Cucurbita Pepo L. seemnete etanoolne ekstrakt muudab kroonilise stressiga rottide neuroendokriinset häiret ning põletikumarkerite ja HSP70 ekspressiooni neerupealistes

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Hailah M. Almohaimeed1, Shereen Hamed2, Hanan S. Seleem 3,4, Ashwaq H. Batawi 5, Zuhair M. Mohammedsaleh6, Maha Jameal Balgoon7, Soad S. Ali 8,9, Soad Al Jaouni 9,10 ja Nasra Ayuob11*

Taust: Kõrvitsad(Cucurbita pepo L.) on kirjeldatudantioksüdant,põletikuvastane, väsimusevastane ja antidepressandilaadne toime. Neerupealised on oluline stressile reageeriv organ, mis säilitab stressi ajal homöostaasi.

Eesmärgid:Selle uuringu eesmärk oli hinnata Cucurbitapepo L. (CP) ekstrakti manustamise tõhusust kroonilise ettearvamatu kerge stressi (CUMS) põhjustatud käitumuslike, biokeemiliste ja struktuursete muutuste leevendamisel neerupealises ning uurida selle mõju mehhanismi.

Materjalid ja meetodid:Nelikümmend isast albiinorotti jagati 4 rühma (n=10): kontrollrühmad, CUMS-i, fluoksetiiniga töödeldud ja CP-ga töödeldud rühmad. Muutused käitumises, kortikosterooni tase, põletikueelsed tsütokiinid TNF- ja IL-6 ning oksüdeerija/antioksüdantprofiili hinnati katse lõpus seerumis. Neerupealisi töödeldi histopatoloogiliseks ja immunohistokeemiliseks hindamiseks. Kaspaasi-3 ja Ki67 ja kuumašokivalgu 70 (HSP70) geeniekspressiooni hinnati neerupealistes RT-PCR abil.

Tulemused:CP ekstrakt vähendas ravimata rühmaga võrreldes oluliselt kortikosterooni taset (p < {0}},001),="" liikumatuse="" aega="" (p="">< 0,001)="" ning="" põletikulisi="" ja="" oksüdatiivseid="" muutusi,="" mis="" olid="" seotud="" cums-i="" põhjustatud="" depressiooniga.="" cp="" ekstrakt="" leevendas="" cums-i="" indutseeritud="" neerupealiste="" histopatoloogilisi="" muutusi="" ja="" vähendas="">apoptoos(p < 0.001) ja oluliselt ülesreguleeritudantioksüdanttase seerumis.

Järeldus:Cucurbita pepo L. leevendas tõhusalt kroonilisest stressist põhjustatud käitumuslikke, biokeemilisi ja neerupealiste struktuurseid muutusi peamiselt selle kaudu.antioksüdantja põletikuvastane toime.

Märksõnad: kõrvits, stress, depressioon, kaspaas-3, ki67, Hsp70,apoptoos

Hiina ravimtaimel Cistanche on antioksüdantne funktsioon.

SISSEJUHATUS

Üle 264 miljoni inimese igas vanuses kannatab depressiooni all kogu maailmas (WHO, 2020). Depressioonis inimese sooritusvõime on koolis, tööl ja perekonnas üldiselt kehv. Depressioon võib viia enesetapuni; seega peetakse seda 15- kuni 29-aastaste laste surmapõhjuseks (WHO, 2020). Imetajad võivad stressirohkeid sündmusi üle elada, aktiveerides neile sündmustele vastavad füsioloogilised reaktsioonid. Neerupealised on osa hüpotalamuse-hüpofüüsi-neerupealise koore (HPA) teljest ja sümpaatia-adrenomedullaarsest teljest, mis säilitab stressi ajal homöostaasi (Ulrich-Lai et al., 2006). Teatati, et kokkupuude termilise stressiga põhjustab HSP70 kiiret ekspressiooni neerupealise koores (Huang et al., 2001). Need valgud jagavad rakusisest inimkaubandust, antigeeni esitlust,apoptoosja palju muid toiminguid (Khar et al., 2001). On kirjeldatud, et eksogeensetel hormoonidel või endogeensete hormoonide häiretel võib kriitilistel arenguperioodidel olla püsiv mõju füsioloogilistele ja käitumuslikele radadele, mida reguleerivad hüpotalamuse neuroendokriinsed ahelad (Gore ja Patisaul, 2010). hõlmama integreeriva füsioloogia täielikku laiust; seetõttu on see rohkem kui hormonaalne häire (Waye ja Trudeau, 2011).

Neuroendokriinse regulatsiooni, ainevahetuse ja toitumise/mikrobiota muutusi peetakse põletiku ja depressiooni tekke eelsoodumuse vallandajateks (Huang et al., 2019). Eeldati, et depressioonil – ühel neuropsühhiaatrilistest häiretest – ja põletikul on kahepoolne seos. Kui depressioon soodustab põletikulisi reaktsioone, siis põletik soodustab neuropsühhiaatrilisi häireid, sealhulgas depressiooni (Bauer ja Teixeira, 2019).

Fluoksetiin, klassikaline antidepressant, on üks turul saadaolevatest ravimitest depressiooni raviks. Seda peetakse nüüd esilekerkivaks neuroendokriinsüsteemi kahjustajaks. See fluoksetiini toime on pigem kõrvaltoime kui peamine terapeutiline sihtmärk imetajatele (León-Olea et al., 2014). Seetõttu on vaja ohutumaid antidepressante, millel pole kõrvaltoimeid euroendokriinsele seisundile.

Kõrvitsad(Cucurbita pepo L.) on kogu maailmas kasvatatav majanduslikult oluline liik. Neil on toitumis- ja tervisega seotud eelised, kuna need on rikkad fenoolide, flavonoidide, aminohapete, süsivesikute ja vitamiinide poolest (Wang et al., 2002). Mitmed uuringud näitasid, et kõrvitsatel on ulatuslik bioaktiivsus, näiteks diabeedivastane, vähivastane,antioksüdant, põletikuvastane, väsimusevastane ja antidepressandilaadne toime (Wang et al., 2012; Zhanget al., 2012; Nawirska-Olszańska et al., 2013; Kim Nr et al., 2016).Traditsiooniline meditsiin peamiselt ajurveeda süsteemid ja Hiina meditsiin on kasutanud kõrvitsa erinevaid osi, sealhulgas viljade ja seemnete viljaliha (Perez Gutierrez, 2016). Sweetme Sweet Pumpkin (SSP) ja Cucurbita moschata Duchi antidepressantide efektiivsust testiti varem in vivos uuringus, kasutades sunnitud ujumistesti (FST) indutseeritud depressiooni loommudelit ja võrreldi fluoksetiiniga (Kim Nr et al., 2016). Ühes suhteliselt hiljutises ülevaates tehti kokkuvõte, et antidepressantide, näiteks kõrvitsaseemnete, antidepressantide skoor oli 47 protsenti, tagades selle antidepressandilaadse toime (Lachance ja Ramsey, 2018). Hiljuti toetasid Dotto ja Chacha rohkem loomadel ja kliinilistel katsetel põhinevaid uuringuid, et kinnitada kõrvitsaseemnete leevendavat toimet depressioonile (Dotto ja Chacha, 2020).

Need aruanded julgustasid selle tõhusust testimakõrvitsadkroonilise stressi mõju leevendamisel neerupealistele. Seetõttu viidi see uuring läbi, et hinnata Cucurbita pepo L. (CP) ekstrakti suukaudse manustamise mõju kroonilise ettearvamatu kerge stressi (CUMS) põhjustatud käitumuslikule, biokeemilisele ja neerupealiste struktuurile ning uurida selle mõju mehhanismi.

kõrbetsitanche ekstrakt: oksüdatsioonivastane

MATERJALID JA MEETODID

Kõrvitsa ekstraheerimine ja annustamine

Cucurbita pepo L. (vautšeri näidis: AQJ_95) osteti Saudi Araabias Jeddah' kohalikult turult. Need tuvastati Kuningas Abdulazizi ülikooli herbaariumis, kasutades herbaariumiproove ja KSA taimestikku (Chaudhary, 2001). Voucheri näidised hoiustati herbaariumis. CP tuvastasid autorid ja seda kontrollis KingAbdulazizi ülikooli loodusteaduskonna botaanik.

CP ekstraheerimine viidi läbi vastavalt varasematele uuringutele (Wang et al., 2012). Toores puuviljad koos koorega lõigati viilutajaga ja kuivatati lüofilisaatoriga (FD5508; ilShinBioBase Co., Ltd., Korea) ning seejärel purustati elektrilise lihvimismasinaga. Peene pulbri saamiseks lasti pulber läbi 40-sõela ja hoiti õhukindlas anumas. Kuivatatud pulber (50 g) segati 450 ml 80% etanooliga ja jäeti üheks päevaks 37 kraadi juures loksutisse (JSSI-100T; JS Research Inc., Compact ShakingIncubator., Korea) ning seejärel filtriti. puuvilla ja filterpaberiga teisel päeval. Etanooliekstrakti saamiseks korrati seda ekstraheerimisprotsessi 37 kraadi juures kaks korda.

CP koostisosade identifitseerimine

PE keemilist koostist analüüsiti jälgimisgaaskromatograafiaga GC-TSQ evo 8000 massispektromeetriga (ThermoScientific, Austin, TX, Ameerika Ühendriigid) otsese kapillaarkolonniga TG-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm kile paksusega). Kolonni ahju temperatuur seati algselt 50 kraadini ja seejärel tõsteti 5 kraadi/min 250 kraadini ja hoiti 2 minutit, seejärel tõsteti lõpptemperatuurini 300 kraadi 25 kraadi minutis ja hoiti 2 minutit. Injektori ja MS ülekandeliini temperatuuri hoiti vastavalt 270 ja 260 kraadi juures; heeliumi kasutati kandegaasina konstantsel voolukiirusel 1 ml/min. Lahusti viivitus oli 4 minutit ja 3 µl lahjendatud proovid süstiti automaatselt, kasutades PTV-injektoris splitless-režiimis GC-ga ühendatud Autosampler AS1300. EI massispektrid koguti 70 eVionisatsioonipinge juures vahemikus m/z 50–650 täisskaneerimisrežiimis. Iooniallika temperatuur määrati 250 kraadile. Komponendid tuvastati nende massispektrite võrdlemisel WILEY 09 ja NIST 14 massispektri andmebaaside massispektritega, mida kasutatakse mis tahes ekstrakti tundmatute komponentide keemilise koostise tuvastamiseks ja uurimiseks (Wiley, 2006; Mikaia et al., 2014). Analüüs viidi läbi mittekvalitatiivsel viisil, kasutades Thermo Scientific™ Xcalibur™ 2.2 tarkvara ja kõik väärtused esitati suhtelistes protsentides (Abd El-Kareem et al., 2016).

Eksperimentaalne disain

Selle uuringu kiitis heaks KSA Jeddahis asuva King Abdulazizi ülikooli arstiteaduskonna biomeditsiiniuuringute eetikakomitee (viitenumber {{0}}). Selles uuringus saadi King Fahd MedicalResearch Centerist (KFMRC) nelikümmend isast albiinorotti, kes kaalusid 15{18}}–200 g ja vanuses 2–3 kuud. Enne katse alustamist lasti rottidel 1 nädal laboritingimustega kohaneda. Kontrollrühmaks määrati kümme rotti, kes jäeti CUMS-iga kokku puutumata. Ülejäänud kolmekümnele rotile tehti 4 nädala jooksul CUMS-i protseduur, mis hõlmas erinevat tüüpi stressoreid erinevatel kellaaegadel päeva jooksul, et vältida stressiga harjumist. CUMS-i protseduuri kirjeldati täielikult varasemates töödes (Ayuob et al., 2016; Ali et al., 2017) ja see on näidatud tabelis 1. CUMS-iga kokku puutunud rotid jaotati 3 rühma (n 10). Töötlemata rühm (CUMS) sai 0,03% karboksümetüültselluloosi (CMC-Na) vehiikulit sondiga 2 nädala jooksul. FLU-ga ravitud rühm sai maosondiga FLU-d (Dar Al Dawa Pharmaceuticals Co., Ltd., Amman, Jordaania), farmakoloogiliseks valideerimiseks kasutatud antidepressanti, mis oli lahustatud CMC-Na-s 0,03% ata annuses 20 mg/kg (Li et al. , 2014). CP-ga töödeldud rühm sai destilleeritud vees lahustatud CP ekstrakti annuses 100 mg/kg sondiga 2 nädala jooksul vastavalt Wang et al. (2012).

Käitumismuutuste hindamine

FST viidi läbi 4 nädala pärast, et kinnitada CUMS-i mõju rottidele (Ali et al., 2017). Selle katse ajal pandi iga rott klaasjasse silindrilisse anumasse (kõrgus 20 cm, läbimõõt 14 cm), kus oli 15 cm vett temperatuuril 25 ± 2 kraadi. Rott salvestati 6 minutit videosse, kasutades käitumistarkvara (Noldus InformationTechnology, EthoVision XT®) ja 6 minuti jooksul liikumatult veedetud koguaega mõõtis katserühmade suhtes pime tehnik. Määrati koguaeg sekundites, mille rotid veetsid jäsemeid liigutamata, välja arvatud väike liikumine, mis oli vajalik hiire pinnal hoidmiseks "liikumatusaeg" 6 minuti jooksul.

Biokeemilised tehnikad

24 tundi pärast käitumistesti lõpetamist võeti rottide intraorbitaalsest siinusest vereproovid pärast tuimastamist 4% isofluraaniga (SEDICO PharmaceuticalsCompany, Kairo, Egiptus) 100% hapnikus. Pärast seda eutaniseeriti rotid emakakaela dislokatsiooniga. Vereproove tsentrifuugiti seerumi saamiseks kiirusel 3, 000 pööret minutis 15 minutit 4 kraadi juures ja hoiti –18 kraadi juures biokeemiliseks hindamiseks.

Kortikosterooni taset (ALPCO Diagnostics, Orangeburg, NY, Ameerika Ühendriigid) hinnati ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi komplektide abil vastavalt tootja juhistele. Tootja juhiste kohaselt hinnati TNF- ja IL-6 (Quantakin R&D süsteem, USA komplekt) ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi abil. Iga proovi teooptiline tihedus määrati kahes eksemplaris mikroplaadi ELISA lugejaga, mis oli seatud 450 nm peale.

Tiobarbituurhappega reageerivate ainete (TBARS) analüüsikomplekti (Biodiagnostic; Egiptus) kasutati malondialdehüüdi (MDA) taseme mõõtmiseks spektrofotomeetriliselt 535 nm juures (Gamal et al., 2018). Superoksiidi dismutaasi (SOD) taset mõõdeti SOD analüüsikomplekti (Biodiagnostic; Egiptus) abil (Packer, 2002). Glutatioonperoksidaasi (GPX) taseme hindamine viidi läbi GPX komplekti (Randox Labs, Crumlin, Ühendkuningriik) abil. Katalaasi (CAT) aktiivsuse kvantifitseerimiseks koostati testi ja kõigi proovide jaoks kalibreerimiskõver, kasutades analüüsikomplekte (Biodiagnostic; Egiptus). Meetodit on varem kirjeldatud (Gamal et al., 2018).

kõrbetsitanche ekstrakti eelised: põletikuvastane

Kvantitatiivne reaalajas PCR

RNA ekstraheerimine koeproovidest viidi läbi, kasutades TriFast™ reagenti (PeqLab, Saksamaa, kat. nr.: 30-2010), nagu on kirjeldatud tootja protokollis. Puhastatud RNA kontsentratsioon hinnati NanoDrop 2000 spektrofotomeetriga (Thermo Scientific, Ameerika Ühendriigid). Igast proovist ekstraheeritud RNA pöördtranskribeeriti SensiFAST™ cDNA sünteesikomplektiga RT-qPCR jaoks (Bioline USA Inc., Ameerika Ühendriigid, kat. nr: BIO-65053), järgides tootja juhiseid. Sünteesitud cDNA-d säilitati -80 kraadi juures kuni kasutamiseni qRT-PCR jaoks.

QRT-PCR reaktsioonid viidi läbi, kasutades SensiFAST™ SYBR Lo-ROX komplekti (Bioline USA Inc., Ameerika Ühendriigid, kat. nr: BIO-94002) seadmel Applied Biosystems 7500real. -time PCR tuvastamise süsteem (Life Technology, Ameerika Ühendriigid). Selles uuringus kasutatud geenispetsiifilised praimerid rottidele töötati välja tarkvara Primer3 (v.0.4.0) abil ja nende spetsiifilisust kontrolliti programmi NCBI/Primer-BLAST abil. Seejärel osteti praimerid ettevõttest Willowfort™ (Ühendkuningriik). Praimeriteks olid GAPDH (5′-TGCACCACCACTGCTTAGC-3′, 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′), kaspaas-3 (edasi 5- TGTATG {{10CCTACCTG}, vastupidine 20}}GCGCAAAGTGACTGGATGAACC-3), HSP70 (5′-ACGAGGGTCTCAAGGGCAAG-3′, 5′-CTCTTTCTCAGCCAGCGTGTTAG-3′).

Ki67 (edasi 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA-3, tagurpidi 5-AGAAGAGCCCACAGCACAGAGAA 3). PCR-segu valmistati järgmiselt: 10 µl SensiFASTTM SYBRLo-ROX segu, 0,8 µl päripraimerit, 0,8 µl pöördpraimerit, 2 µl matriitsi cDNA ja 6,4 µl nukleaasivaba vett. Reaktsioonisegu kanti üle termotsüklerisse, mis oli eelnevalt programmeeritud hoidma 95 kraadi juures 2 minutit, millele järgnes 40 tsüklit 95 kraadi juures 15 sekundit ja seejärel 60 kraadi 30 sekundit. Igas katses viidi läbi negatiivne kontrollreaktsioon, mis ei sisaldanud malli.

PCR produktide spetsiifilisuse tõestamiseks viidi läbi sulamiskõvera analüüs ja iga reaktsiooni Ct väärtus saadi amplifikatsioonigraafikutelt. Iga geeniekspressiooni suhteline kvantifitseerimine koeproovides arvutati, kasutades võrdleva läve (ΔΔCt) meetodit, kus sisemise kontrollgeenina oli GAPDH. Üldise voldi muutuse jaoks arvutati ja lineariseeriti aritmeetilise valemiga 2-ΔΔCt.

Histoloogilised tehnikad

Katse lõpus ja pärast rottide tuimastamist avati kõht ja parempoolne neerupealine lõigati välja. Parafiiniplokkide saamiseks fikseeriti neerupealised 10% neutraalses puhverdatud formaliinis ja viidi läbi edasised protsessid. Valmistati 4-μm paksused parafiinilõigud ja värviti hematoksüliini ja eosiiniga (H&E). Veelgi enam, teised parafiini lõigud värviti immunohistokeemiliselt, kasutades streptavidiin-biotiin-peroksidaasi tehnikat. Slaide inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures ja seejärel inkubeeriti neid monoklonaalse anti-Ki67-ga (Dako Cytomation, Ameerika Ühendriigid, lahjendus 1:1, 000), et demonstreerida rakkude proliferatsiooni. Lisaks kasutati polüklonaalset kaspaasivastast-3 antikeha (Santa Cruz Biotechnology, Ameerika Ühendriigid, lahjenduses 1:1,000)apoptoos. Kasutati ka kuumašokivalgu -70 (HSP70) vastast polüklonaalset keha (Dako, Carpinteria, CA, Ameerika Ühendriigid, lahjendus 1:1, 000). Kasutati Dako värvimissüsteemist pärinevat vastavat biotinüülitud konjugeeritud sekundaarset antikeha. Ainult sekundaarse antikehaga värvitud slaide kasutati negatiivsete kontrollidena.

Tuumad värviti hematoksüliiniga. Browntsütoplasmaatilist värvimist peeti positiivseks reaktsiooniks. Värvitud lõike uuriti ja pildistati digikaamera ja arvutiga ühendatud Olympus Microscope BX{{0}} (Olympus) abil. Antikehade immunoreaktiivsuse poolkvantitatiivne analüüs viidi läbi Pro Plus pildianalüüsi tarkvaraga. Immunopositiivse reaktsiooni pindala protsenti hinnati 30 väljal × 400 suurendusel. Positiivsed rakud loendati 1,0 mm2 pindala kohta, nagu on kirjeldanud Zhou et al. (2016). Igalt slaidilt uuriti vähemalt viit välja ja iga looma kohta arvutati keskmine.

Morfomeetrilise analüüsi jaoks uuriti iga looma kohta nelja sektsiooni (suurendus × 100). Neerupealiste erinevate tsoonide paksust mõõdeti mikromeetrites. Neerupealise koore paksus saadi medulla ja neerupealise kapsli vahelise kauguse mõõtmisega sirgjooneliselt, üks mõõtmine tehti igas neerupealise koore kvadrandis.

Statistiline analüüs

Käitumuslikke, biokeemilisi ja immunohistokeemilisi andmeid analüüsiti sotsiaalteaduste statistilise paketi (SPSS) versiooniga 16. Uuringu muutujaid mõjutasid kaks sõltumatut tegurit: kokkupuude stressiga ja ravi. Seetõttu viidi läbi Bonferroni post hoc baasil põhineva segamudeli kahesuunalise ANOVA analüüs. Statistilist olulisust arvestati p <>

kõrbetsitanche eelised: vananemisvastane

TULEMUSED

Käitumuslikud tulemused

Liikumatusaeg FST ajal oli CUMS-i rühmas oluliselt kõrgem (p{0}}.03) kui kontrollrühmas, samas kui see oli oluliselt madalam (p=0.01, p{4}}.001) FLU- ja CP-ga ravitud rühmades kui CUMS-i rühmas (joonis 1A).

CP ekstrakti analüüsi tulemused GC-MS abil

Peamised CP-s tuvastatud ühendid hõlmavad peale paljude teiste ühendite peamiselt oleiinhapet (umbes 56 protsenti), palmitiinhapet (umbes 8,9 protsenti), linoleenhapet 3,5 protsenti ja linoolhapet 2,8 protsenti (tabel 2; joonis 2). CP ühendite hulgas, millel on teatatud põletikuvastast toimet, on oleiinhape, palmitiinhape, linoleenhape, betuliin ja linoolhape, samas kui need, millel onantioksüdantpalmitiinhape, 10-oktadetseenhape ja metüülester.

Biokeemiline hindamine

Kortikosterooni tase seerumis

Kortikosterooni tase tõusis oluliselt (p < {0}},001) ravimata rottidel, kes said CUMS-i, võrreldes kontrollrottidega, samas kui FLU ja CP-ga ravitud rottidel vähenes seerumi kortikosterooni tase oluliselt (p < 0,001). tase võrreldes CUMS-iga kokku puutunud ravimata rottide tasemega (joonis 1B).

TNF- ja IL-6 tase seerumis

Katse lõpus näitas seerumi TNF- ja IL-6 hindamine, et need olid CUMS-i rühmas oluliselt tõusnud (p < 0,001), samas kui need näitasid olulist vähenemist (p< 0.001)="" in="" flu-="" and="" cp-treated="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" rats="" exposed="" to="" cums="" (figures="" 1c,="">

MDA, SOD, GPX ja CAT tasemed seerumis

Täheldati, et seerumi MDA tase oli CUMS-i rühmas oluliselt kõrgem (p < {0}},001)="" kui="" kontrollrottidel,="" samas="" kui="" cp-ga="" ravitud="" rühmades="" oli="" see="" oluliselt="" madalam="" (p="" 0,003).="" kui="" cums-iga="" kokku="" puutunud="" ravimata="" rottidel.="" flu="" manustamine="" ei="" suutnud="" oluliselt="" vähendada="" cums-iga="" kokkupuutunud="" rottide="" mda="" taset="" (joonis="">

Seevastu SOD, GPX ja CAT tasemed CUMS-i rühma seerumis olid oluliselt madalamad (p < {0}}.{10}}01,="" p="">< 0,001,="" p="0" 0,002)="" kui="" kontrollrühma="" seerumis,="" samas="" kui="" nende="" tase="" näitas="" cp-ga="" ravitud="" rühmas="" olulist="" tõusu="" (p="0,01," p="0,003," p="" 0,03)="" võrreldes="" nendega.="" cums-säritusega="" rühmas.="" flu="" manustamine="" ei="" suutnud="" oluliselt="" suurendada="" sod-i,="" gpx-i="" ja="" cat-i="" cums-iga="" kokku="" puutunud="" rottidel="" (joonised="">

Ki67, kaspaasi-3 ja HSP70 geeniekspressioon

RT-PCR näitas ebaoluliselt kõrget Ki67 geeni ekspressiooni (p=0.14) CUMS-i rühma neerupealistes võrreldes kontrollrühmaga, samas kui FLU- ja CP-ga ravitud rühmade ekspressioon oli märkimisväärselt kõrge (p {{6). }}.02, p 0.01) võrreldes CUMS-iga eksponeeritud rühmaga (joonis 3E). Kaspaasi-3 geeniekspressioon oli oluliselt suurenenud (p < 0,001) CUMS-rühma neerupealistes võrreldes kontrollrühmaga, samal ajal kui FLU- ja CP-ga ravitud rühmade oma näitas olulist langust (p=0,03, p=0,04) võrreldes CUMS-iga kokkupuutunud rühmaga (joonis 3F). Kui rääkida HSP70 geeniekspressioonist, registreeris see CUMS-i rühma neerupealistes oluliselt kõrgema taseme (p < 0,001) kui kontrollrühmas, samas kui FLU ja CP-ga ravitud rühmad näitasid ebaolulist langust (p=0,07, p=0,08) võrreldes CUMS-i saanud rühmaga (joonis 3G).

Histopatoloogiline hindamine

Kontrollrottide neerupealistel on terve struktuur säilinud ajukoore arhitektuuriga, sealhulgas zona glomerulosa, zona fasciculata ja zona reticularis, samuti medulla (joonis 4). CUMS-iga eksponeeritud rottide neerupealised näitasid ZG-s, ZF-s ja ZR-s palju rakke, millel oli ilmselge vakuolatsioon ja degenereerunud tuumad ning mõnikord sügavalt määrdunud tuumad mõõduka paksenemisega kapslis ja sidekoetrabeekulites. Paljud ZR rakud tundusid pruunilipofustsiini pigmentidega tumedad. Teisest küljest näitasid CP-ga töödeldud rottide neerupealised ZG-s vähem ilmselgelt vakuoleeritud rakke ja sügavalt värvunud tuumasid ning ZF ja ZR näitasid vähe tumedaid rakke.

Morfomeetrilised mõõtmised näitasid, et ZG ja ZR paksus näitasid pärast CUMS-iga kokkupuudet ebaolulist suurenemist, samas kui need suurenesid oluliselt FLU- korral (p 0.01,p 0.02) ja CP-ga töödeldud rühmad (p=0.02, p=0.001). Mis puutub ZF paksusesse, siis see suurenes märkimisväärselt (p 0, 02) CUMS-iga eksponeeritud rühmas ja see suurenes veelgi, kuid ebaoluliselt, FLU- ja CP-ga ravitud rühmades võrreldes töötlemata CUMS-i rühmaga.

Selleks, et teha kindlaks, kas tsellulaarne hüperplaasia oli piiratud neerupealise teatud alampiirkonnaga, kasutati Ki67 (jaguneva raku marker) immunohistokeemilist märgistust. Ki67-positiivselt prolifereeruvate rakkude arv suurenes oluliselt (p < 0.001)="" zf-is="" pärast="" kokkupuudet="" cums-iga,="" samas="" kui="" ravi="" flu="" ja="" cp-ga="" suurenes="" oluliselt="" võrreldes="" töötlemata="" cums-rühmaga.="" kuigi="" prolifereeruvate="" rakkude="" arv="" oli="" zg-s="" ja="" zr-is="" ebaoluliselt="" suurenenud="" ning="" cums-rühma="" medullas="" vähenes="" oluliselt="" võrreldes="" kontrollrühmaga,="" suurendas="" ravi="" flu="" ja="" cp-ga="" oluliselt="" prolifereeruvate="" rakkude="" arvu="" zg-s="" (p="0.001)." ,="" p="0,003)," zr="" (p="">< 0,001)="" ja="" medulla="" (p="0,004," p="0,003)" võrreldes="" töötlemata="" cums-rühmaga="" (joonised="" 4,="">

Hindamiseks viidi läbi immunohistokeemiline värvimine, kasutades kaspaasi-3apoptoos(Joonis 6). Täheldati, et kaspaasi-3 ekspressiooni pindala protsent suurenes märkimisväärselt (p < 0.001)="" kõigis="" näärme="" tsoonides="" pärast="" kokkupuudet="" cums-iga="" 4="" nädala="" jooksul="" võrdlus="" kontrollrühma="" omaga.="" cp-ga="" ravitud="" rühmas="" vähenes="" oluliselt="" kaspaasi="" -3ekspressioon="" zg="" (p="">< 0,001),="" zf="" (p="">< 0,001)="" ja="" zr="">< 0.001,="" p=""
="" 0.005),="" and="" medulla="" (p="0.004," p="0.001)," in="" comparison="" to="" that="" of="" the="" cums="" group="" (figures="">

HSP70 ekspressiooni pindala protsent suurenes oluliselt (p < 0,001) CUMS-i rühma kõigis ajukoore tsoonides ja ka neerupealise medullas võrreldes kontrollrühma omaga, samas kui see oli ebaoluliselt vähenenud FLU- ja CP-ga ravitud rühmade kõik tsoonid ja medulla võrreldes CUMS-i rühmaga (joonised 5).

Kuivatatud Cistanche tubulosa viilud

ARUTELU

Kaasaegne ühiskond on ilmselgelt täis stressi, mis võib tuleneda igapäevastest probleemidest, tervishoiust ja tööga seotud probleemidest. Need stressorid võivad põhjustada niinimetatud stressiga seotud häireid (Clayton ja McCance, 2014). Selles uuringus kasutati Cucurbita pepo L. viljaliha ja koore etanooliekstrakti, et uurida selle potentsiaali CUMS-i põhjustatud depressiivse käitumise leevendamisel ja selle mõju neerupealistele. Seda tõestas seerumi kortikosterooni taseme märkimisväärne tõus ja seda kinnitas pikaajaline liikumatus FST ajal. Need leiud olid kooskõlas varem teatatud leidudega (Tang et al., 2015).

Teatati, et nii TNF- kui ka IL-6 osalesid depressiooni patogeneesis (Taraz et al., 2015; Pedraz-Petrozziet al., 2020). Teatati, et IL-6 või TNF-retseptorite puudulikkusega hiired on depressiivse käitumise suhtes resistentsed (Viana et al., 2010). Seetõttu hinnati neid selles uuringus ja täheldati, et nii TNF- kui ka IL{ {9}} suurenes märkimisväärselt 4 nädala jooksul CUMS-iga kokku puutunud rottide seerumis, mis näitab, et nad olid depressioonis. Seda leidu toetasid Numakawa jt (2014) käitumise meeleheitega hiirtel ning Taraz jt. (2015) depressiooniga patsientidel.

Selles uuringus seostati kõrvitsaekstrakti manustamist depressiivse käitumise paranemisega, mis ilmnes FST liikumatuse aja olulisest vähenemisest ja mida kinnitas inkortikosterooni ja põletikuliste tsütokiinide TNF- ja IL-6 märkimisväärne vähenemine seerumis. Neid leide toetasid Kim Nr jt. (2016), kes teatas, et SSP 28 päeva jooksul vähendas põletikuliste tsütokiinide taset depressioonis rottidel. Põletikuvastane toimekõrvitsvõib omistada kõrvitsa aktiivsetele ühenditele, nagu oleiin- ja palmitiinhapped ning östradiool.

Oleiinhappe, palmitiinhappe ja linoolhappe alareguleerimist kirjeldati depressiooni korral (Conklin et al., 2010; Martín et al., 2010). Teatati, et oleiinhappe vahendatud neuroprotektsioon on seotud selle põletikuvastase toimega, mida vahendab peroksisoomi proliferaatoriga aktiveeritud gamma-retseptori (PPAR-) aktiveerimine (Song et al., 2019). Lisaks teatati, et palmitiinhape inhibeerib fosfolipaasi A(2) ja seetõttu. peetakse põletikuvastaseks ühendiks (Aparna et al., 2012). Östradiool oli üks selles uuringus tuvastatud kõrvitsa ühenditest. Östradiool kutsus esile põletikuvastase toime ja leevendas seejärel depressiivset käitumist (Xu et al., 2015). Teine mehhanism, mille abil östradiool võib esile kutsuda anantidepressiivse toime, on ajust pärineva neurotroofse faktori (BDNF) ekspressioon ja ERK fosforüülimine ER-i aktiveerimise kaudu ajus (Yang et al., 2010).

Selles uuringus tõusis MDA seerumi tase, samas kui CUMS-i eksponaatides vähenes SOD, GPX ja CAT tase. Sarnased muutused dokumenteeriti pärast kokkupuudet CUMS-iga varasemates uuringutes ja nad lisasid, et need biokeemilised muutused põhjustasid oksüdatiivse stressi ja HPA kahjustuse (Nabavi et al., 2015). Liu T. et al. (2015) teatasid ka, et depressiooni teket võib seostada antioksüdantide vähese sisaldusega kehas. Selle antioksüdantsed omadusedkõrvitspuuviljaekstrakti on sageli teatatud (Bahramsoltani et al., 2017). Lisaks teatati, et Cucurbita pepo L. viljaliha koor töötleb kõrgemat antioksüdantset aktiivsust kui teised osad, näiteks seemned (Oyeleke et al., 2019). Kõrvitsaekstrakti manustamine suurendas paljudes varasemates uuringutes märkimisväärselt SOD- ja GPX-i taset ning vähendas MDA-d hiirte seerumis (Guo-Huaet al., 2000; Dang, 2004) ning see mõju dokumenteeriti ka selles uuringus. Seetõttu onantioksüdantSelles uuringus ilmnenud antidepressandi toime taga võib olla kõrvitsate aktiivsus. See on kooskõlas Kim Nr jt tähelepanekutega. (2016). Teatati, et looduslikud tooted, millel on põletikuvastane,antioksüdant, ja väsimusevastastel toimetel on ka anantidepressandilaadne toime (Jeong et al., 2015). Kõik need varasemad tegevused said tõestust aastalkõrvitsad.

Cistanche on vananemisvastase toimega

Selles uuringus CUMS-i rühmas täheldatud neerupealiste koore rakkude suurenenud tsütoplasmaatiline vakuolatsioon võib olla tingitud kasvavast nõudlusest lipiidide järele, mis moodustavad kortisooli sünteesi nurgakivi. Cigankova jt. (2005) täheldasid, et pikaajaline eksperimentaalne hüperdünaamika viis kortikaalsete rakkude mitmete tsütoplasmaatiliste lipiiditilkade ühinemiseni. Need lipiiditilgad sisaldavad kolesterooli, mis on steroidhormoonide sünteesi peamine eelkäija. Kuid Koldysheva ja Lushnikova (2008) teatasid, et stress põhjustas lipiidide tilkade märkimisväärset vähenemist neerupealise koore rakkudes, eriti ZF-is (Koldysheva ja Lushnikova, 2008). Kirjeldati, et füüsilise stressiga kokkupuutel kanduvad valustiimulid hüpotalamusele, mille tulemuseks on CRH sekretsioon hüpofüüsi portaalsüsteemi, mis suurendab ACTH sekretsiooni ja stimuleerib selle retseptoreid ZF-is ja ZR-is, et suurendada kortisooli sekretsiooni (Patti et al., 2018). Varem teatati CUMS-iga eksponeeritud rottidel täheldatud paksenenud neerupealiste kapslist ja trabeekulitest (El-Desouki et al., 2011; Altayeb ja Salem, 2017) fibroblastide suurenenud kollageeni sünteesi tõttu immobiliseerimisstressiga kokkupuutel.

Paljudel CUMS-iga eksponeeritud rottide neerupealiste rakkudel ilmnesid sügavalt värvunud tuumad, mis näitab, et nad läbisid apoptoosi, mida kinnitas kaspaas-3 immunohistokeemiline värvimine. Sarnasest tähelepanekust teatasid Altayeb ja Salem (2017), kui nad uurisid immobilisatsioonistressi mõju rottide neerupealistele. Liu Q. et al. (2015) teatasid, et liigne oksüdatiivne stress, mis ilmnes pärast kokkupuudet CUMS-iga selles uuringus, muudab "apoptoos-seotud geenid" ning indutseerib raku apoptoosi ja degeneratsiooni Bcl-2, Baxi ja kaspaasi-3 signaaliradade kaudu. Seda mehhanismi kinnitas selles uuringus RT-PCR, mis näitas kaspaas-3 geeni olulist ülesreguleerimist. Kirjanduse ülevaatamisel ei ilmnenud Cucurbita pepo otsest mõju kaspaas-3-vahendatud apoptoosile erinevates kudedes. Näib, et neerupealistes tuvastatud kaspaas-3-positiivsete apoptootiliste rakkude vähenemise põhjuseks onantioksüdantSelles uuringus dokumenteeritud Cucurbita pepo mõju. Seda toetavad paljud varasemad uuringud, mis on läbi viidud teiste märkimisväärse antioksüdantse toimega taimede ja ürtide kohta (Banagozar Mohammadi et al., 2019; Ghazizadeh et al., 2020).

See uuring näitas, et kokkupuude CUMS-iga suurendas Ki67-positiivsete rakkude arvu neerupealise koores, mis ilmnes oluliselt ZF-is, mis viitab prolifereeruvate rakkude arvu suurenemisele, ning selle tulemusena suurenes selle kihi paksus oluliselt. Teisest küljest vähenes Ki67-positiivsete prolifereeruvate rakkude arv CUMS-i toimel oluliselt medullas. Need tähelepanekud olid kooskõlas Ulrich-Lai jt (2006) tähelepanekutega, kes teatasid Ki{{ suurenemisest. 4}}positiivsed rakutuumad ainult välimises ZF-is pärast kokkupuudet kroonilise muutuva stressiga, samal ajal kui themedulla näitas rakkude hüpertroofiat, mitte hüperplaasiat. Peale selle teatasid Laborie jt (2003) medullaarse funktsiooni üldisest suurenemisest pärast kokkupuudet kroonilise stressiga, mis viitab sellele, et krooniline stress võib põhjustada medullaarset hüpertroofiat.Selles uuringus manustatikõrvitsekstrakt suurendas märkimisväärselt rakkude proliferatsiooni, mis ilmneb Ki67 geeni ülesreguleerimisest ja immuunekspressioonist peaaegu kõigis neerupealiste tsoonides ja medullas võrreldes CUMS-iga. See selgitas selles uuringus registreeritud näärmete tsoonide suurenenud paksust. Samuti võib see kompenseerida CUMS-iga kokkupuutest põhjustatud apoptootilist toimet. Seda järeldust toetavad Kim Hy jt. (2016), kes teatasid Ki67 mRNA ekspressiooni olulisest ülesreguleerimisest ja BALB/c hiirte põrnast eraldatud splenotsüütide proliferatsioonist, mida raviti SSP-ga, voogedastusega ja Cucurbita moschataDuchiga ning selle peamise komponendi, karoteeniga.

Käesolevas uuringus suurendas kokkupuude CUMS-iga märkimisväärselt HSP70 geeniekspressiooni ja immuunekspressiooni kõigis neerupealiste tsoonides. Kooskõlas sellega, Zheng et al. (2008) tõestasid ka, et suurenenud HSP70 ekspressioon pärast stressirohket kokkupuudet moduleerib põletikulisi reaktsioone, inhibeerides põletikulise transkriptsioonifaktori, tuumafaktor-kappa B (NF-kappaB) aktivatsiooni. Lisaks võib HSP70 otseselt häirida apoptoosi ja nekroosi (Yenari et al., 2005). Hiljuti ilmus Liet al. (2019) teatasid HSP70 ekspressiooni ülesreguleerimisest sigade neerupealiste koes pärast kuumastressiga kokkupuudet, mis näitab HSP70 rolli neerupealiste vigastuses ja rõhutab selle olulisust põletikuliste reaktsioonide suhtes. HSP70 kiiret indutseerimist vastuseks stressile peetakse raku kaitseprotsessis oluliseks.

Meie uuringus raviti CUMS-iga eksponeeritud rottekõrvitsadseostati HSP70 ekspressiooni ebaolulise vähenemisega, mis oli seotud apoptoosi ja põletikuliste reaktsioonide vähenemisega. See võib viidata nii FLU kui ka CP-i poolt indutseeritud suhteliselt kõrge HSP70 taseme kasulikule mõjule, mille tulemuseks on kaspaasi -3-vahendatud vähenemine.apoptoosja põletikuliste tsütokiinide vabanemine. Kuigi kõrvitsate mõju kuumašoki valgu perekonnale ei olnud varem kirjeldatud, on oleiinhape, mis esindab selle peamist koostisosa.kõrvitsadSelles uuringus kasutatud, kirjeldati HSP60 ekspressiooni allareguleerimist inimese T-lümfotsüütide rakuliinis (Martins De Lima et al., 2004), mis toetab meie uuringutulemusi. Cucurbita pepo kui antidepressanditaolise aine pakutud toimemehhanism on kokku võetud joonisel 7. Selle uuringu piirangute hulka kuulus ka võimetus täiendavalt uurida CP antidepressandi toime mehhanismi ning seetõttu julgustas edasine uuring seda tegema. .

Kokkuvõtteks võib öelda, et see uuring annab teaduspõhiseid tõendeid Cucurbita pepo L. ekstrakti tõhususe kohta CUMS-i põhjustatud käitumuslike ja biokeemiliste muutuste leevendamisel, samuti histopatoloogilist mõju neerupealistele. Need mõjud ilmnesid alareguleerimise kauduapoptoosja HSP70 ekspressiooni ning näis olevat vahendatudantioksüdantja Cucurbita pepoL-i põletikuvastane toime. väljavõte. Kuigi see uuring ja mõned teised hiljutised uuringud on dokumenteerinud Cucurbita pepo antidepressandilaadset toimet ja uurinud selle mehhanismi, on selle toime kinnitamiseks inimestel vaja täiendavaid uuringuid, sealhulgas kliinilisi uuringuid.

Cistanche graanulid