi katsete lähteinokulaadina.

Escherichia coli DH5 ja STm (ATCC 14028) kultuure kasvatati Luria-Bertani puljongis (LB) 37 kraadi juures loksutamise tingimustes (200 p/min) ja vajadusel kasutati järgmisi antibiootikume: kanamütsiini (50 ug/ml), spektinomütsiin (100 ug/ml), klooramfenikool (20 ug/ml) ja ampitsilliin (100 ug/ml). Kõigi infektsioonianalüüside jaoks kasvatati baktereid kuni OD600 ~ 0, 4, millele järgnes enne peremeesrakkude nakatamist sarnase tihedusega resuspendeerimine fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS).

Oletatavate ubikvitiini sihtvalkude sõelumine

Kõik STm ja SPN proteoomides esinevad pinnavalgud tuvastati esmakordselt avaldatud kirjandusest. Pinnavalkude täielikud valgujärjestused saadi ettevõttest UniProt, mida seejärel kasutati degronimotiivide olemasolu tuvastamiseks. Avaldatud kirjandusest (24, 52, 53) ja eukarüootsete lineaarsete motiivide andmebaasist kureeriti 29 oletatava degroni motiivi komplekt. Pythoni regex-moodulit kasutati kõigi selliste kureeritud motiivide asukoha tuvastamiseks pinnavalgu järjestustes. Edasi viidi läbi lineaarne otsing, et tuvastada lüsiinijäägi olemasolu (8 kuni 14 aminohappejääki) iga tuvastatud degronimotiivi juures. Eeldatakse, et see lüsiinijääk toimib ubikvitiini osa kinnituskohana. Lõpuks sisestati valitud valgujärjestused valgu struktuuri ennustavasse tööriista IUPred (54), et tuvastada degroni motiivi ja proksimaalse lüsiini vahel ebakorrapärase piirkonna olemasolu. Saadud valgud (BgaA ja PspA SPN jaoks ja RlpA STm jaoks) valiti hindamiseks ubikvitinatsiooni sihtmärkideks ja nende rolli dekodeerimiseks patogeeni kliirensis.

Bakteritüve ehitus

Alleelivahetus homoloogse rekombinatsiooni teel viidi läbi, kasutades geeniga külgnevaid piirkondi, mis kandsid sisestatud antibiootikumikassetti mutantsete tüvede genereerimiseks nii SPN-s kui ka STm-s (tabel S2).

SPN jaoks amplifitseeriti 500-bp üles- ja allavoolu bgaA, pspA ja tema geenide piirkonnad genoomist sobivate praimeritega (tabel S3) ja koondati pBKS vektorisse. Pärast nende fragmentide kloonimist sisestati sellesse konstrukti antibiootikumiresistentsuse kassett (spektinomütsiin koti jaoks, samuti pspA ja klooramfenikool hysA jaoks). Seejärel transformeeriti lineariseeritud rekombinantsed plasmiidid WT SPN-i, kasutades kompetentsust stimuleerivat peptiidi 1 (GenPro Biotech), rekombinantid valiti vastavate antibiootikumide abil ning geeniasendus kinnitati polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) ja vastavate geeni lookuste sekveneerimisega. STm puhul kasutati geenideletsioonimutantide genereerimiseks λ-punase rekombinaasi meetodit (55).

Lühidalt, trossi geeni otstega homoloogsed järjestused lisati praimeri järjestustesse, mida kasutatakse kanamütsiini resistentsuse kasseti amplifitseerimiseks. Seejärel elektroporeeriti kassett WT STm tüvesse ja homoloogse rekombinatsiooniga genereeritud väljalöögid valiti kanamütsiiniresistentsuse põhjal. Geeni deletsioon kinnitati PCR-i ja geeni lookuse sekveneerimise abil. Täispikk pspA, hysA ja kärbitud bgaA-T (1 kuni 3168 aluspaari) klooniti P23 promootori alla süstikvektorisse pIB166 (56) ja neid kasutati komplementeerimiseks.

Neid rekombinantseid plasmiide ​​kasutati ka kohtsuunatud mutageneesiks, et tekitada bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R ja bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R45Dspron, pspAK315R45Degron, p,spron. ) ja tema (hysADegron-BgaA ja hysADegron-PspA), kasutades sobivaid praimerite komplekte (tabel S3) ja transformeeriti ΔbgaA ja ΔpspA mutantideks. Kõik kloonid kontrolliti DNA sekveneerimisega. BgaA, PspA ja HysA erinevate variantide ekspressiooni kinnitati Western blot abil, kasutades sobivaid antikehi.

Antikehad ja reaktiivid

Enolaasi- ja PspA-vastane seerum (S. Hammerschmidt, Greifswaldi ülikool, Saksamaa); anti-BgaA seerum (S. King, Ohio osariigi ülikool, USA); ja His6 (Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub-sideme (Millipore, 05-1307), K63-Ub-sideme (Millipore, 14-6077-80) ​​spetsiifilised antikehad ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), glütseraldehüüdfosfaatdehüdrogenaas (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], fosfotreoniin (CST, 9381S), IgA, hiire müeloomist pärit kappa, kloon TEPC-15, M1421) ja PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) hangiti. Kasutati järgmisi sekundaarseid antikehi: mädarõika peroksüdaas (HRP) märgistatud küülikuvastane (BioLegend, 406401), HRP-märgisega hiirevastane (BioLegend 405306), küülikuvastane Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-rabbit Alexa. Fluor 555 (Invitrogen, A31572), biotiiniga konjugeeritud hiirevastane immunoglobuliin A (Life Technologies, M31115), hiirevastane Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), hiirevastane Alexa Fluor 488 (Invitrogen, anti-2goat02), Fluor 633 (Invitrogen, A21082) ja FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Valkude ekspressioon ja puhastamine

BgaA-T ja selle variandid klooniti pET28-sse, kasutades Xba I/Not I restriktsioonisaite. N-terminaalse His-märgisega BgaA-T kodeerivad rekombinantsed plasmiidid transformeeriti valgu ekspressiooniks E. coli BL21 (DE3) rakkudesse. Värskelt transformeeritud kolooniaid kasvatati LB-s, mis sisaldas kanamütsiini (50 ug/ml) temperatuuril 37 kraadi loksutisinkubaatoris 12 tundi. Üks protsent primaarsest kultuurist lisati 1 liitrile LB puljongile ja inkubeeriti 37 kraadi juures loksutisinkubaatoris, kuni OD600nm saavutas vahemikus 0,6 kuni 0,8. Valgu ekspressioon indutseeriti 100 μM isopropüül- -D-tiogalaktopüranosiidi (IPTG) lisamisega ja kultuuri edasise kasvatamisega 37 kraadi juures 5–6 tundi, segades kiirusel 150 p/min.

Rakud koguti tsentrifuugimisega kiirusel 6{5}}00 p/min 10 minutit 4 kraadi juures. Rakupellet resuspendeeriti puhvris A [25 mM tris (pH 8,0) ja 300 mM NaCl] ja lüüsiti ultraheliga töötlemisega. Rakujäägid eraldati tsentrifuugimisega (14, 000 pööret minutis, 50 min, 4 kraadi) ja supernatant kanti Ni-NTA kolonnile, mis oli tasakaalustatud puhvriga A. Kolonni pesti 10 kolonnimahu puhvriga. A ja His-märgistatud valgud elueeriti imidasooliga (250 mM) puhvris A. Kõik BgaA-T variandid ekspresseeriti ja puhastati sama protseduuri abil. FBXW7 subklooniti vektorisse pGEX-4 T-1, millel oli N-terminaalne glutatioon-S-transferaasi (GST) märgis pCMV6-Entry-FBXW7 vektorist, kasutades Eco RI restriktsiooniensüümi.

GST-märgistatud FBXW7 ekspresseeriti E. coli BL21 (DE3) rakkudes pärast valguekspressiooni indutseerimist 0,1 mM IPTG-ga ja kasvatamist 30 kraadi juures 4 tundi. GST-FBXW7 E. coli toorekstraktist puhastati Glutathione-Sepharose (GE HealthCare) kolonnkromatograafiaga. Puhastatud valke sisaldavad fraktsioonid ühendati ja kontsentreeriti kuni 0,5 mg/ml, kasutades 10-kDa molekulmassi piirfiltrit (Amicon), tsentrifuugides 4700 pööret minutis 4 kraadi juures. Valkude puhtust kontrolliti SDS-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga (SDS-PAGE), millele järgnes värvimine Coomassie sinisega.

Peremeesrakkude transfektsioonid

BgaA-T klooniti doksütsükliiniga indutseeritavasse vektorisse pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene nr 130261), kasutades infusioonikloonimiskomplekti (Takara). Positiivne kloon kinnitati Sangeri sekveneerimisega. FBXW7R505C mutatsioon viidi läbi saidipõhise mutageneesi abil, kasutades matriitsina pMRX-GFP-FBXW7 ja kinnitati Sangeri sekveneerimisega. Kõik transfektsioonid viidi läbi, kasutades Lipofectamine 3000 reagenti (Thermo Fisher Scientific) ja selektsioonid viidi läbi blastitsidiinvesinikkloriidi (2 ug/ml; HiMedia) juuresolekul.

siRNA-le suunatud geeni knockdown

RNA interferentsi poolt vahendatud spetsiifiliste geenide hävitamiseks kasutati järgmisi siRNA-sid: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) ja SMARTpool L-003010-00-0005). Lühidalt, 24-süvendplaadil kasvatatud A549 rakud transfekteeriti ajutiselt geenispetsiifiliste siRNA-de või segamismeetodiga (siControl) (150 pmol), kasutades Lipofectamine 3000 vastavalt tootja juhistele. Kolmkümmend kuus tundi pärast transfektsiooni töödeldi rakke Western blot analüüsi ja immunofluorestsentsi või penitsilliini-gentamütsiini kaitsetestide jaoks.

Struktuuri ennustamine ja modelleerimine

Kõik struktuurid ennustas AlphaFold (valgu homoloogia/analoogiatuvastusmootor V 2.0) (57) ja visualiseeriti PyMOL-i (PyMOL Molecular Graphics System, versioon 2) abil.0 Schrödinger, LLC. Struktuurid kodeeriti PyMolis värvikoodiga IUPredi (54) skooride põhjal, mis ulatusid järjestatud (sinine) kuni korratu (punane) kuni valgeni.

Western blotting

Kuni {{0}},4 OD600 nm kasvatatud SPN-kultuurid lüüsiti ultraheliga ja toorekstraktid koguti pärast tsentrifuugimist (15, 000 p/min, 30 min, 4 kraadi). A549 puhul pesti monokihte mitu korda PBS-ga ja lüüsiti jääkülmas radioimmunosadestamise testi (RIPA) puhvris [50 mM tris-Cl (pH 7,89), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% naatriumi deoksükolaat ja 1% SDS], mis sisaldab proteaasi inhibiitori kokteili (Promega), naatriumfluoriidi (10 mM) ja EDTA-d (5 mM). Rakususpensiooni töödeldi lühiajaliselt ultraheliga ja tsentrifuugiti rakulüsaatide kogumiseks. Bakteriaalsetes või A549 rakulüsaatides (10 või 20 ug) olevad valgud eraldati 12% SDS-PAGE geelidel ja kanti üle aktiveeritud polüvinülideendifluoriidmembraanile. Pärast blokeerimist 5-protsendilises lõssis testiti membraane sobivate primaarsete ja HRP-märgistatud sekundaarsete antikehadega. Viimasena töötati välja blotid, kasutades täiustatud kemoluminestsentssubstraati (Bio-Rad).
Penitsilliini-gentamütsiini kaitse test

SPN-tüved, mida kasvatati kuni OD600nm 0.4 Todd-Hewitti puljongis, millele oli lisatud 0.2 protsenti pärmiekstrakti (THY), pelleteeriti ja resuspendeeriti PBS-is ( pH 7,4) ja lahjendati A549 monokihtide nakatamiseks analüüsisöötmes, mille nakatumise kordsus (MOI) oli 10. Pärast 1-tunnist nakatumist pesti monokihte DMEM-ga ja inkubeeriti penitsilliini (10 ug/ml) sisaldava analüüsisöötmega. ) ja gentamütsiini (400 ug/ml) 2 tunni jooksul rakuvälise SPN hävitamiseks. Seejärel lüüsiti rakud 0,025% Triton X-100-ga ja lüsaat plaaditi Brain Heart Infusion agariplaatidele, et loendada elujõuline SPN. Invasiooni protsent arvutati [kolooniat moodustavates ühikutes (CFU) lüsaadis/infektsiooniks kasutatud CFUs] × 100. Rakusisese elulemuse hindamiseks 9 tundi pärast nakatumist (alates penitsilliini-gentamütsiini ravi algusest) valmistati rakulüsaadid järgmiselt. eespool mainitud, ning loetleti levinud plaaditud ja ellujäänud bakterid. Elulemusefektiivsus (protsent) esitati korduva muutusena ellujäämise protsendis võrreldes kontrolliga näidatud ajahetkel (normaliseeritud 0 tunnini).

Immunofluorestsents

Immunofluorestsentsanalüüsi jaoks kasvatati A549 või HeLa rakke klaasist katteklaasidel ja nakatati SPN või STm tüvedega MOI ~ 25 juures 1 tund, millele järgnes antibiootikumravi 2 tundi. Soovitud ajahetkedel pärast nakatamist (9 tundi SPN-ga nakatumiseks A549-s ja 3 tundi STm-ga nakatumiseks HeLa-s) pesti rakke DMEM-ga ja fikseeriti jääga jahutatud metanooliga temperatuuril –2{23}} 10 minutit. Lisaks blokeeriti katteklaasid 3-protsendilise veise seerumi albumiiniga (BSA) PBS-is 2 tunni jooksul toatemperatuuril. Seejärel töödeldi rakke sobiva primaarse antikehaga 1% BSA-s PBS-is üleöö temperatuuril 4 °C, pesti PBS-iga ja inkubeeriti sobiva sekundaarse antikehaga 1% BSA-s PBS-is 1 tund toatemperatuuril. Viimasena pesti katteklaase PBS-ga ja paigaldati klaasklaasidele koos VECTASHIELDiga 4′,6-diamidino-2-fenüülindooliga või ilma (Vector Laboratories), et visualiseerida laserskaneeriva konfokaalse mikroskoobiga (LSM 780, Carl Zeiss). ) alla 40× või 63× õliobjekti. Pildid saadi pärast optilist sektsiooni ja seejärel töödeldi ZEN lite tarkvara (versioon 5.0) abil. Superresolutsiooniga mikroskoopia viidi läbi sarnaselt, kasutades SIM-režiimis Elyra 7 (Carl Zeiss). Kolokalisatsiooni analüüsi jaoks hinnati bakterid visuaalse loendamisega n> 100 bakterit korduse kohta.

Transmissioonelektronmikroskoopia

Pärast SPN-i ja STm-ga nakatumist pesti rakke {{0},1 M naatriumkakodülaatpuhvriga, mis fikseeriti 2,5% glutaaraldehüüdiga (Sigma-Aldrich) 0,1 M naatriumkakodülaatpuhvris ( Sigma-Aldrich) 3 tundi 4 kraadi juures. Pärast fikseerimist koguti rakud läbi rakukaabitsa ja pelleteeriti kiirusel 2000 p/min 10 minutit. Seejärel pesti rakke 0,1 M naatriumkakodülaatpuhvriga ja järelfikseeriti 1% osmiumtetroksiidiga 0,1 M naatriumkakodülaatpuhvris 20 minutit 4 kraadi juures. Pärast järgnevat kakodülaatpuhvri ja destilleeritud veega pesemist dehüdreeriti rakke 30 minuti jooksul suurenevates kontsentratsioonides etanooli (50, 70, 95 ja 100 protsenti) ja propüleenoksiidiga ning sisestati viimasena epoksüvaiku (Electron Microscopy Sciences, 14300). polümerisatsioon 75 kraadi juures 45 minutit. Seejärel viidi kapslid 45 minutiks 95 kraadisesse ahju. Üliõhukesed lõigud (70 nm) lõigati Leica EM UC7 Ultramicrotome teemantnoaga ja värviti 2 protsendi uranüülatsetaadi ja 1 protsendi pliitsitraadiga ning vaadati läbi ülekandeelektronmikroskoobi (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) 120 KV juures.

Ex vivo ubikvitinatsioon

A549-ekspresseerivat BgaA-T ja selle variante töödeldi MG132-ga (5 µM) ja valgu ekspressioon indutseeriti doksütsükliiniga (100 ug/ml) 24 tunni jooksul. Seejärel rakud lüüsiti RIPA puhvris ja proove elektroforeesiti SDS-PAGE abil (8 protsenti). BgaA-T ja selle variantide valgu ekspressiooni ja ubikvitineerimise kinnitust tõestati Western blot meetodil pärast sondeerimist vastavalt anti-BgaA ja anti-K48-Ub antikehadega.

In vitro ubikvitinatsioon

In vitro ubikvitinatsioonitestide jaoks puhastati rekombinantsed valgud, nagu varem kirjeldatud (58). SCFFBW7 E3 ligaasi kompleksi inkubeeriti rekombinantse 0,1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0,25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) ja ubikvitiiniga (2,5 ug/ml; Boston). Biochem) puhastatud BgaA-T ja selle variantide juuresolekul. Ubikvitilatsioonireaktsioonid viidi läbi analüüsipuhvris [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenosiintrifosfaati (ATP), 1 mM -merkaptoetanooli ja 0,1 protsenti Tween 20] 2 tundi 25 kraadi juures. . Reaktsioonid peatati 5x Laemmli puhvriga, lahustati SDS-PAGE geelidel ja analüüsiti immunoblotanalüüsiga, kasutades anti-BgaA antikeha.

In vitro kinaasi test

In vitro kinaasi testi läbiviimiseks kasutati GSK3 kinaasi ensüümsüsteemi (Promega) vastavalt tootja protokollile koos järgmiste modifikatsioonidega. Lühidalt, 3 ug rekombinantset BgaA-T lisati 0,5 ug aktiivsele GSK3-le koos 400 μM ATP-ga reaktsioonipuhvris, mis koosnes 40 mM trisist (pH 7,5), 20 mM MgCl2. , BSA (0,1 mg/ml) ja 50 µM ditiotreitooli. Reaktsiooni inkubeeriti 2 tundi 30 kraadi juures ja peatati 1 x Laemmli puhvri lisamisega. Seejärel keedeti proove ja elektroforeesiti Western blot analüüsiks, nagu eelnevalt mainitud. Fosforüülitud BgaA-T tuvastati fosfotreoniinivastase antikehaga.

In vivo mudel

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 protsenti algsest kehakaalust ja väljendunud eritis ninast või silmast. Vereproovid võeti südame punktsiooniga terminaalse anesteesia all ja põrnad lõigati pärast surma bakterite loendamiseks. Koeproove töödeldi käeshoitava koehomogenisaatoriga ja homogenaate lahjendati seeriaviisiliselt PBS-is enne vereagarplaatidele määrimist. Plaate inkubeeriti üleöö 37 kraadi juures 5% CO2 ja bakterikolooniate arvu hinnati järgmisel päeval.

Statistiline analüüs

Statistiliseks analüüsiks kasutati GraphPad Prism versiooni 5. Individuaalsete katsete statistilised testid on märgitud vastavates jooniste legendides. P < 0,05 loeti statistiliselt oluliseks. Andmeid testiti normaalsuse ja iga testitud rühma dispersiooni määratlemiseks. Kõik mitmeparameetrilised analüüsid sisaldasid parandusi mitme võrdluse jaoks ja andmed on esitatud keskmisena ± SD, kui pole öeldud teisiti.

VIITED JA MÄRKUSED

ME Bianchi, DAMP-id, PAMP-id ja alarmid: kõik, mida me peame teadma ohust. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Patogeeni äratundmine ja põletikuline signaalimine kaasasündinud immuunkaitses. Clin. Microbiol. Rev. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Elu sees: tsütosoolsete bakterite rakusisene elustiil. Nat. Rev. Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, ubikvitilatsiooni roll immuunkaitses ja patogeenide vältimises. Nat. Rev. Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, The ubikvitinatsioonisüsteem bakteriaalsete peremeesorganismi ja patogeeni interaktsioonides. Microorganisms, 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Globaalne peremeesorganismi ja bakteriaalse ubikvitinoomi analüüs vastuseks salmonella typhimurium infektsioonile. Mol. Cell 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, A mycobacterium tuberculosis pinnavalk värbab ubikvitiini peremeesorganismi ksenofagia vallandamiseks. Nat. Commun. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubiquitylation of Lipopolysaccharide by RNF213 jooksul bakteriaalne infektsioon. Nature 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubikvitiini ligaasikompleks suunab ksenofaagiat bakteripinna glükaani äratundmise kaudu. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, lüsiini metüülimine kaitseb rakusisest patogeeni ubikvitilatsiooni ja autofagia eest. Sci. Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, E3 ubikvitiini ligaas, mis tunneb baktereid. Cell Host Microbe, 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, Ubikvitiini ligaas Smurf1 toimib mycobacterium tuberculosis'e selektiivses autofagias ja tuberkuloosivastases peremeesorganismis. Cell Host Microbe, 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, LUBACsünteesitud lineaarsed ubikvitiiniahelad piiravad tsütosooli sissetungivaid baktereid, aktiveerides autofagiat ja NF-κB. Nat. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, Ubikvitiini ligaasi parkin vahendab resistentsust intratsellulaarsete patogeenide suhtes. Nature 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com